LncRNA LUCAT1促進(jìn)宮頸癌SiHa細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移及順鉑耐藥*

魏 麗,陳玉忠,杜 軍,李 艷,張慧慧,李多杰

(1.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤婦科,安徽 蚌埠 233000;2.腫瘤外科;3.放療科)

宮頸癌(cervical cancer, CC)是全球第四大常見(jiàn)的癌癥,也是女性癌癥死亡的主要原因[1],嚴(yán)重威脅著女性的身心健康。目前對(duì)于宮頸癌的治療主要包括手術(shù)治療、放療與化療,同時(shí)化療是目前臨床延長(zhǎng)晚期宮頸癌患者生命的主要策略[2]。順鉑作為一種常用的化療藥物,可以導(dǎo)致嚴(yán)重的DNA損傷,引發(fā)癌細(xì)胞死亡。在臨床初期治療時(shí)具有良好的治療效果,但是大多數(shù)宮頸癌患者無(wú)可避免地發(fā)展成了順鉑耐藥,嚴(yán)重阻礙了順鉑的療效[3-4]。因此,深入探討研究宮頸癌的順鉑耐藥機(jī)制將為提高宮頸癌化療效果提供理論依據(jù),具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

長(zhǎng)鏈非編碼 RNA是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò) 200個(gè)核苷酸的新型非編碼RNA,其不具備編碼蛋白質(zhì)的能力[5]。隨著研究的深入,越來(lái)越多的lncRNA被發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織中異常表達(dá)。LncLUCAT1即肺癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1,在多種腫瘤中均顯著高表達(dá)[6-8]。但是對(duì)于LncLUCAT1在宮頸癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移,以及順鉑(cis-dichlorodiamineplatinum, DDP)耐藥中的作用及潛在的調(diào)控機(jī)制尚無(wú)明確的報(bào)道。本文章探究LncLUCAT1在宮頸癌細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移以及順鉑耐藥中的作用及潛在機(jī)制,以期為明確LncLUCAT1在宮頸癌發(fā)生發(fā)展的作用及機(jī)制,以及提高順鉑臨床化療效果提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要材料 宮頸癌SiHa細(xì)胞購(gòu)于北納生物;RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;MTT購(gòu)自biosharp公司;Lip2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen公司;qPCR試劑盒購(gòu)自TAKARA公司;蛋白激酶 B( protein kinase B,AKT) 、磷酸化的 AKT( phospho-AKT,p-AKT)抗體,購(gòu)自CST公司;pcDNA3.1載體、pcDNA3.1-LncLUCAT1載體、LUCATI小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)(LncLUCAT1 siRNA-1與LncLUCAT1 siRNA-2)和陰性對(duì)照siRNA購(gòu)自中國(guó)上海GenePharma公司;熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI 公司;NanoDrop One/One C微量核酸蛋白濃度測(cè)定儀購(gòu)于美國(guó)Thermo公司;Synergy-HT酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio Tek公司;Fusion FX Spectra凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自法國(guó)Vilber公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 宮頸癌SiHa與SiHa/DDP細(xì)胞培養(yǎng)于含有10 %胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基中,放置于37 ℃、5 %CO2的培養(yǎng)箱中,待細(xì)胞匯合度達(dá)到80 %時(shí),使用胰酶消化傳代。細(xì)胞干擾實(shí)驗(yàn)分為陰性對(duì)照組(NC)與LncLUCAT1 siRNA組(LncLUCAT1 siR-1和LncLUCAT1 siR-2)。細(xì)胞過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)分為vector組與LncLUCAT1-OE組。當(dāng)細(xì)胞匯合度至60 %～70 %時(shí),使用Lip2000轉(zhuǎn)染適量的siRNA和載體至SiHa/DDP細(xì)胞中,細(xì)胞置于培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育48 h。

1.3熒光定量PCR實(shí)驗(yàn) 收取分組處理后的細(xì)胞,使用Trizol試劑提取總RNA,使用核酸定量?jī)x檢測(cè)RNA含量,利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,混合2 μL cDNA模板與各0.4 μL的上下游引物和10 μL的Mix以及7.2 μL ddH2O,總反應(yīng)體系為20 μL,然后設(shè)置PCR程序,95 ℃預(yù)變性持續(xù)5 min;95 ℃預(yù)變性持續(xù)10 s;60 ℃退火、持續(xù)30 s,總共循環(huán)40次,上機(jī)進(jìn)行qPCR反應(yīng),以GAPDH為內(nèi)參,反應(yīng)后利用2-△△Ct法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 LncLUCAT1、GAPDH引物序列

1.4MTT實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染后的SiHa/DDP細(xì)胞接種于96孔板中,5×103/孔,置于培養(yǎng)箱24 h后,細(xì)胞分為對(duì)照組與給藥組,分別將0、5、10、20、40、80、160 μg/mL的DDP加入到對(duì)應(yīng)細(xì)胞中,于培養(yǎng)箱中孵育48 h,MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率,每孔添加15 μL MTT溶液并置于37 ℃環(huán)境中孵育30 min,棄掉孔中上清液體并加入150 μL DMSO溶液,酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值(490 nm),DDP半數(shù)抑制濃度(IC50)為抑制50 %細(xì)胞生存能力所需的DDP濃度。使用GraphPad軟件計(jì)算DDP IC50值。

1.5集落克隆實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞按照1.5×103/孔的密度接種于6孔板中,根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組處理后置于37 ℃培養(yǎng)箱約12 d后棄掉培養(yǎng)基,PBS洗滌兩次,室溫下加入4 %的多聚甲醛1 mL,靜置10 min,棄掉多聚甲醛后加入結(jié)晶紫染色30 min,雙蒸水洗凈結(jié)晶紫溶液后,觀察并拍照、計(jì)數(shù)以及分析處理。

1.6Transwell實(shí)驗(yàn) Transwell小室使用基質(zhì)膠包被(遷移實(shí)驗(yàn)無(wú)需此操作),離心消化細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度,在上室中加入無(wú)血清的細(xì)胞懸液,下室中加入含有血清的完全培養(yǎng)基,將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,取出小室并清洗后,使用棉簽擦掉上室中無(wú)遷移/侵襲的細(xì)胞,下室表面細(xì)胞用 0.5 %結(jié)晶紫染色30 min,在顯微鏡下隨機(jī)選取視野拍照,后續(xù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.7Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) 取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期5×105個(gè)細(xì)胞接種于60 mm皿中,分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理,48 h后收取各組細(xì)胞,使用RIPA裂解液冰上裂解細(xì)胞30 min,置于離心機(jī)中12 000 r/mim、4 ℃離心30 min,取上清總蛋白并進(jìn)行定量,加入蛋白上樣緩沖液后加熱變性,然后取適量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上,使用5 %的脫脂牛奶封閉2 h,與稀釋后的一抗在4 ℃環(huán)境孵育過(guò)夜,TPBS洗滌3次,二抗孵育2 h,TPBS洗膜后使用ECL試劑盒發(fā)光顯影,凝膠成像儀獲取蛋白圖像,用 Image J 軟件對(duì)曝光結(jié)果進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果

2.1LncLUCAT1在宮頸癌組織中高表達(dá) 實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)30例宮頸癌和相匹配的正常組織中LncLUCAT1的表達(dá)情況,結(jié)果顯示宮頸癌組織中LncLUCAT1的表達(dá)高于相匹配的正常組織(P<0.05),表明LncLUCAT1 在宮頸癌組織中表達(dá)上調(diào)。見(jiàn)圖1。

圖1 qPCR檢測(cè)LncLUCAT1的表達(dá)水平

2.2下調(diào)LncLUCAT1表達(dá)抑制宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移 LncLUCAT1 siRNA敲低LncLUCAT1表達(dá)后,MTT與集落克隆檢測(cè)SiHa細(xì)胞增殖能力變化,Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲遷移能力變化。結(jié)果顯示與NC對(duì)照組相比,siRNA(siR-1和siR-2)可以明顯干擾LncLUCAT1(P<0.05)的表達(dá),干擾LncLUCAT1表達(dá)后,SiHa細(xì)胞的增殖能力顯著降低(P<0.01),克隆形成能力顯著下降,同時(shí)與NC對(duì)照組相比,干擾組的侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)目減少。以上結(jié)果表明,下調(diào)LncLUCAT1表達(dá)后,SiHa細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力均顯著降低。見(jiàn)圖2。

圖2 下調(diào)LncLUCAT1表達(dá)對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響

2.3LncLUCAT1在SiHa/DDP細(xì)胞中表達(dá)上調(diào) 為研究LncLUCAT1 在宮頸癌細(xì)胞SiHa順鉑(DDP)耐藥中的作用機(jī)制,本研究通過(guò)被動(dòng)增加順鉑(DDP)劑量刺激建立順鉑耐受SiHa細(xì)胞株SiHa/DPP,采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)SiHa/DPP中LncLUCAT1的表達(dá)情況,結(jié)果顯示與正常SiHa細(xì)胞相比,SiHa/DPP中LncLUCAT1表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)。見(jiàn)圖3。

2.4SiHa/DDP細(xì)胞中LncLUCAT1過(guò)表達(dá)與敲低效果驗(yàn)證 LncLUCAT1 siRNA與LncLUCAT1-OE分別轉(zhuǎn)染BGC823細(xì)胞48 h后,qPCR檢測(cè)LncLUCAT1表達(dá)情況。結(jié)果顯示,與NC對(duì)照組相比,LncLUCAT1干擾組SiHa/DDP細(xì)胞中LncLUCAT1表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),與vector組相比,LncLUCAT1-OE組SiHa/DDP細(xì)胞中LncLUCAT1表

圖3 qPCR檢測(cè)SiHa細(xì)胞順鉑(DDP)耐受后LncLUCAT1變化

達(dá)水平顯著升高(P<0.05),以上結(jié)果表明LncLUCAT1 siRNA可以顯著干擾LncLUCAT1表達(dá)以及LncLUCAT1-OE可以顯著增加LncLUCAT1的表達(dá)。見(jiàn)圖4。

圖4 SiHa/DDP中干擾與過(guò)表達(dá)LncLUCAT1表達(dá)

2.5干擾與過(guò)表達(dá)LncLUCAT1對(duì)SiHa/DDP細(xì)胞DDP IC50的影響 NC組與LncLUCAT1-KD (siR-1)組SiHa/DDP細(xì)胞DDP IC50分別為(34.9±5.18)和(21.59±1.91)μg/mL,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),vector組與LncLUCAT1-OE組SiHa/DDP細(xì)胞DDP IC50分別為(35.2±6.30)μg/mL和(49.23±5.11)μg/mL,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明干擾LncLUCAT1表達(dá)降低了SiHa/DDP細(xì)胞的DDP IC50值,而過(guò)表達(dá)LncLUCAT1增加了SiHa/DDP細(xì)胞的DDP IC50值。見(jiàn)圖5。

圖5 干擾與過(guò)表達(dá)LncLUCAT1對(duì)SiHa/DDP細(xì)胞DDP IC50的影響

2.6干擾與過(guò)表達(dá)LncLUCAT1對(duì)SiHa/DDP細(xì)胞中AKT蛋白的影響 SiHa/DDP細(xì)胞中,與NC組相比,LncLUCAT1-KD組p-AKT蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05),與vector組相比,LncLUCAT1-OE組p-AKT蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。結(jié)果表明干擾LncLUCAT1表達(dá)抑制SiHa/DDP細(xì)胞磷酸化AKT蛋白的表達(dá),而過(guò)表達(dá)LncLUCAT1增強(qiáng)了SiHa/DDP細(xì)胞磷酸化AKT蛋白的表達(dá)。見(jiàn)圖6。

圖6 干擾與過(guò)表達(dá)LncLUCAT1對(duì)SiHa/DDP細(xì)胞中AKT蛋白的影響

3 討論

大量的lncRNA被發(fā)現(xiàn)在腫瘤中出現(xiàn)異常表達(dá),并作為腫瘤致癌基因或者腫瘤抑制因子發(fā)揮重要作用。研究報(bào)道,lncRNAs參與多種生理以及病理過(guò)程,包括一些細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖,侵襲遷移,凋亡和耐藥等[9-10]。LncLUCAT1基因定位于人體5號(hào)染色體長(zhǎng)臂1區(qū)4帶(5q14.3),存在6個(gè)外顯子,全長(zhǎng)890 nt。

Sun等[11]研究發(fā)現(xiàn)LncLUCAT1與肺癌患者較差的臨床預(yù)后相關(guān),并通過(guò)抑制p21和p57基因表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞增殖。在卵巢癌中,Yu等[12]研究發(fā)現(xiàn), LncLUCAT1表達(dá)上調(diào),且與腫瘤患者的生存率呈負(fù)相關(guān)。在卵巢癌細(xì)胞中沉默 LncLUCAT1表達(dá)后,細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力均減弱,但凋亡水平增加。進(jìn)一步的研究證實(shí),LncLUCAT1可以通過(guò)miR-612/HOXA13調(diào)控軸促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生發(fā)展[12]。胰腺癌中,過(guò)表達(dá)LncLUCAT1會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖及侵襲遷移能力增加,而干擾LncLUCAT1后則減弱了細(xì)胞的增殖及侵襲能力,細(xì)胞凋亡增加以及影響細(xì)胞周期,導(dǎo)致G0/G1期細(xì)胞增多[13]。在本研究中發(fā)現(xiàn)下調(diào)LncLUCAT1可以抑制宮頸癌SiHa細(xì)胞的增殖,侵襲和遷移。以上研究表明LncLUCAT1在宮頸癌等腫瘤中的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮重要作用。

當(dāng)前,由于化療藥物的使用普遍導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥,嚴(yán)重降低了宮頸癌患者的臨床療效,因此,探究宮頸癌對(duì)DDP的耐藥機(jī)制是必要的。目前已有研究發(fā)現(xiàn)一些lncRNAs在包括宮頸癌在內(nèi)的多種腫瘤對(duì)DDP耐藥中具有重要的調(diào)控作用,例如LncRNA PCAT-1調(diào)控STAT3與PTEN表達(dá)降低宮頸癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感度[14],而 LncLUCAT1在宮頸癌細(xì)胞DDP耐藥中的作用機(jī)制尚不清楚。在本研究中使用DDP逐級(jí)刺激SiHa細(xì)胞產(chǎn)生耐藥,發(fā)現(xiàn)LncLUCAT1在SiHa/DDP細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),同時(shí)干擾LncLUCAT1的表達(dá)可增加SiHa/DDP細(xì)胞對(duì)DDP的敏感度,而過(guò)表達(dá)LncLUCAT1可降低SiHa/DDP細(xì)胞對(duì)DDP的敏感度。同時(shí)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)LncLUCAT1增強(qiáng)了SiHa/DDP細(xì)胞磷酸化AKT蛋白的表達(dá),而干擾LncLUCAT1表達(dá)抑制SiHa/DDP細(xì)胞磷酸化AKT蛋白的表達(dá),以上結(jié)果表明LncLUCAT1可以調(diào)控磷酸化AKT蛋白的表達(dá)。AKT是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,也被稱為蛋白激酶B (PKB)。AKT通路影響著腫瘤細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期、侵襲遷移,細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成以及自噬和凋亡等多種生理活動(dòng),同時(shí)在腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用[15-18]。已有研究表明RAC3可以通過(guò)激活A(yù)KT信號(hào)途徑促進(jìn)宮頸癌對(duì)順鉑耐藥[19]。而本研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌SiHa細(xì)胞對(duì)DDP的耐藥機(jī)制可能與LncLUCAT1調(diào)控的AKT磷酸化表達(dá)有關(guān)。

綜上所述,研究結(jié)果表明LncLUCAT1可以影響宮頸癌SiHa細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移,同時(shí)在SiHa/DDP細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),并降低細(xì)胞對(duì)DDP的敏感度,其機(jī)制可能與調(diào)控AKT的磷酸化表達(dá)有關(guān)。然而其更深層次的分子機(jī)制及體內(nèi)研究仍需進(jìn)一步探討,以期完善宮頸癌的發(fā)病機(jī)制,也為提高順鉑臨床化療效果提供理論依據(jù)。