‘海大2號(hào)’菠蘿蜜莖尖組培褐變過(guò)程中酚類(lèi)物質(zhì)及相關(guān)酶活性的影響

丁燕　郭佳慧　范紫云　向星星　干雨露　閔天雨　楊廷　豐鋒　葉春海

關(guān)鍵詞：菠蘿蜜；組織培養(yǎng)；褐化；抗褐化劑

中圖分類(lèi)號(hào)：S667.8 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

菠蘿蜜（Artocarpus heterophyllus Lam.），屬于?？颇静ぬ}屬的熱帶果樹(shù)，常綠喬木，是一種集食用、藥用、木本糧食于一身的多用途經(jīng)濟(jì)樹(shù)種[1]，因果實(shí)甜美而受到歡迎，市場(chǎng)前景廣闊。大量研究表明，菠蘿蜜的葉、莖、種子和果肉具有較高的藥用、食用價(jià)值[2]。

目前，菠蘿蜜的繁殖方式主要有實(shí)生繁殖、嫁接繁殖和組織培養(yǎng)[3]。由于實(shí)生繁殖后代易發(fā)生性狀分離而難以保存木本優(yōu)良性狀等問(wèn)題，導(dǎo)致果實(shí)品味和品質(zhì)發(fā)生較大改變[4]。目前生產(chǎn)上主要采取嫁接繁殖的方法，此方法可以保存母本優(yōu)良性狀。但因菠蘿蜜存在流膠較多的特性，嫁接時(shí)創(chuàng)面極易被膠污染，成活率受到嚴(yán)重影響[5]。

組織培養(yǎng)可加快植物的繁殖速度，在短期內(nèi)獲得大量遺傳性一致的種苗，并使其保持母本優(yōu)良的性狀，更有利于新品種的選育[10]，目前在香蕉、桉樹(shù)、蝴蝶蘭等植物上得到廣泛應(yīng)用。前人曾利用菠蘿蜜嫩莖等外植體通過(guò)組織培養(yǎng)獲得試管苗[7-9]。但利用成年菠蘿蜜樹(shù)莖尖來(lái)進(jìn)行繁殖尚無(wú)報(bào)道。1960年，MOREL[10]就利用大花穗蘭的莖尖成功誘導(dǎo)分化出植株。利用此技術(shù)于‘海大2 號(hào)組培快繁中發(fā)現(xiàn)，菠蘿蜜組織培養(yǎng)過(guò)程中褐化嚴(yán)重，導(dǎo)致其難以建立無(wú)性繁殖體系，產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)難以實(shí)現(xiàn)。

周亞輝等[11]研究認(rèn)為，組培褐化機(jī)制可分為酶促褐變和非酶促褐變2 種，菠蘿蜜外植體的褐變主要是酶促褐變，在氧化酶催化下酚類(lèi)物質(zhì)形成褐色的醌類(lèi)及其聚合物稱(chēng)為酶促褐變。牛佳佳等[12]研究認(rèn)為，醌類(lèi)化合物的產(chǎn)生會(huì)使得外植體的傷口處變深褐色，這些褐色物質(zhì)產(chǎn)生后會(huì)慢慢滲透到培養(yǎng)基中，來(lái)達(dá)到抑制其他酶活性產(chǎn)生這一目的，植株在吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)時(shí)受到阻止，導(dǎo)致外植體褐變而死亡，植株的生長(zhǎng)受到影響。

菠蘿蜜組織培養(yǎng)快繁全過(guò)程的理論和技術(shù)已基本成熟，然而在實(shí)際生產(chǎn)上卻難于重復(fù)和推廣[13]。為盡早實(shí)現(xiàn)菠蘿蜜的工廠化繁殖，為獲得大量?jī)?yōu)質(zhì)苗木而奠定基礎(chǔ)，本研究以菠蘿蜜莖尖為材料，探究經(jīng)過(guò)不同低溫（4 ℃）處理后及不同濃度PVP 對(duì)外植體褐化的影響，并測(cè)定各處理下莖尖PPO 活性、酚類(lèi)物質(zhì)含量，以此更深入地了解菠蘿蜜組織培養(yǎng)褐化的因素，探究褐化的機(jī)理。旨在促進(jìn)菠蘿蜜組培快繁技術(shù)體系的建立，以期為構(gòu)建菠蘿蜜種苗繁育技術(shù)體系及其產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)示范提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究試驗(yàn)材料‘海大2 號(hào)菠蘿蜜外植體來(lái)自廣東海洋大學(xué)后山園林基地，選取長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)壯，無(wú)病蟲(chóng)害的植株，在晴天早晨進(jìn)行采摘。實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基采用1/2 MS 培養(yǎng)基，NAA 0.1 mg/L，蔗糖30 g/L，瓊脂5.5～6.0 g/L，pH 5.8，培養(yǎng)溫度（24±1） ℃，光照強(qiáng)度2000 Lx，光照10 h/d。實(shí)驗(yàn)中所用藥劑均來(lái)自麥克林公司及廣州試劑廠。

經(jīng)過(guò)表面滅菌處理后，將外植體依次接種至滅菌培養(yǎng)基中，每個(gè)處理接種30 瓶，每瓶接種1個(gè)頂芽，3 次重復(fù)。15 d 后統(tǒng)計(jì)菠蘿蜜外植體的污染率和褐化率。低溫（4 ℃）處理時(shí)間分別設(shè)定為12、24、48 h，15 d 后分別統(tǒng)計(jì)其褐化率及萌芽率，并測(cè)定其PPO 活性及酚類(lèi)物質(zhì)含量[6， 14]。

外植體經(jīng)過(guò)12～24 h 的低溫處理后將接入不同濃度的PVP（聚乙烯吡咯烷酮）培養(yǎng)基中，15 d后分別統(tǒng)計(jì)其褐化率及萌芽率，并測(cè)定其PPO 活性及酚類(lèi)物質(zhì)含量。

1.2 方法

外植體底部褐色色塊超過(guò)0.1～0.5 cm 均為褐化（圖1）。采用以下誘導(dǎo)評(píng)價(jià)公式計(jì)算萌芽率及褐化率。

萌芽率=誘導(dǎo)出腋芽的瓶數(shù)/同批次接種的外植體瓶數(shù)×100%

褐化率=褐化的外植體數(shù)/同批次接種的外植體瓶數(shù)×100%

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2007 軟件對(duì)重復(fù)樣的平均值與標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行計(jì)算，采用DPS 7.05軟件和Duncans 分析法對(duì)不同指標(biāo)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同低溫預(yù)處理時(shí)間對(duì)菠蘿蜜莖尖組培褐化的影響

如表1 所示，未進(jìn)行低溫處理的外植體，褐化率高達(dá)58.89%，萌芽率為38.89%。隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，其褐化率顯著降低。低溫處理12 h，外植體的褐化率為46.67%，與其他處理相比，差異顯著。低溫處理24 h，萌芽率最高，達(dá)到57.78%，與對(duì)照組相比，差異顯著。結(jié)果表明，采集后的菠蘿蜜外植體經(jīng)過(guò)一定的低溫預(yù)處理后，對(duì)其褐化率及萌芽率影響顯著（圖2）。

2.2 不同PVP濃度對(duì)菠蘿蜜莖尖組培褐化的影響

如表2 所示，PVP 的添加對(duì)菠蘿蜜外植體褐化及萌芽率的影響顯著。PVP 濃度為2.0 g/L 時(shí)，褐化率最低，萌芽率最高，分別為15.56%和66.67%，與對(duì)照組相比，褐化率降低了41.11%，萌芽率升高了30.00%，差異顯著。結(jié)果表明，PVP對(duì)菠蘿蜜外植體的褐化能夠起到抑制作用，且在濃度為2.0 g/L 時(shí)，效果最佳。具體生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖3，驗(yàn)證效果見(jiàn)圖4。

2.3 不同低溫預(yù)處理時(shí)間對(duì)‘海大2 號(hào)菠蘿蜜莖尖PPO 活性、總酚及總黃酮含量的影響

2.3.1 PPO 活性 如圖5A 所示，‘海大2 號(hào)菠蘿蜜莖尖在經(jīng)過(guò)低溫處理后，體內(nèi)PPO 的活性并未出現(xiàn)下降的趨勢(shì)，各處理組均高于對(duì)照，且隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，體內(nèi)PPO 活性隨之增加，在低溫處理48 h 時(shí)，PPO 活性達(dá)到最高值，為229.07 U/（gmin），且各處理與對(duì)照組相比，差異顯著。

2.3.2 總酚含量 如圖5B 所示，‘海大2 號(hào)菠蘿蜜莖尖在經(jīng)過(guò)低溫處理后，與對(duì)照組相比，呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)。低溫處理12 h 和24 h，其體內(nèi)的總酚含量與對(duì)照組相比有下降的趨勢(shì)，且在低溫處理12 h 時(shí)達(dá)到最低值，為35.47 mg/g，與對(duì)照組相比下降了13.56%。在低溫處理48 h后，莖尖的總酚含量高于對(duì)照組。

2.3.3 總黃酮含量 如圖5C 所示，菠蘿蜜莖尖在經(jīng)過(guò)低溫處理后，外植體體內(nèi)黃酮的含量均呈現(xiàn)不同程度的降低，與對(duì)照組相比差異顯著。在低溫處理24 h 后，菠蘿蜜外植體體內(nèi)的總黃酮含量最低，為40.04 mg/g，與對(duì)照組相比下降37.25 mg/g。低溫處理12 h 和48 h 后，外植體總黃酮含量與對(duì)照組相比分別降低21.62%和8.72%。

2.4 不同PVP 濃度對(duì)‘海大2 號(hào)菠蘿蜜莖尖PPO 活性、總酚及總黃酮含量的影響

2.4.1 PPO 活性 如圖6A 所示，培養(yǎng)基中添加PVP 后，菠蘿蜜外植體內(nèi)PPO 活性與對(duì)照組相比，差異顯著，當(dāng)添加濃度為2.0 g/L 時(shí)，PPO 活性最低，為82.67 U/（gmin），與對(duì)照組相比降低了318.66 U/（gmin）。其他處理組與對(duì)照組相比，PPO活性均有不同程度的降低，且與對(duì)照組相比分別降低了185.06、70.66 U/（gmin）。

2.4.2 總酚含量 如圖6B 所示，當(dāng)添加濃度為1.0 g/L 時(shí)，總酚含量與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異。添加的PVP 濃度為2.0 g/L 時(shí)，菠蘿蜜莖尖總酚含量最低，為28.46 mg/g，與對(duì)照組相比降低了25.90 mg/g，差異顯著。添加的PVP 濃度為3.0 g/L時(shí)，與對(duì)照組相比總酚含量下降了11.79 mg/g。

2.4.3 總黃酮含量 如圖6C 所示，PVP 添加后，外植體的總黃酮含量顯著降低。PVP 濃度為1.0 g/L時(shí)，外植體的總黃酮含量與對(duì)照組相比降低了19.21 mg/g。PVP 濃度為2.0 g/L 時(shí)，菠蘿蜜外植體總黃酮含量達(dá)到最低值，為17.21 mg/g。PVP 濃度為3.0 g/L 時(shí)，外植體的總黃酮含量與對(duì)照組相比降低了33.06 mg/g。各處理組與對(duì)照組相比，差異顯著。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

菠蘿蜜莖尖組織培養(yǎng)中，經(jīng)過(guò)低溫處理后能夠有效地降低褐化。前人研究發(fā)現(xiàn)，外植體在高溫培養(yǎng)下，褐變加劇，而降低培養(yǎng)溫度后發(fā)現(xiàn)，褐化得到明顯的改善，這與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致[15-16]。喻娜[17]研究認(rèn)為，低溫組培下的外植體有利于降低褐化，劉蘭英[15]在核桃組織培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，低溫下進(jìn)行組織培養(yǎng)可降低褐化，羅麗華[16]在板栗愈傷組織培養(yǎng)中研究發(fā)現(xiàn)，低溫處理可減輕外植體褐化的現(xiàn)象。在本研究中，菠蘿蜜外植體進(jìn)行一定時(shí)間的低溫預(yù)處理后，與對(duì)照組相比，外植體體內(nèi)的總酚及總黃酮含量顯著降低，試驗(yàn)結(jié)果與前人研究結(jié)果一致，即適當(dāng)?shù)牡蜏靥幚碛欣谕庵搀w褐化率的降低。

PVP 添加后，發(fā)現(xiàn)不同濃度的PVP 均能降低外植體的褐化，這與劉英[18]研究結(jié)果一致。目前普遍認(rèn)為，外植體的褐化與多酚氧化酶（PPO）對(duì)酚的作用有關(guān)，乜蘭春等[19]研究認(rèn)為PPO 是酚類(lèi)催化反應(yīng)的關(guān)鍵酶，因?yàn)榉訒?huì)氧化形成醌[20]，醌會(huì)導(dǎo)致外植體的褐化，目前很多學(xué)者認(rèn)為這是導(dǎo)致褐化的主要原因，但不是唯一的原因，眾多學(xué)者一直就這方面進(jìn)行研究與探討，但目前還未得到一致結(jié)論。酚酸、類(lèi)黃酮和單寧是酚類(lèi)物質(zhì)結(jié)構(gòu)的三大類(lèi)化合物，這三大類(lèi)化合物在褐變過(guò)程中充當(dāng)著重要的角色[21]。印芳[22]研究認(rèn)為，蝴蝶蘭的褐化與酚酸類(lèi)物質(zhì)有關(guān)，劉紅[23]研究結(jié)果表明，各處理下的外植體總酚含量與褐化程度呈正相關(guān)，即褐化越重，總酚含量越高，本研究也得到了同樣結(jié)果。

前人研究表明，辣椒和葡萄的褐化可用硝酸銀緩解[24-25]，焦金鳳[26]認(rèn)為，合適的抗褐化劑物質(zhì)有利于降低植物組織培養(yǎng)過(guò)程中出現(xiàn)的褐化問(wèn)題，植物組培養(yǎng)中常用的抗褐化劑根據(jù)其作用機(jī)理可分為兩大類(lèi)型：（1）防止酚氧化的抗氧化劑，如，VC、Na₂S₂O₃、CA 等；（2）用來(lái)吸附醌類(lèi)物質(zhì)的吸附劑，如AC、PVP 等。本研究結(jié)果表明，添加PVP 2.0 g/L 時(shí)用菠蘿蜜組織培養(yǎng)抗褐化的效果最好，這可能是因?yàn)橥环N褐化劑的不同濃度起到的抗褐化效果不一樣[26]，張俊林等[27]在核桃組培中，JAIN 等[28]在歐洲李組織培養(yǎng)中研究發(fā)現(xiàn)，抑制植物組培褐化效果最好的抗褐化劑是PVP，本試驗(yàn)在添加2.0 g/L PVP 時(shí)，對(duì)抑制菠蘿蜜莖尖褐化起到了較好的效果。張小紅等[29]在對(duì)核桃進(jìn)行組織培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，Na₂S₂O₃抑制植物組培褐化效果最好。劉霞等[30]研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加AC 對(duì)烏龍子根芽眼組織培養(yǎng)的效果最好，由此可見(jiàn)，不同植物的外植體、取材時(shí)間、部位等均會(huì)影響抗褐化劑的效果[26]。本研究結(jié)果表明，酚類(lèi)物質(zhì)的含量與褐變程度呈正比，這與許傳俊等[31]在蝴蝶蘭的研究中、毛沛琪[6]在牡丹等的研究中結(jié)果一致。此外，前人研究表明，降低酚類(lèi)物質(zhì)即可降低褐化[32-33]，本研究結(jié)果也反映出了這一現(xiàn)象。

3.2 結(jié)論

本研究以‘ 海大2 號(hào)菠蘿蜜莖尖為試驗(yàn)材料，分析了低溫預(yù)處理后菠蘿蜜的莖尖及不同濃度PVP 對(duì)菠蘿蜜莖尖PPO 活性、總酚及總黃酮含量的影響，研究結(jié)果表明：在低溫處理12 h，菠蘿蜜外植體總酚含量最低，低溫處理24 h，外植體總黃酮含量最低。莖尖經(jīng)過(guò)12～24 h 低溫處理后再接入添加2.0 g/L PVP 的1/2 MS 培養(yǎng)基中，這一濃度下菠蘿蜜外植體的褐化率最低且萌芽率最高，且驗(yàn)證結(jié)果表明，此方法有利于菠蘿蜜莖尖的增殖。

本試驗(yàn)對(duì)菠蘿蜜外植體組培過(guò)程中褐化的抑制進(jìn)行了研究，初步探索了菠蘿蜜外植體在組培過(guò)程中影響褐化的一些外部因素，且對(duì)部分影響較大的因素如總酚、總黃酮及多酚氧化酶進(jìn)行了指標(biāo)的測(cè)定，菠蘿蜜褐變的研究是一項(xiàng)長(zhǎng)期而又艱巨的任務(wù)，菠蘿蜜組織培養(yǎng)技術(shù)還不夠成熟，其增殖及生根體系等有待進(jìn)一步研究，希望今后可以進(jìn)行深入的研究，加大對(duì)醌類(lèi)物質(zhì)的鑒定分析。