肉蓯蓉中多糖物質(zhì)成分分析及抗氧化活性研究

肖林霞 蘇遠(yuǎn)

摘要：文章通過對肉蓯蓉中多糖物質(zhì)進(jìn)行提取，采用DEAE纖維素柱層析法對肉蓯蓉粗多糖CLP進(jìn)行純化，獲取肉蓯蓉中性糖CLP1和肉蓯蓉酸性糖CLP2。采用紫外光譜掃描的方法測定肉蓯蓉粗多糖CLP、肉蓯蓉中性糖CLP1和肉蓯蓉酸性糖CLP2中的總糖、糖醛酸以及蛋白質(zhì)含量，并對多糖分子量和單糖組成成分進(jìn)行測定，同時(shí)對肉蓯蓉粗多糖CLP、肉蓯蓉中性糖CLP1和肉蓯蓉酸性糖CLP2的DPPH自由基清除能力和總抗氧化能力進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析。測定數(shù)據(jù)表明，肉蓯蓉粗多糖CLP、肉蓯蓉中性糖CLP1和肉蓯蓉酸性糖CLP2的組成成分接近，但含量存在較大的差異；肉蓯蓉中性糖CLP1和肉蓯蓉酸性糖CLP2在利用DEAE纖維素色譜柱進(jìn)行分離純化時(shí)能夠獲取到多個(gè)洗脫峰，分子量分布在0～10 000 Da之間，表明肉蓯蓉多糖主要組成成分為小分子糖。肉蓯蓉中性糖CLP1單糖測定結(jié)果表明，肉蓯蓉中性糖CLP1中含有的單糖主要為甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖以及阿拉伯糖；肉蓯蓉酸性糖CLP2單糖測定結(jié)果表明，肉蓯蓉酸性糖CLP2中含有的單糖主要為鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖以及半乳糖。肉蓯蓉中多糖的DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)和總抗氧化能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，肉蓯蓉中性糖CLP1的抗氧化能力高于肉蓯蓉粗多糖CLP和肉蓯蓉酸性糖CLP2。

關(guān)鍵詞：肉蓯蓉；多糖物質(zhì)；成分分析；抗氧化活性；吸光度

中圖分類號：TS201.23? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ?文章編號：1000-9973（2023）05-0071-04

Abstract： In this paper， polysaccharides are extracted from Cistanche deserticola， Cistanche deserticola crude polysaccharide CLP is purified by DEAE cellulose column chromatography， and neutral sugar CLP1 and acidic sugar CLP2 of Cistanche deserticola are obtained. The content of total sugar， uronic acid and protein in Cistanche deserticola crude polysaccharide CLP， Cistanche deserticola neutral sugar CLP1 and Cistanche deserticola acidic sugar CLP2 is determined by UV spectral scanning， and the molecular weight and monosaccharide composition of polysaccharides are determined. At the same time， the DPPH radical scavenging capacity and total antioxidant capacity of Cistanche deserticola crude polysaccharide CLP， Cistanche deserticola neutral sugar CLP1 and Cistanche deserticola acidic sugar CLP2 are analyzed. The measured data show that the components of Cistanche deserticola crude polysaccharide CLP， Cistanche deserticola neutral sugar CLP1 and Cistanche deserticola acidic sugar CLP2 are similar， but there are great differences in their content. Multiple elution peaks can be obtained when Cistanche deserticola neutral sugar CLP1 and Cistanche deserticola acidic sugar CLP2 are separated and purified by DEAE cellulose chromatographic column， and the molecular weight distribution is 0～10 000 Da， indicating that the main components of Cistanche deserticola polysaccharides are small molecular sugars. The monosaccharide determination results of Cistanche deserticola neutral sugar CLP1 show that the monosaccharides in Cistanche deserticola neutral sugar CLP1 are mainly mannose， galacturonic acid， glucose， galactose and arabinose. The monosaccharide determination results of Cistanche deserticola acidic sugar CLP2 show that the monosaccharides in? Cistanche deserticola acidic sugar CLP2 are mainly rhamnose， galacturonic acid， glucose and galactose. The results?? of DPPH radical scavenging experiment and total antioxidant capacity experiment of polysaccharides from Cistanche deserticola show that the antioxidant capacity of Cistanche deserticola neutral sugar CLP1 is higher than that of Cistanche deserticola crude polysaccharide CLP and Cistanche deserticola acidic sugar CLP2.

Key words： Cistanche deserticola; polysaccharides; component analysis; antioxidant activity; absorbance

肉蓯蓉是一種草本寄生植物，含有大量的酚苷、生物堿、苯乙醇苷、糖以及醇，其中糖類物質(zhì)主要為多糖形式，肉蓯蓉多糖具有較強(qiáng)的免疫活性調(diào)節(jié)功能[1-2]。自由基作為人體生命活動中的中間代謝產(chǎn)物，處于不穩(wěn)定狀態(tài)，且具有較高的氧化活性強(qiáng)度，會造成人體內(nèi)生物大分子物質(zhì)組織器官損傷，因此利用天然抗氧化物質(zhì)清除自由基成為當(dāng)前食品研究的主要方向，肉蓯蓉中的多糖物質(zhì)成分具有較強(qiáng)的抗氧化能力，能夠促進(jìn)人體內(nèi)自由基的清除[3]。

本文以肉蓯蓉為研究對象，對其中的多糖物質(zhì)進(jìn)行提取分類，采用高效凝膠滲透色譜法對肉蓯蓉多糖物質(zhì)分子量進(jìn)行測定，同時(shí)對多糖物質(zhì)成分組成進(jìn)行深入分析，通過測定肉蓯蓉多糖成分的自由基清除能力和總抗氧化能力，對肉蓯蓉的抗氧化活性進(jìn)行分析，為肉蓯蓉的開發(fā)利用和附加價(jià)值提升提供理論依據(jù)。

1 肉蓯蓉樣品制備與多糖物質(zhì)提取

稱取肉蓯蓉2.5 kg，切片后加入12.5 L蒸餾水煮沸3 h，煮沸后過濾收集濾液，加入濃度為75%的乙醇靜置24 h，使用離心機(jī)在4 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心30 min，收集沉淀物，將沉淀物冷凍后干燥處理，得到肉蓯蓉粗多糖CLP[4]。取DEAE纖維素，浸泡溶脹后進(jìn)行脫氣處理，裝入DEAE纖維素陰離子交換色譜柱，采用蒸餾水和NaCl溶液進(jìn)行平衡。稱取100 mg肉蓯蓉粗多糖CLP溶解于10 mL蒸餾水中，蒸餾水洗脫后收集洗脫液并進(jìn)行濃縮冷凍干燥，得到肉蓯蓉中性糖CLP1；NaCl溶液洗脫后收集洗脫液，經(jīng)透析后進(jìn)行濃縮冷凍干燥，得到肉蓯蓉酸性糖CLP2[5]。

將肉蓯蓉中性糖CLP1和肉蓯蓉酸性糖CLP2分別制備成濃度為1 mg/mL的多糖溶液，使用210～600 nm的分光光度計(jì)進(jìn)行紫外光譜掃描，當(dāng)260～280 nm處出現(xiàn)峰值時(shí)，證明溶液中含有蛋白質(zhì)和核酸[6]。

2 肉蓯蓉多糖物質(zhì)成分測定

使用苯酚-硫酸法測定肉蓯蓉樣品中的總糖含量。分別量取濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1 mL置于玻璃試管中，加入蒸餾水定容至1 mL，然后向試管中分別加入濃度為6%的苯酚試劑0.5 mL和濃硫酸2.5 mL，振蕩搖勻后冷卻至室溫。使用分光光度計(jì)在490 nm處測量吸光度，以糖含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算出回歸方程[7-8]。

使用考馬斯亮藍(lán)法測定肉蓯蓉樣品中的蛋白質(zhì)含量。取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和濃度為0.1 mg/mL的樣品溶液1 mL，分別向每個(gè)試管中加入4 mL考馬斯亮藍(lán)溶液，振蕩搖勻后靜置，使用分光光度計(jì)測量495 nm處的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品中的蛋白質(zhì)含量[9]。

使用間羥基聯(lián)苯法測定肉蓯蓉樣品中的糖醛酸含量。取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和濃度為0.1 mg/mL的樣品溶液0.4 mL，向試管中加入2.5 mL濃硫酸，振蕩搖勻后進(jìn)行25 min沸水浴，取出后冷卻至室溫，向試管中加入濃度為0.3%的間羥基聯(lián)苯和濃度為0.5%的氫氧化鈉溶液，振蕩搖勻后放置30 min，使用分光光度計(jì)測量525 nm處的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品中的糖醛酸含量[10-11]。使用高效凝膠色譜儀測定肉蓯蓉多糖相對分子量，使用高效液相色譜儀測定肉蓯蓉單糖組成[12]。

3 肉蓯蓉多糖物質(zhì)成分測定結(jié)果與分析

210～600 nm的光度計(jì)紫外光譜掃描曲線圖見圖1。

由圖1可知，肉蓯蓉中性糖CLP1在280 nm處出現(xiàn)明顯吸收峰，肉蓯蓉酸性糖CLP2在260～280 nm處雖沒有明顯吸收峰，但是紫外吸收譜線較高。由于蛋白質(zhì)中含有的色氨酸和酪氨酸在280 nm條件下對紫外線有較大的吸收值，因此可以判斷肉蓯蓉中性糖CLP1中含有糖蛋白，無法判斷肉蓯蓉酸性糖CLP2中是否含有核酸和蛋白質(zhì)。

DEAE纖維素陰離子交換色譜柱層析能夠?qū)㈦x子型的物質(zhì)和雜質(zhì)吸附于色譜柱上，實(shí)現(xiàn)多糖物質(zhì)的分離，將蒸餾水洗脫液濃縮干燥后，得到肉蓯蓉中性糖CLP1共34.68 mg，使用NaCl溶液洗脫濃縮干燥后，得到肉蓯蓉酸性糖CLP2共16.52 mg。實(shí)驗(yàn)過程中得出肉蓯蓉總糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程以及糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。測量得出肉蓯蓉總糖、蛋白質(zhì)以及糖醛酸含量，見表1。

測定標(biāo)準(zhǔn)樣品分子量和出峰面積，可以得出回歸方程，將待檢測樣品的光射信號值代入回歸方程，可以得出待檢測樣品分子量，進(jìn)一步分析計(jì)算可以得出肉蓯蓉中性糖CLP1和肉蓯蓉酸性糖CLP2數(shù)均分子量、重均分子量以及分散系數(shù)。肉蓯蓉中性糖CLP1和肉蓯蓉酸性糖CLP2高效凝膠滲透色譜圖保留峰測定時(shí)間與分子量計(jì)算結(jié)果見表2。其中數(shù)均分子量用來表示測定分子的大小，重均分子量與數(shù)均分子量的比值用來表示分子分布寬度。

由表2可知，肉蓯蓉中性糖CLP1和肉蓯蓉酸性糖CLP2的分子量分布區(qū)間為0～10 000 Da，由此說明肉蓯蓉中的多糖為分子不同的小分子多糖，分子量呈現(xiàn)出不均一性，由此推斷出肉蓯蓉中性糖CLP1和肉蓯蓉酸性糖CLP2是若干種多糖物質(zhì)組成的混合物。

9種單糖標(biāo)準(zhǔn)樣品和肉蓯蓉中性糖CLP1以及肉蓯蓉酸性糖CLP2的高效液相色譜峰及出峰保留時(shí)間見表3。將出峰時(shí)間進(jìn)行對比，可以得出肉蓯蓉中性糖CLP1中存在明顯的5種單糖，肉蓯蓉酸性糖CLP2中存在明顯的4種單糖。肉蓯蓉中性糖CLP1和肉蓯蓉酸性糖CLP2中單糖占比見表4。

水解后的肉蓯蓉中性糖CLP1單糖含量與肉蓯蓉酸性糖CLP2單糖含量差異較大，其中肉蓯蓉中性糖CLP1中葡萄糖含量高達(dá)88.62%，肉蓯蓉酸性糖CLP2中葡萄糖含量僅為9.99%，肉蓯蓉酸性糖CLP2中的半乳糖醛酸、半乳糖以及鼠李糖含量均超過5%。

4 肉蓯蓉多糖物質(zhì)抗氧化活性分析

在進(jìn)行肉蓯蓉多糖物質(zhì)抗氧化實(shí)驗(yàn)分析時(shí)，將肉蓯蓉多糖配制成濃度為0，0.25，0.5，1.0，2.0，4.0 mg/mL的肉蓯蓉多糖溶液，對溶液的DPPH自由基清除率和總抗氧化能力進(jìn)行測定。肉蓯蓉多糖溶液的DPPH自由基清除率測定過程中，向溶液中加入濃度為2×10-4 mol/L的DPPH共2 mL，混合均勻后，在避光條件下放置15 min，對溶液進(jìn)行離心處理，離心機(jī)轉(zhuǎn)速為4 000 r/min，離心時(shí)間為15 min。使用分光光度計(jì)測定溶液在517 nm波處的吸光值，由此可以得出肉蓯蓉多糖溶液的DPPH自由基清除率[13]，見表5。

由表5可知，肉蓯蓉粗多糖CLP和肉蓯蓉中性糖CLP1對DPPH自由基的清除率明顯高于肉蓯蓉酸性糖CLP2對DPPH自由基的清除率。當(dāng)溶液濃度小于2.0 mg/mL時(shí)，肉蓯蓉粗多糖CLP和肉蓯蓉中性糖CLP1的DPPH自由基清除率隨著濃度的增大而逐漸增強(qiáng)，最后平穩(wěn)。

肉蓯蓉多糖總抗氧化能力測定過程中，使用抗氧化能力檢測試劑盒進(jìn)行快速檢測。取Trolox標(biāo)準(zhǔn)檢測溶液，使用蒸餾水將Trolox標(biāo)準(zhǔn)檢測溶液分別稀釋至0，0.25，0.5，1.0，2.0，4.0 mg/mL，在檢測孔板中加入過氧化物酶工作液，再加入待檢測樣品或標(biāo)準(zhǔn)檢測液，最后加入快速檢測試劑盒工作液，混合均勻后靜置6 min，使用酶標(biāo)儀在405 nm和734 nm波長處進(jìn)行測定，由此得出肉蓯蓉多糖總抗氧化能力[14-15]。肉蓯蓉多糖物質(zhì)溶液的總抗氧化能力測試結(jié)果見表6。

由表6可知，當(dāng)肉蓯蓉溶液濃度小于4.0 mg/mL時(shí)，肉蓯蓉粗多糖CLP、肉蓯蓉中性糖CLP1以及肉蓯蓉酸性糖CLP2的總抗氧化能力隨著溶液濃度的升高而增強(qiáng)；肉蓯蓉中性糖CLP1的抗氧化能力明顯高于肉蓯蓉粗多糖CLP和肉蓯蓉酸性糖CLP2的抗氧化能力。

5 結(jié)論

肉蓯蓉多糖的高效凝膠滲透色譜法分析結(jié)果表明，其中含有的多糖分子量不大于10 000 Da，且含有多個(gè)洗脫峰，肉蓯蓉多糖具有一定的抗氧化性。本文分析研究結(jié)果為肉蓯蓉的深入開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

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