氮氣誘導土沉香結(jié)香及揮發(fā)性成分分析

劉高峰　周再知　黃桂華　趙威威　張青青　宋曉琛

關(guān)鍵詞：土沉香；氮氣；人工誘導；揮發(fā)性成分

中圖分類號：Q949.761.1；R284.1 文獻標識碼：A

沉香，通常指瑞香科（Thymelaeaceae）沉香屬（Aquilaria Lam.）樹種所含樹脂的木材，是傳統(tǒng)名貴藥材和珍稀香料[1]，在醫(yī)藥、香料、化妝品等領(lǐng)域廣泛使用。土沉香[Aquilaria sinensis（Lour.） Spreng.]是我國特有的珍貴藥源樹種[2]，是國產(chǎn)沉香主要植物來源。近年來，由于土沉香自然結(jié)香率低[3]，而沉香市場需求持續(xù)增長，探求安全、有效、穩(wěn)量的人工誘導結(jié)香技術(shù)，及研究其結(jié)香機理成為國內(nèi)外研究的熱點[4]。

目前，人工誘導結(jié)香的方法主要有三大類，即物理法、化學法和生物法，其中前2 種是生產(chǎn)經(jīng)營中常用的誘導方法[5]。物理法主要是在土沉香樹干和枝條上制造創(chuàng)面，例如燒鑿鉆孔、斧頭砍傷、機械打釘?shù)萚6-7]?；瘜W法則是利用無機鹽[8-9]、激素[10]等化學試劑液體輸入的方式誘導樹體結(jié)香。而生物法常采用組織接種或菌液輸入的方式，通過不同種類真菌侵染而促進結(jié)香[11-12]。研究表明，采用化學法、生物法等單一處理時結(jié)香效果欠佳，因此液體輸入法誘導結(jié)香時，常通過幾種試劑組合處理方法來提高結(jié)香質(zhì)量[9， 13]。研究發(fā)現(xiàn)，沉香揮發(fā)性成分香氣濃烈且組成復雜，多采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進行成分分析研究[14]，然而不同結(jié)香方法處理下沉香揮發(fā)性成分存在明顯差異。采用新型誘導方式，如樹干填充氣體誘導土沉香結(jié)香及其揮發(fā)性成分分析均尚無報道。

早期研究表明，一些氣態(tài)物質(zhì)如CO₂、乙烯等在心材的形成過程中發(fā)揮著重要的作用[15]。NILSSON 等[16]研究顯示，樹干填充氮氣能誘導樟子松（Pinus sylvestris）形成不同于邊材的變色木材。劉小金[17]研究發(fā)現(xiàn)，N₂ 樹干填充使檀香（Santalum album）形成的心材面積最大。鑒于以上研究，為了探明氮氣誘導土沉香結(jié)香的效果，以10 年生土沉香為材料，采用樹干填充高壓氮氣方式進行誘導，檢測醇溶性物質(zhì)含量及對揮發(fā)物成分進行分析，以期為人工誘導土沉香結(jié)香提供新技術(shù)及新理論。

1 材料與方法

1.1 材料

在廣東省惠州市惠城區(qū)三棟鎮(zhèn)土沉香人工種植基地內(nèi)，選用生長健康、長勢均勻的10 年生土沉香樹[ 平均胸徑（12.94±0.52）cm ， 平均樹高（5.41±0.68）m]為研究材料，進行人工誘導結(jié)香處理。高壓氮氣純度為99.90%。

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計 采用隨機區(qū)組試驗設(shè)計，設(shè)置4 個處理，分別為樹干打孔后每隔7 d 和15 d 填充1 次氣體（分別以N₇和N₁₅表示），只打孔不充氣（CK₁）和無任何處理（CK₂）。每個小區(qū)處理5 株，重復4 次，試驗共計80 株。

1.2.2 樹干填氣方法 先將高壓瓶中的氮氣氣體減壓至0.1 MPa，再經(jīng)橡膠管充入樹孔內(nèi)。用流量計計量注入氣體的體積，每次以30 mL/min 速度充氣50 s，共充入氣體25 cm³。選擇晴天進行樹干充氣，按試驗設(shè)計方案，持續(xù)處理3 個月。

1.2.3 測定方法 （1）木芯變色范圍測定。充氣處理后10 個月時，沿樹干縱向方向，分別在充氣孔上、下方1 cm 處每隔2 cm 鉆取木芯，黑色結(jié)香區(qū)以外，依次間隔3 cm 鉆取木芯，直到木芯全為白木。在樹干橫截面方向上，分別在充氣孔左右1 cm 處，每隔2 cm 鉆取木芯，直到木芯全為白木。將木芯黑色區(qū)域稱作沉香區(qū)，將含有部分黑色油線的淺褐色區(qū)域稱作過渡區(qū)，分別測量縱向、橫向變色長度。

（2）提取液制備。分別在處理結(jié)束后7 個月和10 個月時取樣。取樣時分別在N₇、N₁₅和CK1打孔上方5 cm 處截取5 cm 厚半圓片，除去白木部分，將木芯黑色不腐爛的區(qū)域稱作沉香區(qū)，將含有部分黑色油線的淺褐色區(qū)域稱作過渡區(qū)。分別將2 個區(qū)的樣品置于40 ℃恒溫干燥箱烘至恒重，粉碎后過40 目篩；對CK₂則是在樹干40 cm處截取5 cm 厚半圓片，烘干粉粹過篩。

稱取木粉2.00 g 置于離心管中，加入95%乙醇20 mL，在水浴中超聲處理30 min，取上清液，加入乙醇，重復上述操作。匯總2 次上清液，過0.45 μm 濾膜，定容至50 mL。

（3）醇溶性提取物含量測定。參照2020 年版《中國藥典》[18]，采用乙醇超聲波浸提法測定。

（4）沉香四醇含量測定。采用超高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜儀（Sciex 4000， SCIEX，USA; Sciex 4000 Qtrap， USA）測定。

色譜條件：色譜柱Kinetex C18（2.1 mm×100 mm， 2.6 μm）；流動相水，含0.1 %甲酸（A）-乙腈（B）；梯度洗脫0～1 min，10% B；1～3.5 min，10%～70% B；3.5～4 min，70%～95% B；4～5.9 min，95% B；5.9～6 min，10% B；6～8 min，10% B。柱溫40 ℃，流速0.3 mL/min，進樣量1 μL。

質(zhì)譜條件： 離子化方式為電噴霧離子化（ESI），多反應監(jiān)測離子掃描模式（MRM）測定。主要質(zhì)譜參數(shù)為：脫溶劑溫度為550 ℃，氣簾氣為25 μL/min，負離子模式下毛細管電壓為5500 V，噴霧氣為55 psi，輔助加熱氣為55 psi。

沉香四醇標準品購自GLPBIO 公司，純度大于98%。將沉香四醇標準品用質(zhì)譜95%乙醇不同梯度稀釋后檢測并繪制出標準曲線，然后取上述處理的沉香區(qū)提取液進行測定，并計算沉香四醇含量。

（5）揮發(fā)性成分測定。取處理后10 個月1.2.3（1）中沉香區(qū)的提取液，在華南農(nóng)業(yè)大學測試中心進行GC-MS 檢測分析（美國，安捷倫7890B-5977A）。

色譜條件：色譜柱HP-5MSZ（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升溫程序：起始溫度70 ℃，保持1 min后，以10 ℃/min 升至150 ℃，保持5 min；再以5 ℃/min 升至200 ℃，保持5 min；然后以8 ℃/min升至280 ℃，保持1 min。進樣口溫度250 ℃；載氣為高純He（99.999%），載氣流量1.0 mL/min，進樣量0.2 μL（不分流），溶劑延遲4 min。

質(zhì)譜條件：色譜-質(zhì)譜接口溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；電離方式EI；電子能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍35～350 amu。

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過GCMS7890B-5977A 化學工作站積分器自動積分后，采用峰面積歸一化法計算各化合物相對百分含量， 將所得化合物質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過NIST14 質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索。采用Excel 軟件進行數(shù)據(jù)處理，運用SPSS 19.0 和Origin 2021 軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)香范圍

2.1.1 表觀變化 7 d 處理1 次（N7）、15 d 處理1 次（N₁₅）和只打孔處理（CK₁）后，樹干充氣孔周圍逐漸變色，并向四周擴散，顏色加深，而后變淺、直至白木。結(jié)香區(qū)和白木層之間存在明顯界限。氮氣處理下的變色范圍明顯大于CK₁，且N7 處理的變色面比N₁₅處理的更大。CK₁ 僅在打孔附近有變色發(fā)生，擴展狹小而緩慢。無任何處理（CK₂）健康的土沉香則無任何顏色變化?？梢?，不同處理的土沉香結(jié)香區(qū)域顏色和范圍均不同（圖1）。

2.1.2 縱向變色長度和橫向變色寬度 氮氣處理加速了土沉香木質(zhì)部縱向、橫向變色。從圖2A可看出，處理后10 個月時，N7 和N15 處理的沉香區(qū)縱向變色長度差異不顯著，但均顯著高于CK₁。N₇處理的沉香區(qū)、縱向變色總長度均高于N₁₅ 和CK₁，分別達10.64、28.24 cm，分別是CK₁的4.38倍、3.35 倍。不同處理的縱向變色長度均高于橫向變色寬度。橫向變色寬度上（圖2B），N₇處理的充氣孔左、右1 cm 處均檢測到黑色結(jié)香區(qū)，而N₁₅和CK₁處理均未發(fā)現(xiàn)。N₇處理的橫向變色總寬度達3.52 cm，分別比N₁₅和CK₁提高18.53%和43.09%，由此可見高頻次（7 d 處理1 次）填充氮氣比低頻次（15 d 處理1 次）處理誘導變色效果更好。

2.2 醇溶性提取物含量

樹干填充氮氣可顯著提高土沉香的沉香區(qū)和過渡區(qū)中醇溶性提取物的含量。處理后7 個月時，N₇處理的沉香區(qū)和過渡區(qū)的醇溶性提取物含量均明顯高于其他處理，其中沉香區(qū)的醇溶性提取物含量為17.87%，分別比N₁₅、CK₁提高14.04%和28.47%；過渡區(qū)的醇溶性提取物含量為9.73%，分別比N₁₅、CK₁提高38.21%和82.21%。此外N₁₅處理的沉香區(qū)和過渡區(qū)的醇溶性提取物含量分別比CK₁提高12.65%和31.84%（圖3）。

從圖3 可以看出，沉香區(qū)的醇溶性提取物含量隨誘導時間的延長而逐漸增加，處理后10 個月時， N₇ 處理的沉香區(qū)醇溶性提取物含量達19.17%，比處理后7 個月的含量提高8.39%，且顯著高于N₁₅、CK₁ 和CK₂處理；處理后10個月時，過渡區(qū)醇溶性物質(zhì)含量均有所下降，其中N₇比處理后7 個月時含量下降20.86%，但仍明顯高于CK₁，比CK₁高95.11%。

2.3 沉香四醇含量

如圖4 所示，除空白對照（CK₂）未檢測到沉香四醇外，樹干填充氮氣（N₇、N₁₅）和打孔對照（CK₁）均促進結(jié)香區(qū)沉香四醇的合成，且充氣處理效果更好。處理后7 個月時N₇、N₁₅沉香四醇含量顯著高于CK₁，分別是CK₁的2.23 倍、1.52倍。處理后10 個月時充氣處理和CK₁結(jié)香區(qū)沉香四醇含量均高于處理后7 個月時的含量。N₇處理的沉香四醇含量最高，達0.30%，比N₁₅高42.86%，是CK₁的2.14 倍。N₁₅ 處理的沉香四醇含量也明顯高于CK₁，比CK₁高51.49%，差異顯著。CK₁處理后10 個月時的沉香四醇含量為0.14%，高于《中國藥典》規(guī)定標準。

2.4 揮發(fā)性成分分析

處理后10 個月時，充氣處理（N₇、N₁₅）和打孔對照（CK₁）結(jié)香區(qū)以及無任何處理（CK₂）樣品的乙醇提取物總離子流圖（TIC）見圖5。由圖5 可見，氮氣處理的TIC 色譜圖較為復雜，表明化合物種類較多。而CK₂的化合物種類最少。N₇處理的最大吸收峰為6，7-二甲氧基-2-（2-苯乙基）色酮（相似度96%），N₁₅處理的最大吸收峰為6-芐氧基-3，4-二氫-4，4-二甲基香豆素（相似度81%），CK₁ 則為2-（2-苯乙基）色酮（相似度97%），CK₂樣品不含倍半萜和色酮類物質(zhì)，但油酸酰胺（相似度94%）相對含量最高。

從處理后10 個月時的結(jié)香區(qū)樣品中共鑒定出55 種化合物種類（表1）。這些化合物包括30種萜烯類化合物、6 種色酮類化合物、2 種甾醇化合物以及17 種芳香族、烷烴類、脂肪酸類等其他化合物。30 種萜類物質(zhì)為7 種單萜、22 種倍半萜和1 種三萜類化合物。色酮類化合物中，主要有2 種類型。一種是5、6、7、8 位無取代基的色酮，主要為2-（2-苯乙基）色酮、6，7-二甲氧基-（2-苯乙基）色酮；另外一種是5、6、7、8 位有取代基的色酮，主要為6-甲氧基-2-（2-苯乙基）色酮、6，7-二甲氧基-（2-苯乙基）色酮、2，5-二甲基-7-羥基色酮、6，7-二甲氧基-2-[2-（4-甲氧基苯乙基）]色酮。

從N₇處理的結(jié)香區(qū)樣品中檢測到5 種單萜類（無環(huán)1 種、單環(huán)2 種、雙環(huán)2 種）、19 種倍半萜類（單環(huán)4 種、雙環(huán)7 種、三環(huán)8 種）和1 種三萜類物質(zhì)。倍半萜類物質(zhì)種類最豐富，包括沒藥烷萜類環(huán)氧化紅沒藥烯、蛇麻烷類蛇麻烯、欖香烷類欖香烯等單環(huán)倍半萜，菖蒲烷萜類白菖烯、檀香烷萜類檀香烯、愈創(chuàng)烷萜類藍桉醇、石竹烷萜類石竹烯等雙環(huán)倍半萜，畢澄茄烷萜類香木蘭烷、香樹烯及其衍生物，花側(cè)柏烷萜類柏木烯等三環(huán)倍半萜等。不同處理樣品中的萜烯類化合物的相對含量差異較大（表1）。N₇ 處理的倍半萜和萜烯類種類和相對含量均明顯高于N₁₅和CK₁，其中倍半萜類化合物的總相對含量占總萜烯類的84.48%，萜烯類相對含量達49.61%。N₁₅處理中，檢測到16 種萜烯化合物，包括3 種單萜、12 種倍半萜和1 種三萜，其中倍半萜占總檢測物質(zhì)的11.87%。在N₇和N₁₅處理中均檢測到角鯊烯（三萜類），但CK₁中未檢測到。

各處理結(jié)香區(qū)樣品中的色酮類物質(zhì)種類和相對含量也存有明顯差異。N₇處理中檢測到5 種色酮類物質(zhì)，5、6、7、8 位有取代基的色酮含量占總色酮含量的92.18%，其中6，7-二甲氧基-2-（2-苯乙基）色酮占總色酮的47.99%；而N₁₅處理中只檢測到4 種色酮，其中5、6、7、8 位有取代基的色酮含量占總色酮的77.91%。CK₁處理中也檢測到5 種色酮類化合物，其中5、6、7、8 位有取代基的色酮含量占總色酮相對含量的55.98%，但5、6、7、8 位無取代基的2-（2-苯乙基）色酮相對含量最高，占總色酮含量的38.18%。在CK₂樣品中，主要成分以脂肪酸類為主，未檢測到萜烯類和色酮類化合物。

3 討論

3.1 氮氣對沉香醇溶性物質(zhì)和沉香四醇含量的影響

不同誘導方法所產(chǎn)沉香的揮發(fā)性成分不同，質(zhì)量也不同且不穩(wěn)定[19]。林峰等[20]比較了打釘法、砍傷法、鑿洞法3 種物理方法以及化學方法誘導土沉香的結(jié)香效果，發(fā)現(xiàn)3 種物理法處理2 a后的醇溶性物質(zhì)含量分別為9.7%、18.0% 和29.0%。本研究中，每隔7 d 填充1 次氮氣，處理后10 個月時沉香區(qū)醇溶性提取物含量為19.37%，高于2020 版《中國藥典》的要求，也高于上述2種物理方法，但低于化學誘導方法，這可能與檢測時間較短有關(guān)。此外，氮氣處理可以顯著誘導土沉香中沉香四醇的合成，其含量遠遠高于《中國藥典》的標準，進一步說明高壓填充氮氣可顯著誘導土沉香次生代謝物質(zhì)的合成，從而明顯促進土沉香結(jié)香。

3.2 氮氣對沉香揮發(fā)性成分的影響

通常認為，天然沉香中的倍半萜類成分種類較多、含量較高，而人工誘導的沉香則是2-（2-苯乙基）色酮類化合物的種類和含量較高[21]。不同誘導方法所產(chǎn)沉香往往因油脂含量、比重、顏色和氣味的不同，其質(zhì)量也有差異[22]。此外，也受誘導方式及結(jié)香年限等多種因素的影響[23]。YAN等[24]研究發(fā)現(xiàn)，斧傷誘導法所結(jié)沉香的倍半萜類化合物占主導地位，而生物和化學誘導法所結(jié)沉香中2-（2-苯乙基）色酮占60%以上。本研究中N₇處理后10 個月時所結(jié)沉香中，富含倍半萜、萜烯類和色酮類化合物。倍半萜類化合物總相對含量達41.93%，占總萜烯的84.52%。相比化學和生物誘導方法[25]，氮氣處理誘導結(jié)香的質(zhì)量更接近斧傷誘導方法，這可能是由于頻繁填充氮氣對土沉香木質(zhì)部產(chǎn)生高壓脅迫，一方面造成高強度的物理損傷，另一方面氮氣參與生理代謝過程，從而激發(fā)萜烯類次生代謝物質(zhì)的合成。有關(guān)樹干填充高壓氮氣誘導土沉香的結(jié)香機理，待進一步深入研究。

本研究中，發(fā)現(xiàn)N₇和CK₁處理的樣品中，盡管均檢測到富含5 種色酮類化合物，但N₇處理的5、6、7、8 位有取代基的色酮相對含量高于CK₁，而CK₁中，僅5、6、7、8 位無取代基的2-（2-苯乙基）色酮相對含量最高。相比之下，氮氣誘導下，所產(chǎn)色酮類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)更復雜。由于NIST 和WILEY 質(zhì)譜庫中化合物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)有限，尤其是色酮類物質(zhì)，可能導致GC-MS 方法檢測到的色酮類成分不全面[24]。目前利用紫外分光光度法[25]、高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC-MS）等方法均可進行沉香特征性成分的檢測[26]，但不同方法之間檢測出的物質(zhì)也有差異。YANG 等[27]采用高效液相色譜-電噴霧電離質(zhì)譜法對沉香中2-（2-苯乙基）色酮衍生物進行鑒定，通過質(zhì)譜特征裂解區(qū)分四氫色酮、雙環(huán)氧色酮、單環(huán)氧色酮和flidersia 類型色酮等4 類色酮。隨著檢測方法的提升，沉香中更多的物質(zhì)成分會被檢測出來。因此， 采用GC-MS 和HPLC-MS 雙重方法鑒定沉香的主要化合物成分及相對含量，更有利于全面了解結(jié)香效果。