窖泥中放線菌的分離鑒定及生理特性研究

黃書琴，鄭若欣，江科，丁俊，朱海，任志強(qiáng)，3*

（1.四川輕化工大學(xué)釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川宜賓 644000；2.四川國檢檢測有限責(zé)任公司，四川瀘州 646000；3.中國輕工業(yè)釀酒生物技術(shù)及智能制造重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川宜賓 644000）

濃香型白酒的釀造以窖泥為基礎(chǔ)，窖泥中的微生物起關(guān)鍵作用，不同年齡和不同地理區(qū)域的微生物群落有著十分明顯的差異，某些微生物種群是白酒特有揮發(fā)性化合物的活躍群體[1-2]。放線菌作為釀酒工業(yè)生產(chǎn)中的四大微生物之一，在白酒釀造中扮演著極為重要的角色[3]。目前,在傳統(tǒng)白酒行業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域,有關(guān)放線菌的研究主要集中在白酒發(fā)酵過程中大曲、曲房、酒醅、以及窖池中放線菌的分離鑒定[4，19]，也有少量文獻(xiàn)[4-6，18]對與白酒釀造有關(guān)的放線菌代謝物質(zhì)和發(fā)酵特性進(jìn)行了研究報(bào)道。由于放線菌不是釀造中的優(yōu)勢菌群，且作用機(jī)理尚不清楚，因此與細(xì)菌、酵母菌、霉菌在傳統(tǒng)白酒釀造中相比，對放線菌的研究報(bào)道相對較少。目前，少量研究顯示放線菌不僅積極參與土壤中有機(jī)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，還會產(chǎn)生許多活性酶類如淀粉酶，纖維素酶等，以促進(jìn)高分子化合物降解，被降解的物質(zhì)在酵母菌和細(xì)菌的作用下產(chǎn)生乙醇、乙酸、乙酸乙酯等，同時(shí)還會水解蛋白質(zhì)生成氨基酸，為己酸菌的生長提供前體物質(zhì)[7]。因此，本研究從濃香型白酒窖泥中分離放線菌株，對目的菌株進(jìn)行多相分類鑒定及部分生理代謝特性研究。該研究不僅能增加窖泥中有關(guān)放線菌研究領(lǐng)域的內(nèi)容，還能探究放線菌在窖池中的性能以及在白酒釀造中如何發(fā)揮作用，為更好地研究混菌發(fā)酵提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑

1.1.1 樣品

取自川西某酒廠的濃香型窖泥，取窖底的窖泥，采用5 點(diǎn)取樣法，取出后分裝并抽真空密封，冰袋送回，4 ℃保存，及時(shí)處理。

1.1.2 試劑

可溶性淀粉、磷酸氫二鉀、七水硫酸亞鐵、重鉻酸鉀，成都市新都區(qū)木蘭鎮(zhèn)工業(yè)開發(fā)區(qū)；硝酸鉀、七水硫酸鎂、氯化鈉、瓊脂粉，成都市科龍化工試劑廠；胰蛋白胨、酵母提取物，北京雙旋微生物培養(yǎng)基制造廠；魯戈氏碘液，50 mg/L K2Cr2O7溶液，75 mg/L K2Cr22O7溶液，1 mg/mL 青霉素溶液，2 mg/mL 青霉素溶液，3 mg/mL 青霉素溶液，18 mg/mL 的制霉菌素溶液，50 倍TAE 緩沖溶液，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1 %的瓊脂糖溶液。

1.1.3 培養(yǎng)基

高氏一號固體培養(yǎng)基[8]：可溶性淀粉20.0 g、KNO31.0 g、K2HPO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、Na‐Cl 0.5 g、FeSO4·7H4O 0.01 g、蒸餾水1000 mL、瓊脂粉20.0 g、pH 7.4～7.6，121 ℃、0.1 MPa 下滅菌20 min。LB 培養(yǎng)基[9]：酵母提取物5.0 g、胰蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g、瓊脂粉20.0 g（固體添加）、蒸餾水1000 mL、pH 7.2～7.4，121 ℃、0.1 MPa 下滅菌20 min。水瓊脂培養(yǎng)基：瓊脂粉20.0 g，蒸餾水1000 mL，自然pH 值，121℃、0.1 MPa 下滅菌15 min。淀粉水解培養(yǎng)基[10]：淀粉2.0 g、牛肉膏2.0 g、蛋白胨17.5 g、瓊脂粉17.0 g、蒸餾水1000 mL、pH7.0，121 ℃、0.1 MPa下滅菌20 min。

1.1.4 儀器設(shè)備

超凈工作臺JJ-CJ-2FD，蘇州凈化設(shè)備廠；電熱恒溫干燥箱labserv-LS-0610，上海一恒科儀器有限公司；電鏡掃描儀DM3000，德國徠卡儀器有限公司；恒溫震蕩培養(yǎng)箱ZWYR-D2403，上海智城分析儀器有限公司；生化培養(yǎng)箱LS-1201，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；凝膠成像儀Chemi‐DocXPS+，美 國BIO-RAD公司；PCR 儀C1000 Touch，美國BIO-RAD 公司；電泳儀164-5070，美國BIO-RAD 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 放線菌株的分離純化

本試驗(yàn)采用稀釋涂布平板法并用以下幾種預(yù)處理方式[11]對窖泥樣品進(jìn)行放線菌的分離。

（a）干熱處理：準(zhǔn)確稱取10 g 窖泥樣品于錐形瓶中后封口，120 ℃干熱處理1 h，取出加入90 mL無菌水，28 ℃、180 r/min 振蕩搖勻3 h 備用。

（b）濕熱處理：水浴鍋內(nèi)65 ℃處理30 min，其余操作同（a）。

（c）無特殊處理：其余操作同（a）。

抑制劑濃度：制霉素溶液記為（A）；50 mg/mL重鉻酸鉀記為（B1）；75 mg/mL 重鉻酸鉀記為（B2）；青霉素溶液記為（C1）1 mg/mL、（C2）2 mg/mL、（C3）3 mg/mL，抑制劑均在無菌條件下添加到培養(yǎng)基中。

1.2.2 放線菌株的鑒定及生理特性

1.2.2.1 單菌落形態(tài)學(xué)特征觀察

將分離得到的放線菌菌株點(diǎn)種在高氏一號固體培養(yǎng)基平板上，28 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d，觀察菌落形態(tài)；進(jìn)一步無菌操作制片，采用顯微鏡觀察放線菌的個(gè)體形態(tài)。

1.2.2.2 放線菌株的生理生化試驗(yàn)

（1）生長曲線的測定。挑取放線菌單菌落接種于10 mL 高氏一號液態(tài)培養(yǎng)基，28 ℃、120 r/min 震蕩培養(yǎng)72 h，該培養(yǎng)液作為測定生長曲線的種子液。以1 %的接種量將種子液接種于裝有150 mL高氏一號液態(tài)培養(yǎng)基的500 mL 三角瓶中，置于28 ℃、120 r/min 震蕩培養(yǎng)，每隔6 h 取樣檢測菌體生長狀況，每株放線菌接種27 瓶，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣3 瓶。菌體生長狀況采用菌體干重法進(jìn)行表示，具體操作為：將濾紙烘干稱重初始質(zhì)量m1，將每瓶混合均勻后取100 mL 菌液過濾，烘干后稱重結(jié)束質(zhì)量m2，100 mL 菌液中所包含的菌體質(zhì)量為m2-m1。

（2）最適溫度測定。將放線菌種子液以體積分?jǐn)?shù)2%的接種量接入已滅菌的50 mL 高氏一號液體培養(yǎng)基中，設(shè)置培養(yǎng)溫度20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃，每組溫度設(shè)置3 個(gè)平行，于120 r/min，恒溫培養(yǎng)3 d。以干重法表示菌體生長狀況。

（3）最適pH 測定。用10 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)高氏一號液體培養(yǎng)基pH 值至5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，每組pH 值設(shè)置3 個(gè)平行，按照（2）的方法接種后于35 ℃，120 r/min，培養(yǎng)3 d。以干重法表示菌體生長狀況。

（4）乙醇耐受力測定。用無菌的乙醇調(diào)節(jié)高氏一號液體培養(yǎng)基酒精度至2 %vol、4 %vol、6 %vol、8%vol、10%vol，每組酒精濃度設(shè)置3 個(gè)平行，按照（2）的方法接種后于35 ℃，120 r/min，培養(yǎng)3 d。以干重法表示菌體生長狀況。

1.2.2.3 分子生物學(xué)鑒定

本研究按照Takara 全基因組[12]提取試劑盒方法對分離純化后的細(xì)菌進(jìn)行DNA 提取。以上游引物[13]27F：5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'和下游引物[13]1492r：5'-ACGGTTACCTTGTTAC‐GACTT-3'進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃補(bǔ)充延伸10 min，16 ℃保溫5 min。取2 μ L PCR 產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠檢測PCR 擴(kuò)增效果；將PCR 得到的基因產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果在NCBI 進(jìn)行Blast 比對分析；將所得序列在Contigexpress 軟件上拼接及校正，獲得Fasta 格式文件，按照Neighbor-joining 法在Mega7.0 軟件上構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 產(chǎn)抗生素測定

本試驗(yàn)采用雙層瓊脂擴(kuò)散法測定抗生素。采用LB 固體培養(yǎng)基，將滅菌后的牛津杯垂直放入水瓊脂表面，在冷卻至50 ℃的LB 固體培養(yǎng)基中接種體積分?jǐn)?shù)為7 %的指示菌液，混勻后倒入底層水瓊脂，待其凝固后取出牛津杯。在形成的空洞內(nèi)加入200 μ L 菌液，靜置30 min 后在37 ℃的恒溫條件下培養(yǎng)12 h。本試驗(yàn)分別做革蘭氏陰性菌檢測和革蘭氏陽性菌檢測，在形成的3 個(gè)孔洞內(nèi)加入菌液，1個(gè)孔洞內(nèi)加入相同量50 mg/L 重鉻酸鉀溶液作為標(biāo)準(zhǔn)對照。

1.2.4 產(chǎn)淀粉酶測定

用點(diǎn)種法將分離純化后的放線菌接種于高氏一號固體培養(yǎng)基，置于37 ℃的恒溫條件下培養(yǎng)，平板中明顯出現(xiàn)生長良好的菌落時(shí)滴加魯戈氏碘液觀察透明圈。

2 結(jié)果與分析

2.1 窖泥中放線菌的分離

從土壤中分離放線菌前，對土壤的預(yù)處理尤為關(guān)鍵。不同的處理方式和抑制劑的添加會篩選出不同功能的放線菌株，同時(shí)在一定程度上也會抑制其他非目的菌株的生長，還會激發(fā)稀有放線菌孢子的生長，提高出菌率[14]。本研究采用1.2.1 所示3種預(yù)處理方法處理窖泥樣品。分離結(jié)果如表1 所示，由表1 可知，65 ℃濕熱處理加制霉素18 mg/mL、青霉素3 mg/mL 的組合（bAC3）及不做特殊處理加K2Cr2O750 mg/mL、青霉素1 mg/mL 的抑制劑組合（cB1C1）均分離出放線菌，其余組合均未能分離出放線菌。對分離出的放線菌分別編號為X、Z。結(jié)果表明，窖泥中放線菌的分離較為困難，尤其是干熱處理?xiàng)l件下，放線菌菌體和孢子受到高溫和水分的影響失去活性，在培養(yǎng)基上幾乎無法生長。干熱處理作為一種對土壤普遍使用的預(yù)處理方式[11]，濕熱處理窖泥樣品從中篩選放線菌株可能是一種更為理想的方式。

表1 分離培養(yǎng)結(jié)果

2.2 窖泥中放線菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

本試驗(yàn)從窖泥中分離、純化出2 株具有放線菌菌落形態(tài)特征的菌株，分別命名為菌株X 和菌株Z。菌株X 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果見圖1，菌株X 在高氏一號培養(yǎng)基中于28 ℃倒置培養(yǎng)3 d 后菌落呈不規(guī)則圓狀，白色或淡黃色，菌落質(zhì)地干燥，表面起粉，有明顯土腥味（圖1-A）；在40 倍顯微狀態(tài)下菌落呈絨毛發(fā)射狀（圖1-B）；在1000 倍顯微鏡下菌株X由長菌絲和分支菌絲組成，存在孢子鏈且呈直鏈狀（圖1-C）。菌株Z 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果見圖2，菌株Z在高氏一號培養(yǎng)基中于28 ℃倒置培養(yǎng)3 d 后菌落呈圓狀，白色，菌落質(zhì)地干燥，有明顯土腥味（圖2-A）；在40 倍顯微狀態(tài)下菌落呈發(fā)射狀（圖2-B）；在1000 倍顯微鏡下菌株Z 由長菌絲和分支菌絲組成（圖2-C）。參考《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》符合鏈霉菌屬的基本形態(tài)，因此，初步將該兩株放線菌歸為鏈霉菌屬。

圖1 菌株X 的菌落及菌絲形態(tài)

圖2 菌株Z 的菌落及菌絲形態(tài)

2.3 窖泥中放線菌的分子生物學(xué)鑒定

為進(jìn)一步確定菌株X 和菌株Z 的分類學(xué)地位，將兩株菌的DNA 提取后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果顯示（圖3），2 株放線菌的PCR 產(chǎn)物條帶單一，符合測序條件。將擴(kuò)增后的樣品進(jìn)行送樣測序，測序結(jié)果在NCBI 的GenBank 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源序列搜索，分別獲得7 個(gè)與菌X 和8 個(gè)與菌Z 同源性較高的模式菌株的16S rDNA 序列。通過MEGA7.0 軟件進(jìn)行多序列比對，按照Neighbor-joining 法在Mega7.0 軟件上構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，從聚類分析樹狀圖可以看出（圖4），在屬分類水平上，2 株菌屬于鏈霉菌屬（Streptomyces），在種水平上，X 菌與Streptomyces griseoplanus菌株YJ-RT8 聚成一群，并穩(wěn)定單獨(dú)成枝，序列同源性為99.72 %；Z 菌株與Streptomyces drozdowiczii菌株1136 聚類在一個(gè)系統(tǒng)發(fā)育分支上，序列同源性為99.72%。根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》的鑒定方案，并結(jié)合菌落形態(tài)特征、顯微鏡形態(tài)特征分析，確定X 菌株屬于產(chǎn)灰鏈霉菌（Streptomyces griseus），Z 菌株屬于德氏鏈霉菌（Streptomyces drozdowiczii）。

圖3 16S rDNA PCR 擴(kuò)增結(jié)果

圖4 菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 窖泥中放線菌的生理特性

2.4.1 放線菌的生長曲線

本研究采用干重法繪制2 株菌的生長曲線，結(jié)果見圖5。由于菌株進(jìn)入新環(huán)境后的生長發(fā)育需要一定的時(shí)間適應(yīng)和調(diào)節(jié)，放線菌X 和放線菌Z 在0～12 h 時(shí)均處于生長延滯期，在12～48 h 時(shí)間段內(nèi)菌株干重呈幾何級數(shù)增長，此時(shí)對數(shù)生長期出現(xiàn)，在培養(yǎng)48 h 后菌株生長量達(dá)到最大，此階段菌株的形態(tài)、生理活性等都比較典型，對外界環(huán)境因素敏感，探究遺傳性能多選用此時(shí)期的菌體。

圖5 兩株放線菌的生長曲線

2.4.2 放線菌的最適生長溫度

本實(shí)驗(yàn)兩株放線菌最適生長溫度結(jié)果見圖6。菌株X 的干重隨著溫度的升高呈先增加再降低的趨勢，在25 ℃有最大干重，表明其最適生長溫度在25～30 ℃之間，在20～25 ℃之間干重差比較大，表明在這個(gè)溫度范圍內(nèi)X 菌株的代謝十分活躍，菌株的生長發(fā)育對該段溫度的變化非常敏感。在25 ℃時(shí)Z 菌株也有最大干重，最適生長溫度也在25～30 ℃之間，可能的原因是在窖池中發(fā)酵過程中心最高溫度在35 ℃左右，放線菌群的生長發(fā)育在該溫度范圍下得到適應(yīng)。

圖6 兩株放線菌的最適生長溫度

2.4.3 放線菌的最適生長pH 值

兩株放線菌的最適生長pH 值結(jié)果見圖7，菌株X 在pH6.5 時(shí)有最大干重，在pH5.0 時(shí)有最小干重，整體呈先上升再下降的趨勢，表明放線菌株X 有較差的耐酸性且對酸度變化十分敏感，適宜在弱酸環(huán)境下生長，可能是濃香型白酒發(fā)酵過程中窖泥長期浸泡于黃水中，黃水呈弱酸性，使窖泥中上層也呈弱酸性，窖泥中的微生物經(jīng)過長期生長發(fā)育代謝馴化為適宜弱酸環(huán)境，因此能在此環(huán)境下良好生長。菌株Z 表現(xiàn)為對酸性環(huán)境的變化不敏感，但同樣在pH6.5 時(shí)有相對較大干重，表明在此酸性條件下菌株Z 生長最為活躍。

圖7 兩株放線菌的最適生長pH值

2.4.4 乙醇耐受力測定

兩株放線菌乙醇耐受力結(jié)果見圖8，隨著酒精濃度增大，兩株菌的長勢均減弱；菌株X 以及菌株Z 分別在酒精度為10%vol 以及酒精度為8%vol 時(shí)失去活性。在白酒發(fā)酵過程中窖池中的酒精積累是一個(gè)由少到多的過程，說明存在著對放線菌株生長促進(jìn)作用由大到小的酒精濃度梯度，放線菌在窖池中得到了長期的馴化，使得窖泥中的放線菌可以慢慢適應(yīng)酒精因素。

圖8 兩株放線菌的乙醇耐受力

2.4.4 放線菌株產(chǎn)抗生素特性

本試驗(yàn)采用雙層瓊脂擴(kuò)散法分別對得到的兩株放線菌進(jìn)行革蘭氏陽性菌以及革蘭氏陰性菌抑菌性實(shí)驗(yàn)，通過觀察抑菌圈的有無及大小反應(yīng)兩株菌產(chǎn)抗生素的情況，結(jié)果見圖9。兩株菌在陰性菌平板上和陽性菌平板上均無明顯抑菌圈，說明兩株菌的產(chǎn)抗生素能力很弱或者不產(chǎn)抗生素。放線菌因?yàn)樯成系牧觿?，不得不通過產(chǎn)生抗生素來對抗快速繁殖的微生物，以獲取對自身有利的營養(yǎng)物質(zhì)和生存空間，窖泥中的微生物經(jīng)過長期的馴化，群落之間形成了穩(wěn)定的生態(tài)環(huán)境，在這一穩(wěn)定生態(tài)系統(tǒng)中被選擇出的放線菌無需產(chǎn)生抗生素也能良好的生長。

圖9 兩株放線菌產(chǎn)抗生素抑菌性實(shí)驗(yàn)

2.4.5 放線菌株產(chǎn)淀粉酶特性

有研究表明[15-16]，放線菌具有較高的酶活力，且能夠利用淀粉酶分解淀粉產(chǎn)生葡萄糖，與此同時(shí)，窖泥中的產(chǎn)己酸菌可以利用放線菌產(chǎn)生的葡萄糖產(chǎn)生己酸，從而提高己酸產(chǎn)量。基于此本研究分別對兩株菌進(jìn)行了產(chǎn)淀粉酶能力測定實(shí)驗(yàn)，通過觀察分解圈的有無和大小研究兩株菌產(chǎn)淀粉酶能力強(qiáng)弱。結(jié)果如圖10 所示，兩株菌所在平板均能觀察到分解圈，且菌株X 所在平板的分解圈明顯大于菌株Z，表明菌株X 和菌株Z 均能夠產(chǎn)生淀粉酶，且菌株X 的產(chǎn)淀粉酶能力更強(qiáng)。結(jié)果表明窖泥中放線菌能夠分解淀粉，為其他菌株的生長提供營養(yǎng)物質(zhì)。

圖10 兩株放線菌的淀粉分解試驗(yàn)

3 討論

本研究通過對窖泥預(yù)處理并選擇合適抑制劑的方法，自濃香型白酒窖泥樣品中篩選分離獲得放線菌X 和放線菌Z，并對兩株放線菌進(jìn)行多項(xiàng)分類鑒定，以及生理代謝特性研究。結(jié)果表明，兩株放線菌在實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)可正常生長，并產(chǎn)生大量孢子。通過PCR 測序以及系統(tǒng)發(fā)育樹的建立，結(jié)合《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》，確定X 菌株屬于產(chǎn)灰鏈霉菌（Streptomyces griseus），Z 菌株屬于德氏鏈霉菌（Streptomyces drozdowiczii）。通過對兩株放線菌的生長進(jìn)行跟蹤發(fā)現(xiàn)，兩株放線菌生長發(fā)育基本同步，生長曲線均在12～48 h 時(shí)間段內(nèi)呈幾何級數(shù)增長，進(jìn)入對數(shù)期生長階段，并在48 h 后進(jìn)入穩(wěn)定期和衰亡期。兩株菌的繁殖隨著溫度的升高均呈現(xiàn)出先增高后降低的趨勢，且最適生長溫度區(qū)間在25～30 ℃，兩株放線菌最適生長酸度為pH6.5，菌株X 在酒精度10 %vol 時(shí)不耐受，菌株Z 在酒精度8 %vol 時(shí)不耐受。菌株X 和菌株Z 均能夠產(chǎn)生淀粉酶，表明放線菌可以分解淀粉為其他有利菌的生長提供葡萄糖，從而影響白酒風(fēng)味。菌株X 和菌株Z 均未產(chǎn)生抗生素，表明在這一穩(wěn)定生態(tài)系統(tǒng)中被選擇出的放線菌無需產(chǎn)生抗生素也能良好的生長。