響應(yīng)面法優(yōu)化產(chǎn)黃青霉的培養(yǎng)條件

關(guān)舒怡 田晶

摘要 產(chǎn)黃青霉是一種遍布于土壤、腐爛物質(zhì)等基物中的真菌，可產(chǎn)生酶類、青霉素及有機(jī)酸等物質(zhì)，是工業(yè)上用于發(fā)酵生產(chǎn)青霉素的重要絲狀真菌。產(chǎn)黃青霉的菌落生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量有一定的特點(diǎn)，在一定程度上受到外界培養(yǎng)條件的影響。為篩選出產(chǎn)黃青霉菌的最佳培養(yǎng)條件，本試驗(yàn)以產(chǎn)黃青霉為研究對(duì)象，研究培養(yǎng)溫度、光周期、培養(yǎng)基初始pH對(duì)產(chǎn)黃青霉培養(yǎng)的影響，以菌落直徑和產(chǎn)孢量為指標(biāo)，通過單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)產(chǎn)黃青霉的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化處理。結(jié)果表明，在溫度24.1 ℃、pH 7.0、光周期24 L處理時(shí)產(chǎn)黃青霉菌落直徑最大，產(chǎn)孢量也最大，最適合產(chǎn)黃青霉菌生長(zhǎng)，并通過試驗(yàn)驗(yàn)證該條件為最佳培養(yǎng)條件。

關(guān)鍵詞 產(chǎn)黃青霉；響應(yīng)面法；產(chǎn)孢量；培養(yǎng)條件

中圖分類號(hào) TQ465.1? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 1007-7731（2023）06-0039-05

產(chǎn)黃青霉屬無性型真菌，是一種屬于半知菌亞門絲孢綱絲孢目從梗孢科青霉屬的真菌，可以分泌多種胞外酶來分解底物，也可以產(chǎn)生真菌毒素，是工業(yè)上重要的真菌之一，也是一種遍布于土壤、空氣及腐爛的有機(jī)物質(zhì)等基物中的真菌[1-2]。產(chǎn)黃青霉是工業(yè)上β-內(nèi)酰胺類抗生素的來源菌株。實(shí)際生活中，伴隨著人們對(duì)青霉素的需求不斷增加，產(chǎn)黃青霉菌株的培養(yǎng)可為大量獲得青霉素提供物質(zhì)基礎(chǔ)。為此，本試驗(yàn)通過單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化得出最適合產(chǎn)黃青霉的培養(yǎng)條件，為產(chǎn)黃青霉的擴(kuò)大培養(yǎng)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種。供試菌株：產(chǎn)黃青霉，試管斜面保存于4 ℃的冰箱中。使用時(shí)取出活化，接種于SDAY培養(yǎng)基上，置于25 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)菌絲生長(zhǎng)到培養(yǎng)皿2/3時(shí)，方可使用。

1.1.2 培養(yǎng)基。SDAY培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，酵母粉2.0 g，葡萄糖40.0 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1.0 L。

1.1.3 試驗(yàn)器材。PHS-3CpH測(cè)試儀（上海啟前電子科技有限公司）；SPX-250生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；BXM-30R高壓蒸汽鍋（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司設(shè)備廠）；RXZ-280A人工氣候箱（寧波江南儀器廠）；BSA224S電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；M1-L213B微波爐（廣東美的廚房電器制造有限公司）；SMART生物顯微鏡（重慶奧特光學(xué)儀器有限公司）；HH0-C1112B超凈工作臺(tái)（上海智城分析儀器制造有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 產(chǎn)黃青霉的活化處理。配制SDAY培養(yǎng)基，分裝滅菌后，挑取單菌落轉(zhuǎn)接入裝有SDAY培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿，在恒溫25 ℃下培養(yǎng)7～10 d，備用。

1.2.2 產(chǎn)黃青霉的接種。產(chǎn)黃青霉接種操作在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行，首先進(jìn)行紫外消毒30 min，點(diǎn)燃酒精燈，用酒精對(duì)手、器皿進(jìn)行消毒，在酒精燈附近進(jìn)行倒平板。取菌絲生長(zhǎng)達(dá)到培養(yǎng)皿2/3的SDAY培養(yǎng)基，在菌落中心至邊緣1/2處，用6 mm的打孔器制出數(shù)塊已產(chǎn)孢的菌餅。無菌條件下，用接種針將菌餅挑于平板培養(yǎng)基表面中心位置，用封口膜封住平板，并將平板倒置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 產(chǎn)黃青霉產(chǎn)孢量的測(cè)定。將每代菌株培養(yǎng)7 d后，在菌落中心至邊緣1/2處，用6 mm的打孔器制出2塊已產(chǎn)孢的菌餅，將其放入20 mL含0.05%吐溫80的無菌水中，用玻璃棒攪拌3 min將其混勻，后用4層紗布過濾，最后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)算產(chǎn)孢量[3-5]。計(jì)算公式如下：

產(chǎn)孢量=N/80×4×106

式中：N表示顯微鏡下80個(gè)小格觀察到的實(shí)際孢子數(shù)。

1.3 單因素試驗(yàn)

1.3.1 溫度對(duì)產(chǎn)黃青霉培養(yǎng)的影響。將產(chǎn)黃青霉接種于SDAY培養(yǎng)基中，選擇培養(yǎng)溫度為15、20、25、30、35 ℃，調(diào)節(jié)初始pH值為7.0，光周期為12 L/12 D，3次重復(fù)，分別在不同的培養(yǎng)溫度條件下培養(yǎng)7 d，測(cè)定產(chǎn)黃青霉菌落直徑和產(chǎn)孢量。

1.3.2 初始pH對(duì)產(chǎn)黃青霉培養(yǎng)的影響。配制初始pH分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的培養(yǎng)基，按上述方法分別接種到不同培養(yǎng)基中，在溫度為25 ℃、光周期為12 L/12 D的條件下培養(yǎng)7 d，3次重復(fù)。測(cè)定產(chǎn)黃青霉的菌落直徑和產(chǎn)孢量。

1.3.3 光周期對(duì)產(chǎn)黃青霉培養(yǎng)的影響。按照上述方法進(jìn)行接種，在溫度為25 ℃、初始培養(yǎng)基pH為7條件下，使用人工氣候箱控制光周期分別為24 D、6 L/18 D、12 L/12 D、18 L/6 D、24 L，光照強(qiáng)度設(shè)置為4 000 lx，培養(yǎng)7 d后，測(cè)定產(chǎn)黃青霉菌落直徑和產(chǎn)孢量。3次重復(fù)。

1.4 響應(yīng)面Box-Behnken Design設(shè)計(jì)優(yōu)化產(chǎn)黃青霉的培養(yǎng)條件

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，對(duì)產(chǎn)黃青霉的培養(yǎng)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，運(yùn)用 Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以單因素試驗(yàn)確定的培養(yǎng)溫度、初始pH、光周期為主要考察因子，分別用A、B、C表示，并以-1、0、1分別代表自變量的高、中、低水平[6-8]。

1.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

利用Design-Expert 10.0軟件分析得到產(chǎn)黃青霉的最佳培養(yǎng)條件，在該條件下重復(fù)3次試驗(yàn)，驗(yàn)證得到的培養(yǎng)條件是否為最佳方案。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)黃青霉培養(yǎng)單因素試驗(yàn)的結(jié)果與分析

2.1.1 溫度對(duì)產(chǎn)黃青霉生長(zhǎng)的影響。如表1所示，培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)黃青霉生長(zhǎng)的影響起著關(guān)鍵的作用，產(chǎn)孢量總體較高。15～25 ℃時(shí)，隨著溫度的升高，菌落生長(zhǎng)速率和產(chǎn)孢量逐漸增加；溫度為25 ℃時(shí)，產(chǎn)孢量最高，之后隨著溫度的不斷升高，產(chǎn)孢量開始下降；35 ℃時(shí)，菌落生長(zhǎng)速度大幅降低。因此，當(dāng)培養(yǎng)溫度在20～30 ℃時(shí)，為產(chǎn)黃青霉的最適培養(yǎng)溫度。

2.1.2 培養(yǎng)基初始pH對(duì)產(chǎn)黃青霉生長(zhǎng)的影響。如表2所示，培養(yǎng)基初始酸堿度的不同會(huì)對(duì)產(chǎn)黃青霉的生長(zhǎng)有一定的影響，但對(duì)產(chǎn)黃青霉生長(zhǎng)的整體影響不大。從數(shù)據(jù)可分析得出：產(chǎn)黃青霉菌在pH為5～9的范圍內(nèi)都可以生長(zhǎng)，當(dāng)培養(yǎng)基初始pH在5～7時(shí)，產(chǎn)黃青霉生長(zhǎng)的菌落直徑和產(chǎn)孢量隨著酸性的降低而增加；當(dāng)培養(yǎng)基初始pH在7～9時(shí)，產(chǎn)黃青霉生長(zhǎng)的菌落直徑和產(chǎn)孢量隨著培養(yǎng)基堿性的增加而減少。當(dāng)培養(yǎng)基初始pH=7時(shí)，產(chǎn)黃青霉菌落直徑達(dá)到最大5.33 cm，產(chǎn)孢量達(dá)到峰值為8.17×107 cfu·mL-1。綜上所述，產(chǎn)黃青霉菌生長(zhǎng)的最佳培養(yǎng)基初始pH為7。

2.1.3 光周期對(duì)產(chǎn)黃青霉生長(zhǎng)的影響。如表3所示，產(chǎn)黃青霉菌在不同光周期培養(yǎng)的條件下，菌落的直徑及產(chǎn)孢量有一定的差異。在光照時(shí)間為24 D～24 L時(shí)，產(chǎn)黃青霉菌落直徑和產(chǎn)孢量隨著光照時(shí)間的增加而增大。在光周期為24 L條件，即全光照處理時(shí)，產(chǎn)黃青霉菌落直徑達(dá)到最大為5.70 cm，產(chǎn)孢量達(dá)到最多為7.64×107 cfu·mL-1?？梢姡?dāng)光周期為24 L時(shí)，最適合產(chǎn)黃青霉生長(zhǎng)。

2.2 產(chǎn)黃青霉培養(yǎng)條件響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與方差分析。根據(jù)上述對(duì)培養(yǎng)溫度、初始pH、光周期單因素試驗(yàn)的結(jié)果，進(jìn)行Box-Behnken Design設(shè)計(jì)三因素三水平表，具體因素和水平見表4。

試驗(yàn)通過響應(yīng)面軟件的Box-Behnken得出試驗(yàn)方案，根據(jù)前期單因素試驗(yàn)結(jié)果，以產(chǎn)黃青霉產(chǎn)孢量為響應(yīng)值，選取A（培養(yǎng)溫度）、B（初始pH）、C（光周期）3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化處理，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及產(chǎn)孢量結(jié)果見表5。

使用Design-Expert 10.0中的Analysis分析表5，得出產(chǎn)黃青霉的不同培養(yǎng)條件和產(chǎn)孢量之間的回歸方程：產(chǎn)孢量Y=6.36-0.44A-0.12B+1.58C+0.09AB+0.15AC+0.15BC-0.80A2-0.63B2+0.71C2（式中：A、B、C分別為培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基初始pH和光周期）。

依照上述擬合回歸方程，應(yīng)用響應(yīng)面軟件對(duì)產(chǎn)黃青霉培養(yǎng)條件進(jìn)行方差和顯著性分析。由Box-Behnken Design結(jié)果（表6）分析得出，回歸方程P值為0.005 4，小于0.01，差異極顯著，且失擬項(xiàng)（Lack of Fit）的P值為0.298 7，明顯大于0.05，差異不顯著，說明用該方程預(yù)測(cè)試驗(yàn)中培養(yǎng)溫度、初始pH、光周期這3個(gè)影響因子與產(chǎn)黃青霉產(chǎn)孢量的關(guān)系時(shí)合理；由F值的大小可以推斷出3個(gè)因子對(duì)產(chǎn)黃青霉產(chǎn)孢量的影響大小，C>A>B（52.87>4.15>0.30），即光周期對(duì)產(chǎn)孢量的影響最大。模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.914 2，校正決定系數(shù)Radj2=0.803 8，則通過試驗(yàn)建立的模型可以表示80.38%的響應(yīng)值變化。

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析。圖1～3是由試驗(yàn)響應(yīng)值（產(chǎn)黃青霉產(chǎn)孢量）與培養(yǎng)溫度、初始pH、光周期三者中任意2個(gè)因素所形成的等高線圖和響應(yīng)面曲面圖，直觀顯示出各個(gè)因子交互作用情況下響應(yīng)面的3D 和等值線分析圖，可以體現(xiàn)培養(yǎng)溫度、初始pH和光周期3個(gè)條件下，控制任意一個(gè)因子不變時(shí)，產(chǎn)黃青霉產(chǎn)孢量隨著其他2個(gè)影響因子的變化情況。如圖1～3所示，產(chǎn)黃青霉產(chǎn)孢量與培養(yǎng)溫度（A）與初始pH（B）呈開口向下的拋物線關(guān)系，產(chǎn)黃青霉產(chǎn)孢量與培養(yǎng)溫度（A）與光周期（C）、初始pH（B）與光周期（C）呈斜曲面的關(guān)系，通過響應(yīng)面分析結(jié)果，結(jié)合光周期為24 L（全光照）情況分析可以得出：在該試驗(yàn)培養(yǎng)溫度、初始pH、光周期3個(gè)因素所選取的取值范圍內(nèi)，存在最佳點(diǎn)能使產(chǎn)黃青霉產(chǎn)孢量達(dá)到最大值。由圖1中分析可以明顯看出，當(dāng)光周期不變時(shí)，在培養(yǎng)溫度為25 ℃，初始pH為7之前，培養(yǎng)溫度初始pH的不斷增加，產(chǎn)黃青霉產(chǎn)孢量逐漸增加，但當(dāng)達(dá)到最大值后，開始逐漸減小。從響應(yīng)面曲面圖的坡度以及 Box-Behnken Design結(jié)果分析可得，光周期C對(duì)產(chǎn)黃青霉產(chǎn)孢量的影響比A、B更大；A對(duì)產(chǎn)黃青霉產(chǎn)孢量的影響比B大。

2.3 最佳培養(yǎng)條件及驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果分析

由響應(yīng)面軟件分析得出上述結(jié)果后，再通過numerical選項(xiàng)預(yù)測(cè)該試驗(yàn)結(jié)果的最大值，可以得到產(chǎn)黃青霉的最佳培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度24.088 ℃，初始pH 7.015，光周期24 L，此時(shí)產(chǎn)黃青霉的產(chǎn)孢量為8.682 cfu·mL-1。充分考慮到試驗(yàn)條件和實(shí)際操作的可能性，將產(chǎn)黃青霉的最佳培養(yǎng)條件調(diào)整為：培養(yǎng)溫度24.1 ℃，初始pH7.0，光周期24 L，進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得出產(chǎn)黃青霉的產(chǎn)孢量為8.27×107 cfu·mL-1。該值與預(yù)測(cè)值較接近，相對(duì)誤差值為4.98%，說明該模型擬合程度高，具有實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以菌落直徑和產(chǎn)孢量為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過采用響應(yīng)面Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)方法，得到產(chǎn)黃青霉的產(chǎn)孢量與溫度、光周期以及初始pH的回歸方程。試驗(yàn)結(jié)果表明，產(chǎn)黃青霉菌最優(yōu)的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度24.1 ℃，初始pH7.0，光周期24 L時(shí)，此條件下產(chǎn)黃青霉的產(chǎn)孢量為8.27×107 cfu·mL-1。

4 參考文獻(xiàn)

[1] 王順，王培紅，張楠，等.青霉素生產(chǎn)菌——產(chǎn)黃青霉的蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展[J].生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2015，32（6）：1354-1358.

[2] 袁洪水，李術(shù)娜，朱寶成，等.產(chǎn)黃青霉發(fā)酵過程中菌體量測(cè)定的研究[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007（2）：83-86.

[3] 代超凡，李蘭蘭，旭日花，等.響應(yīng)面法優(yōu)化乳酸菌產(chǎn)抗真菌物質(zhì)的培養(yǎng)條件[J].畜牧與飼料科學(xué)，2020，41（5）：1-7.

[4] 時(shí)玉華.關(guān)于血球計(jì)數(shù)板使用的教學(xué)探討[J].中學(xué)教學(xué)參考，2011（32）：123-124.

[5] 嚴(yán)凌斌，張祝蘭，陳洲琴，等.響應(yīng)面法優(yōu)化毒三素鏈霉菌FIM-17-16產(chǎn)Lipstatin發(fā)酵培養(yǎng)基[J].生物技術(shù)，2021，31（1）：82-88.

[6] 潘冬梅，楊傳倫，張心青，等.BBD-響應(yīng)面法優(yōu)化綠色木霉產(chǎn)膠霉菌素培養(yǎng)條件[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2020，36（3）：111-116.

[7] 黃章嬈，王昱，崔沛杰，等.響應(yīng)面法優(yōu)化富鋅酵母培養(yǎng)條件[J].中國(guó)釀造，2020，39（11）：97-102.

[8] 郭兆斌，陳立業(yè)，馬國(guó)源，等.響應(yīng)面法優(yōu)化牛肝腸加工配方[J].食品與發(fā)酵科技，2019，55（1）：24-29.

（責(zé)編：張宏民）

基金項(xiàng)目 山西省高等學(xué)?？萍紕?chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（2021L566）。

作者簡(jiǎn)介 關(guān)舒怡（1999—），女，山西運(yùn)城人。研究方向：生物學(xué)。