現(xiàn)代微生物技術(shù)在白酒釀造中的應(yīng)用研究進展

馬沖，劉淼，2，李涵，蔡小波，何旭，黃孟陽，秦輝，2

（1.瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州 646000；2.國家固態(tài)釀造國家工程技術(shù)研究中心，四川瀘州 646000）

白酒作為世界六大蒸餾酒之一，有著悠久的發(fā)展歷史。中國傳統(tǒng)白酒工業(yè)不僅是我國特色的民族產(chǎn)業(yè)，也是我國重要的傳統(tǒng)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)之一[1-2]。釀造的實質(zhì)是酒曲、窖池、酒醅以及工藝操作環(huán)境中微生物參與的糖類物質(zhì)代謝。釀造微生物的種群、數(shù)量及代謝過程對白酒發(fā)酵及香味物質(zhì)的生成有重要影響。白酒產(chǎn)業(yè)中微生物的研究水平關(guān)乎到行業(yè)的技術(shù)創(chuàng)新，影響著白酒的品質(zhì)、產(chǎn)量、風(fēng)格[3-4]。因此，研究微生物技術(shù)在白酒產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用意義非凡。

隨著社會的快速發(fā)展，白酒行業(yè)向著品質(zhì)、健康的方向快速發(fā)展，專家學(xué)者將先進的現(xiàn)代微生物技術(shù)與傳統(tǒng)白酒工業(yè)融合，進一步推動白酒行業(yè)的發(fā)展。現(xiàn)代微生物技術(shù)一般包括基因工程、蛋白質(zhì)工程、發(fā)酵工程、遺傳工程、細胞工程、酶工程等[5-6]。目前的研究表明將微生物技術(shù)應(yīng)用于白酒產(chǎn)業(yè)，可以全方位提高白酒的產(chǎn)量與質(zhì)量。

本研究主要對基因工程、酶工程、PCR 技術(shù)、高通量測序等現(xiàn)代微生物技術(shù)在釀酒原料、制曲、釀酒生產(chǎn)、釀造廢棄物的應(yīng)用進行總結(jié)與歸納，以期為該技術(shù)在白酒產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用提供理論指導(dǎo)及探索方向。

1 現(xiàn)代微生物技術(shù)在釀酒原料方向的應(yīng)用

中國白酒是以含淀粉質(zhì)或糖質(zhì)的糧谷為主要原料，以酒曲為糖化發(fā)酵劑釀制成的酒精飲料。白酒的生產(chǎn)原料主要包括高粱、小麥、玉米、大米、糯米等[7]。尹大寬等[8]通過雜交選育出國窖紅一號，應(yīng)用于白酒釀造后使優(yōu)質(zhì)白酒率提高到60 %，為優(yōu)質(zhì)的釀酒原料；田殿梅等[9]對14種不同品質(zhì)的高粱進行模擬發(fā)酵實驗后發(fā)現(xiàn)，以瀘糯八號和國窖紅一號為原料的出窖糟醅酒精含量和己酸乙酯含量最高，且產(chǎn)出的甲醇及雜醇油等限制性物質(zhì)含量最少，更適合釀造優(yōu)質(zhì)濃香型白酒。

因此，利用雜交選育技術(shù)對釀酒原料進行改善，并通過微生物發(fā)酵試驗驗證，不僅能提高出酒率及酒質(zhì)，而且能一定程度抑制白酒中有害物質(zhì)的生成。

2 現(xiàn)代微生物技術(shù)在制曲方向的應(yīng)用

2.1 在酒曲微生物中分離鑒定方面的應(yīng)用

酒曲作為白酒釀造的糖化發(fā)酵劑，其微生物主要來自于自然環(huán)境。傳統(tǒng)的鑒定方法難以研究透徹該體系中復(fù)雜的微生物種群，對研究酒曲中的微生物特性尤為不利。利用PCR 及高通量測序技術(shù)，能夠全面快速地鑒定酒曲中的微生物種群和特性，利于酒曲微生物圖譜的建立。在濃香型大曲研究上，劉英杰等[10]利用PCR 及高通量測序技術(shù)檢測到瀘州老窖新老曲廠空氣中細菌菌群由Acfinobacte‐ria 等5個門構(gòu)成，主要是Pseudomonas、Staphylococcus、Bacillus等，真菌群則由Ascomycota 等3 個門構(gòu)成，Phialemoniopsis和Aspergillus等是優(yōu)勢屬。

在醬香型大曲研究上，LI等[11]應(yīng)用ARDRA 技術(shù)和16S rDNA 基因克隆文庫，從醬香型大曲中鑒定出了枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌等優(yōu)勢細菌；莫禎妮等[12]采用Illumina Hiseq 高通量測序技術(shù)對醬香型白酒大曲曲皮和曲心兩個部位的細菌群落進行研究，發(fā)現(xiàn)曲皮和曲心樣品中的細菌菌群歸屬于7 個門、13 個綱、19 個目、29 個科和55 個屬，共有優(yōu)勢細菌門為厚壁菌門（Fir‐micutes）、放線菌門（Actinobacteria）。

在酒曲發(fā)酵過程中，竇曉等[13]通過16S rRNA基因序列分析法對瀘型酒大曲發(fā)酵過程不同時期可培養(yǎng)細菌的研究，共分離鑒定到122 株細菌,同時發(fā)現(xiàn)大曲發(fā)酵前期主要細菌種類為Weissella confuse,Enterobacter mori,Lactobacillus pentosus,Kocuria palustris,Lactobacillus plantarum subsp.Plantarum，發(fā)酵后期以芽孢桿菌為主(Bacillus anthracis和Bacillus subtilis subsp.inaquosorum)；蘇暢等[14]采用ITS4/5rRNA 區(qū)序列對不同發(fā)酵時期大曲中分離出的193 株霉菌進行研究比對，發(fā)現(xiàn)分離的霉菌主要為紅曲霉、米根霉、微小根毛霉、煙曲霉、嗜熱子囊菌、謝瓦氏曲霉、米曲霉等，初步探究出了大曲生產(chǎn)過程中不同時期霉菌的組成和變化規(guī)律。

2.2 在強化酒曲生產(chǎn)中的應(yīng)用

傳統(tǒng)酒曲是網(wǎng)羅自然環(huán)境中的微生物發(fā)酵制成的。研究人員利用微生物選育等技術(shù)在傳統(tǒng)酒曲的生產(chǎn)中加入純種培養(yǎng)微生物、酶制劑來彌補酒曲中某些微生物數(shù)量及酶類的不足，改善酒曲質(zhì)量，從而提高白酒的出酒率和酒質(zhì)。吳秋霞等[15]研究了產(chǎn)4-乙基愈創(chuàng)木酚(4-EG)菌株Bacillus subtilisD-31、產(chǎn)四甲基吡嗪(TTMP) 菌株Bacillus velezensisM-14，分別強化及分離菌株共培強化濃香型大曲對大曲質(zhì)量的影響，研究發(fā)現(xiàn)，D-31 強化和M-14 強化提高了大曲的淀粉酶活力、發(fā)酵力和酯化力，共培強化大曲僅提高了淀粉酶活力。陳曉茹等[16]利用優(yōu)質(zhì)陳曲和分離株(Bacillus licheniformis，瀘州老窖大曲中分離)強化濃香型大曲的研究發(fā)現(xiàn)，分離菌使大曲的細菌和真菌豐度及真菌多樣性增高，吡嗪和醇類含量分別提高了5 074.49 %和440.50 %，陳曲強化提高了細菌的豐富度和多樣性，大曲酯化力提高34.41 %,并檢出石竹烯和杜香醇等獨特成分。

有學(xué)者從降低有害物質(zhì)的角度出發(fā)，篩選低產(chǎn)有害物質(zhì)的菌株用于強化大曲。林小江等[17]采用原生質(zhì)體融合技術(shù)選育出了1 株低產(chǎn)甲醇與高產(chǎn)總酯的釀酒酵母融合菌株,相對甲醇含量降低了23.4%，總酯含量提高了37.1%。

3 現(xiàn)代微生物技術(shù)在釀酒方向的應(yīng)用

3.1 現(xiàn)代微生物技術(shù)在窖池方面的應(yīng)用

3.1.1 在窖池微生物分離鑒定方面的應(yīng)用

中國白酒采用固態(tài)發(fā)酵，窖池中棲息著大量微生物,窖池中微生物的種類、數(shù)量、種群間的相互作用以及代謝的多樣性都直接影響白酒的品質(zhì)。近年來，越來越多的白酒企業(yè)利用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)、PCRDGGE 等技術(shù)對窖池中的微生物進行分離鑒定，在解析白酒發(fā)酵機理上取得了顯著成效。有學(xué)者應(yīng)用高通量測序、PCR-DGGE 技術(shù)分析了不同性狀窖泥的細菌群落，解析出窖泥中優(yōu)勢微生物包含擬桿菌門、放線菌門、變形菌門和厚壁菌門4 個門類[18-20]；Xu等[21]從瀘州老窖百年窖池中分離出了1個細菌新種，命名為老窖梭菌（Clostridium fermenticellae），該菌株具有產(chǎn)生窖泥異嗅化合物對甲基苯酚的能力；Zhao等[22]從瀘州老窖400 多年窖齡的窖池中分離出1 株乳桿菌新種，定名為老窖乳桿菌（Lentilactobacillus laojiaonisIM3328），該菌株是迄今為止所有已經(jīng)完成全基因組測序的最小基因組乳桿菌，兼性厭氧代謝，產(chǎn)物中乳酸、乙酸、乙醇、異戊醇和乙酸丁酯為優(yōu)勢代謝產(chǎn)物。在窖泥真菌群落分析上，Liu等[23]利用DGGE 和Illumina MiSeq 測序技術(shù)測定濃香型白酒5 年和100 年窖池發(fā)現(xiàn)4 門(子囊菌門、接合菌門、擔(dān)子菌門和壺菌門)111 個真菌屬，子囊菌門為優(yōu)勢門。

有學(xué)者分離鑒定出特異性菌株并應(yīng)用于釀酒生產(chǎn)，進而提升白酒品質(zhì)。李蘭等[24]從濃香型白酒窖池中篩選出了一株高產(chǎn)3-羥-2-丁酮、2,3-丁二醇的功能菌，利用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)、Biolog 微生物鑒定及分子生物學(xué)鑒定等方法，判定該菌種為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）；汪文鵬等[25]通過傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)及16S rDNA 鑒定，從窖泥中篩選出3 株細菌地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、空氣芽孢桿菌(Bacillus aerius)、丁酸梭菌亞種(Clostridium butyricum subsp)，發(fā)現(xiàn)這3種細菌的優(yōu)勢產(chǎn)物高級醇、酯類、酸類是濃香型白酒微量成分的主要組成部分。

3.1.2 在人工培育老窖方面的應(yīng)用

窖池是白酒釀造的容器，關(guān)系到白酒的酒體風(fēng)格和品質(zhì)?！扒昀辖讶f年糟，酒好還需窖池老”，充分反映出老窖池在白酒釀造中的獨特優(yōu)勢。為了加速新窖的老熟，提高新窖的產(chǎn)酯能力，利用功能微生物選育培養(yǎng)技術(shù)提高人工培育老窖的能力顯得尤為重要。劉淼等[26]從瀘型酒優(yōu)質(zhì)老窖泥中分離選育出1 株窖泥功能菌并用于生產(chǎn)功能性人工窖泥新建或改建窖池，發(fā)現(xiàn)試驗窖池己酸乙酯含量提高近50 %，酒質(zhì)基本接近15 年窖齡窖池的酒質(zhì)，徐占成等[27]在老窖泥中分離選育1 株產(chǎn)己酸能力強的菌株，定性為生孢梭菌，使人工培養(yǎng)的窖泥中芽孢桿菌數(shù)提高了50 %以上，產(chǎn)己酸能力提高了1 倍。

3.1.3 在窖池養(yǎng)護方面的應(yīng)用

在濃香型白酒的生產(chǎn)過程中，由于生產(chǎn)操作等各方面原因，導(dǎo)致窖泥老化、板結(jié)嚴重，嚴重影響基酒的品質(zhì)。桑其明等[28]利用甲烷桿菌、己酸菌及老窖泥混合培養(yǎng)制成的多元窖泥養(yǎng)護液進行窖池養(yǎng)護，窖泥質(zhì)量顯著提高且酒體中己酸乙酯含量增加了76.3 %；魏云等[29]采取復(fù)合型窖泥養(yǎng)護方法，使試驗窖己酸乙酯含量達到3.47 g/L，總酸達到1.52 g/L，總酯7.94 g/L，酒質(zhì)得到顯著提升。還有大量學(xué)者利用微生物技術(shù)研究窖泥功能菌并開發(fā)新型窖泥養(yǎng)護液應(yīng)用于窖池養(yǎng)護，以此解決窖泥老化問題，提高基酒品質(zhì)[30-32]。

3.1.4 在選育優(yōu)質(zhì)窖泥微生物中的應(yīng)用

除了利用微生物技術(shù)分離、鑒定窖泥中固有的微生物資源外，還有學(xué)者利用誘變選育和基因改良等技術(shù)開發(fā)釀酒微生物新菌種，達到促進生產(chǎn)、提高酒質(zhì)的目的[33-34]。熊俐等[35]從老窖池中分離純化出一株產(chǎn)酸能力較高的己酸菌GS5，通過紫外誘變篩選出了1 株突變株GSUT3，其產(chǎn)酸量相比原始菌株提高了12%，且經(jīng)多次繼代培養(yǎng)后產(chǎn)量穩(wěn)定。

3.2 現(xiàn)代微生物技術(shù)在糟醅方面的應(yīng)用

3.2.1 在糟醅微生物分離鑒定的應(yīng)用

糟醅中微生物群落的穩(wěn)定、生長繁殖與代謝對白酒風(fēng)味物質(zhì)的形成起著重要作用。糟醅微生態(tài)系在不同發(fā)酵時期、不同空間都是不同的[36]。傳統(tǒng)的分離鑒定方法難以深入研究糟醅微生物的特性，利用以PCR 為基礎(chǔ)的DNA 指紋圖譜鑒定技術(shù)能夠較為全面、快速準確地分析糟醅微生物的群落結(jié)構(gòu)，為釀酒生產(chǎn)提供理論支撐。肖辰等[37]采用高通量測序技術(shù)對瀘型酒糟醅中細菌群落結(jié)構(gòu)進行研究，共鑒定出397 個屬的微生物，其中Lactobacillus、Bacillus、Weissella、Dysgonomonas、Comamonas以及Ruminococcaceae為優(yōu)勢屬；Chen等[38]從醬香型白酒糟醅中鑒定出7種絲狀真菌，其中P.variotii與A.oryzae具有較強的產(chǎn)淀粉酶能力；李德林等[39]采用PCR-DGGE 方法對瀘型酒糟醅中的微生物群落結(jié)構(gòu)進行研究，發(fā)現(xiàn)瀘型酒糟醅中存在的細菌有18 個屬，首次分離出Dyadobacter、Pantoea、Pediococcus、Saccharomonospora、Bavariicoccus、Serratia、Petrimona、Exiguobacterium屬菌株。

研究還報道了白酒發(fā)酵過程及不同空間位置糟醅微生物的特征。王雪山等[40]探究清香型白酒不同位置糟醅中微生物種群結(jié)構(gòu)及演替規(guī)律，發(fā)現(xiàn)清香型白酒發(fā)酵過程中優(yōu)勢細菌種群包括乳桿菌屬、魏斯氏菌屬、Kroppenstedtia、假單胞菌屬、明串珠菌屬、芽孢桿菌屬和片球菌屬，優(yōu)勢真菌種群包括畢赤酵母屬、假絲酵母屬、曲霉屬、復(fù)膜酵母屬和Kazachstania，還發(fā)現(xiàn)上層糟醅微生物種群演替速率慢于中、下層糟醅，進一步說明對不同位置糟醅微生物種群的監(jiān)測對白酒發(fā)酵控制有重要的意義[41-42]；劉念等[43]研究了濃香型白酒糟醅的真菌種群結(jié)構(gòu)及演變規(guī)律，結(jié)果顯示，糟醅中的優(yōu)勢真菌是酵母屬、伊薩酵母屬、假絲酵母屬、漢遜酵母和曲霉屬，發(fā)酵前中期以酵母屬、伊薩酵母屬、酵母菌和曲霉屬為主，發(fā)酵后期以假絲酵母屬、漢遜酵母屬、酵母菌和散囊菌屬為主。

3.2.2 在提高白酒產(chǎn)質(zhì)方面的應(yīng)用

隨著社會經(jīng)濟水平的逐漸提高，白酒產(chǎn)業(yè)中傳統(tǒng)的生產(chǎn)操作和理論經(jīng)驗已不足以支撐白酒向著量質(zhì)齊升的方向發(fā)展。利用微生物選育、酶工程等技術(shù)手段，探索出提高白酒產(chǎn)量、質(zhì)量更加科學(xué)的方法。董永勝等[44]從白酒糟醅中分離篩選得到一株能在38 ℃下發(fā)酵良好的耐酸耐高溫酒精酵母菌，將其應(yīng)用于白酒工業(yè)生產(chǎn)中乙醇產(chǎn)量提高了30%；稅梁揚等[45]以不同方式將酯化酶和己酸菌液應(yīng)用于傳統(tǒng)濃香型白酒發(fā)酵中，發(fā)現(xiàn)試驗窖池出酒率提高7 %左右，優(yōu)質(zhì)品率提高10 %；王海英等[46]將復(fù)合酶制劑應(yīng)用于清香型機械化釀酒生產(chǎn)中，多種酶能夠?qū)υ线M行徹底分解，有效提高產(chǎn)質(zhì)量。

3.2.3 在釀造副產(chǎn)物綜合利用方面的應(yīng)用

黃水是白酒釀造過程中的副產(chǎn)物，是由于入窖糟醅在微生物的作用下生成大量的游離水，與糟醅中的酸、可溶性淀粉、還原糖、酒精、單寧、香味物質(zhì)、未被微生物利用的水等一起由于重力的原因慢慢沉積在窖池底部而形成的棕褐色或金黃色、流體狀的液體[47-48]。李周等[49]將黃水以不同體積比添加到HS 培養(yǎng)基中進行葡糖醋桿菌發(fā)酵生產(chǎn)細菌纖維素(BC)，發(fā)現(xiàn)在黃水的體積比為40%的條件下，BC產(chǎn)量為5.93 g/L，較對照組提高了169.5 %；He等[50]以黃水和酒糟酶解物為培養(yǎng)基原料，接種木醋桿菌發(fā)酵，獲得了高達7.42 g/L 的BC 產(chǎn)量；王風(fēng)青等[51]以黃水為原料復(fù)配營養(yǎng)培養(yǎng)基，接種枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilisYB18）來生產(chǎn)γ-聚谷氨酸（γ-PGA），發(fā)酵后γ-PGA 產(chǎn)量達14.510 g/L。因此，利用微生物技術(shù)對黃水進行綜合利用，不僅能夠提高黃水的利用率，而且能夠減少對環(huán)境的污染，提高企業(yè)的經(jīng)濟效益。

4 現(xiàn)代微生物技術(shù)在釀酒廢棄物方向的應(yīng)用

與國外蒸餾酒液態(tài)釀造工藝相比，中國白酒的固態(tài)釀造工藝受傳質(zhì)效率等因素的影響，導(dǎo)致原料利用率較低，釀造廢棄物中有機質(zhì)含量高,污染問題嚴重。對廢棄物進行合理利用不僅能夠減少環(huán)境污染，還可以為社會和企業(yè)帶來經(jīng)濟效益[52-53]。

4.1 在丟糟高值化方面的應(yīng)用

丟糟中含有豐富的蛋白質(zhì)、纖維素、氨基酸、淀粉和多種微量元素等營養(yǎng)成分[54]。林金新等[55]利用4種芽孢桿菌、2種霉菌與釀酒酵母組成的混合菌對白酒丟糟進行固態(tài)發(fā)酵制備有機肥料，發(fā)酵后產(chǎn)物中腐殖質(zhì)含量達到17.50 %，種子發(fā)芽指數(shù)GI值達到93.2 %；楊建梅等[56]利用高產(chǎn)纖維素酶誘變菌株RY49，制備功能性纖維素酶簾子曲，將其與糖化酶、TH-AADY 共同應(yīng)用于綿柔型白酒丟糟中進行二次發(fā)酵，結(jié)果顯示試驗窖出酒率達到3.89 %。還有學(xué)者將其用于制備生物燃料[57]，如Satenik Mir‐zoyan等[58]將酒糟預(yù)處理后與啤酒糟或甘油等混合，在大腸桿菌作用下生成氫氣，產(chǎn)量為1.4 mmol/L。

4.2 在釀造廢水高值化方面的應(yīng)用

白酒釀造廢水包括蒸餾鍋底水、車間地面沖洗水和生活廢水等，主要成分為水、淀粉、低碳醇、脂肪酸、氨基酸等[59]，水質(zhì)呈酸性,污染物濃度高,必須處理達標后才能排放[60]，有研究采用富含聚糖菌的活性污泥系統(tǒng)對釀酒廢水進行處理，在不投加營養(yǎng)元素的情況下，出水水質(zhì)良好，未發(fā)生污泥膨脹，COD 的去除率最高可達到97 %，出水的COD 最低僅為15.31 mg/L。試驗還發(fā)現(xiàn)，進水的pH 在6.0～7.1 范圍內(nèi)時，pH 值越低，越有利于降低污泥膨脹的可能性，出水COD 越低[61]。

5 結(jié)論與展望

中國白酒與國外蒸餾酒釀造方式存在較大差異，中國白酒開放式的釀造模式造就了釀酒微生物的多樣性。目前，雖已有學(xué)者對白酒釀造過程中微生物進行了解析、研究，總結(jié)了代謝機制，找到了提高白酒產(chǎn)質(zhì)的措施，但還遠遠不夠。利用基因工程、酶工程、PCR 技術(shù)、高通量測序等現(xiàn)代微生物技術(shù)，與其他相關(guān)技術(shù)進一步結(jié)合，繼續(xù)挖掘白酒釀造微生物菌群，加大對功能微生物的解析、開發(fā)及利用，研究釀酒微生物與代謝產(chǎn)物、白酒風(fēng)味物質(zhì)之間的相關(guān)性，仍是未來白酒行業(yè)研究的重點領(lǐng)域。