一測多評法同時測定新復(fù)方大青葉片中4 種成分含量*

王麗瓊，魏長勇，余敏靈

（四川省樂山市食品藥品檢驗檢測中心·四川省藥品監(jiān)督管理局中藥質(zhì)量研究重點實驗室，四川 樂山 614000）

新復(fù)方大青葉片是由復(fù)方大青葉提取物、對乙酰氨基酚、咖啡因、異戊巴比妥和維生素C 組成的復(fù)方制劑?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為原國家食品藥品監(jiān)督管理總局國家藥品標(biāo)準(zhǔn)（WB3-B-1057-91-2015）［1］，但因維生素C 對照品性質(zhì)不穩(wěn)定［2-5］，未對其含量進(jìn)行控制，且咖啡因和異戊巴比妥對照品存在需特殊購買和管理的問題。為此，本研究中采用乙醇代替甲醇（乙腈）作為流動相的有機(jī)相，建立了以對乙酰氨基酚為對照品，同時測定新復(fù)方大青葉片中4 種成分的一測多評（QAMS）法?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260 型高效液相色譜儀［含二極管陣列（DAD）檢測器］、1100 型高效液相色譜儀（含紫外- 可見光檢測器），均購自美國Agilent 公司；PE A-10 型高效液相色譜儀，含量DAD 檢測器（珀金埃爾默企業(yè)管理有限公司）；XS205 型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度為0.01 mg）；KQ 5200DB 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

新復(fù)方大青葉片（廠家S1，S2，S3，S4，S5，編號分別為A，B；C，D；E；F；G，規(guī)格均為每片含維生素C 10 mg、對乙酰氨基酚75 mg、咖啡因7.5 mg 和異戊巴比妥7.5 mg）；維生素C 對照品、對乙酰氨基酚對照品、咖啡因?qū)φ掌罚ㄖ袊称匪幤窓z定研究院，批號分別為100425 - 201504，100018 - 201610，171215 - 201010，含量分別為100.0%，99.9%，100.0%）；異戊巴比妥原料（廠家A，批號為W201102，含量為99.4%）；乙醇為色譜純，磷酸、乙醇、磷酸二氫鉀、焦亞硫酸鈉均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Welch Ultimate LP - C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙醇（A）-0.01 mol/L 磷酸二氫鉀溶液（B，用磷酸調(diào)pH 至3.0），梯度洗脫（0～3 min時2%A，3～6 min 時2%A→15%A，6～15 min 時15%A，15～20 min 時15%A→60%A，20～26 min 時60%A，26～27 min 時60%A→2%A，27～32 min 時2%A）；流速：0.8 mL/min；檢測波長：215 nm（對乙酰氨基酚、咖啡因和異戊巴比妥）和245 nm（維生素C）；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

分別取維生素C、對乙酰氨基酚、咖啡因?qū)φ掌泛彤愇彀捅韧自?2.16，187.06，18.66，19.06 mg，精密稱定，置同一50 mL容量瓶中，加少量無水乙醇溶解，再加0.5%焦亞硫酸鈉溶液（用磷酸調(diào)pH 至3.0，下同）稀釋、定容、搖勻，即得混合對照品貯備液；精密量取1 mL，置20 mL 容量瓶中，加0.5%焦亞硫酸鈉溶液稀釋、定容，搖勻，即得混合對照品溶液。取樣品20片（糖衣片除去包衣），研細(xì)，取約0.1 g，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，加0.5%焦亞硫酸鈉溶液適量，超聲（功率200 W、頻率40 kHz，下同）處理10 min，再加0.5%焦亞硫酸鈉溶液稀釋、定容、搖勻，即得供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗：取2.2項下混合對照品溶液和供試品溶液各適量，按2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與混合對照品溶液色譜相應(yīng)位置處有吸收峰，理論板數(shù)按各成分峰計均應(yīng)大于3 000，分離度均大于1.5。詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.Vitamin C 2.Paracetamol 3.Caffeine 4.AmobarbitalA.Mixed reference solution B.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：精密量取2.2項下混合對照品溶液2，4，8，12，16，20 μL，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以待測成分進(jìn)樣量（C，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（A）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得維生素C、對乙酰氨基酚、咖啡因、異戊巴比妥的回歸方程分別為A1=3 627.24C1（r=0.999 8），A2=2 036.51C2（r=0.999 7），A3=5 570.84C3（r=0.999 9），A4=2 467.71C4（r=0.999 9）。結(jié)果表明，4種成分進(jìn)樣量分別在0.064 3～0.643 2 μg、0.373 7～3.737 5 μg、0.037 3～0.373 2 μg、0.037 9～0.378 9 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

檢測限與定量限考察：取維生素C、對乙酰氨基酚、咖啡因和異戊巴比妥對照品各適量，精密稱定，加無水乙醇，制成質(zhì)量濃度分別為1.21，7.48，3.81，8.17 μg/mL的溶液，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，以信噪比（S/N）為3和10時的待測成分質(zhì)量濃度分別記作檢測限和定量限。結(jié)果檢測限分別為0.03，0.15，0.07，0.24 μg/ mL，定量限分別為0.09，0.51，0.23，0.79 μg/mL。

精密度試驗：取2.2 項下混合對照品溶液適量，按2.1項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果維生素C、對乙酰氨基酚、咖啡因和異戊巴比妥峰面積的RSD分別為1.02%，0.92%，1.09%，0.78%（n= 6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取2.2 項下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，2，4，8，16，24 h時按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果維生素C、對乙酰氨基酚、咖啡因和異戊巴比妥峰面積的RSD分別為1.58%，1.08%，0.97%，0.85%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：取樣品（編號A）適量，按2.2項下方法制備供試品溶液，共6 份，按2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算含量。結(jié)果維生素C、對乙酰氨基酚、咖啡因和異戊巴比妥的平均含量分別為70.31%，89.37%，93.87%，89.72%，RSD分別為1.50%，1.72%，0.79%，1.21%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（編號A，維生素C、對乙酰氨基酚、咖啡因和異戊巴比妥的平均含量分別為22.461 0，217.828 8，21.985 1，21.840 2 mg/ g），取細(xì)粉各適量（約0.05 g），共6份，置100 mL容量瓶中，精密加入2.2 項下混合對照品貯備液2.5 mL，按2.2 項下方法制備供試品溶液。按2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并采用外標(biāo)法（ESM）計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test（n=6）

2.4 相對校正因子（f）的確定和耐用性考察

f的確定：精密量取2.2 項下混合對照品溶液適量，共3 份，按2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以對乙酰氨基酚為參照，采用斜率法計算維生素C、咖啡因和異戊巴比妥的f，f=Kr/Kt，式中，Kr為對乙酰氨基酚的斜率，Kt為其他待測成分的斜率。計算3 個成分f的平均值。結(jié)果維生素C、咖啡因和異戊巴比妥的f分別為0.576 1，0.373 2，0.843 8，RSD分別為0.91%，0.51%，0.62%（n=3）。

耐用性考察：精密量取2.2項下混合對照品溶液適量，按2.1項下色譜條件［分別設(shè)置色譜柱為Agilent Extend - C18柱、Welch Ultimate LP - C18柱、A585V3 SVEATMC18Opal 柱、GL Sciences Intersustain AQ - C18柱、Waters AtlantisTMT3 柱（規(guī)格均為250 mm × 4.6 mm，5 μm）］測定，記錄峰面積，計算維生素C、咖啡因和異戊巴比妥的f，結(jié)果見表2?？梢姡V柱發(fā)生一定程度變化時，各成分f的RSD均小于3%，耐用性較好。

表2 耐用性考察結(jié)果Tab.2 Results of the durability test

2.5 QAMS 法與外標(biāo)法測定結(jié)果比較

取樣品（編號A - G）適量，按2.2 項下方法制備供試品溶液，均平行3 份，按2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，分別采用ESM 和QAMS 法計算樣品含量。QAMS法計算公式為mt=（f×At×As）/ms，式中，mt為待測成分（維生素C、咖啡因和異戊巴比妥）的質(zhì)量（μg），At為式中待測成分的峰面積，ms與As分別為對乙酰氨基酚的質(zhì)量（μg）與峰面積。對2種方法所得結(jié)果采用配對t檢驗，結(jié)果均無顯著差異（P＞0.05），詳見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果（%）Tab.3 Results of content determination of vitamin C，caffeine，amobarbital and paracetamol in samples（%）

3 討論

3.1 樣品溶劑選擇

預(yù)試驗中比較了0.5%焦亞硫酸鈉溶液及0.5%焦亞硫酸鈉溶液-乙醇（95∶5、90∶10、80∶20，V/V）這4 種溶劑對4個成分提取效率的影響。結(jié)果，4種溶劑提取效率基本一致，乙醇對對乙酰氨基酚、咖啡因、異戊巴比妥的提取均無影響，綜合考慮，溶劑最終選擇0.5%焦亞硫酸鈉溶液。

3.2 檢測波長選擇

預(yù)試驗中所得紫外光譜圖顯示，維生素C在245 nm波長處有最大吸收，咖啡因和異戊巴比妥在215 nm 波長處有較大吸收，綜合考慮，選擇檢測波長為215 nm（對乙酰氨基酚、咖啡因和異戊巴比妥）和245 nm（維生素C）。

3.3 流動相與柱溫選擇

預(yù)試驗中比較了流動相B分別為水、0.01%磷酸溶液、0.01 mol/L 磷酸二氫鉀溶液（用磷酸調(diào)pH 至3.0）對色譜峰的影響。結(jié)果采用水作為流動相時，維生素C出峰時間延遲，峰形差，展寬，而在酸性條件下，維生素C出峰時間適中，峰形好。經(jīng)考察，選擇0.01 mol/L 磷酸二氫鉀溶液（用磷酸調(diào)pH 至3.0）時，4個成分峰與相鄰峰的分離度符合要求。4 種成分理化性質(zhì)不一致，維生素C極性強，異戊巴比妥非極性強，采用梯度洗脫，各組分出峰時間適中，峰間分離度好。乙醇黏度較大，適當(dāng)升高柱溫可降低黏度，經(jīng)考察，柱溫選擇40 ℃。

3.4 維生素C 穩(wěn)定性考察

預(yù)試驗中以維生素C 對照品加磷酸水溶液（pH 分別為2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5）及水，分別于室溫下放置0，2，8，12，16，24，36 h 時進(jìn)樣測定，記錄峰面積。發(fā)現(xiàn)維生素C 溶液穩(wěn)定性pH 3.0 ＞pH 3.5 ＞pH 2.5 ＞pH 4.0 ＞pH 4.5 ＞pH 2.0 ＞水。故選擇制備pH 3.0 的磷酸水溶液。還分別用0.3%，0.5%，0.7%焦亞硫酸鈉溶液制備供試品溶液，分別于0，4，8，12，16，24 h 時進(jìn)樣測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)焦亞硫酸鈉溶液體積分?jǐn)?shù)為0.5%及以上時，維生素C穩(wěn)定性較好。

3.5 方法的經(jīng)濟(jì)性與環(huán)保性

新復(fù)方大青葉片各成分中，異戊巴比妥和咖啡因?qū)俚诙惥袼幤?，維生素C 性質(zhì)不穩(wěn)定（易氧化和水解），這3個成分對照品的購買和管理存在一定的問題。QAMS 法是以價廉易得、性質(zhì)穩(wěn)定的物質(zhì)為內(nèi)參物，建立內(nèi)參物與其他成分間的f，并以此獲得其他多個組分的含量［6-9］。該方法可解決藥品質(zhì)量控制中對照品性質(zhì)不穩(wěn)定、價格昂貴、需特殊購買和管理的問題，適用于復(fù)雜成分或多指標(biāo)成分含量測定。課題組經(jīng)過研究和驗證，以性質(zhì)穩(wěn)定的對乙酰氨基酚為內(nèi)參物，采用QAMS 法［10-16］，以f計算樣品中維生素C、咖啡因和異戊巴比妥的含量。在后期檢驗過程中，僅需對乙酰氨基酚對照品，省去維生素C、咖啡因和異戊巴比妥對照品，實現(xiàn)檢驗方法的經(jīng)濟(jì)性發(fā)展。甲醇作為第二類溶劑在檢驗中被大量使用，對環(huán)境和實驗人員身體健康影響均較大。乙醇屬第三類溶劑，毒性較低，本研究中以乙醇作為流動相的組成部分較安全［17-20］。

3.6 方法評價

本研究中所建立的方法環(huán)保（以乙醇代替甲醇）、經(jīng)濟(jì)（只需1 種對照品），結(jié)果準(zhǔn)確且可快速獲得，適用于新復(fù)方大青葉片的質(zhì)量評價。