骨碎補總黃酮對亞硝酸鈉模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用*

汪羽墨,李大龍,崔 悅,張晏航,徐紅丹,,楊 波,孫慧峰,張 寧

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150040;2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院;3.佳木斯大學(xué)藥學(xué)院;4.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)國際文化教育學(xué)院;5.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1]。盡管延緩了認(rèn)知障礙和癡呆的進展,但對這種疾病的成功治療和預(yù)防仍然不足。誘導(dǎo)認(rèn)知障礙的關(guān)鍵因素是β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein,Aβ)沉積,淀粉樣蛋白前體蛋白(amyloid precursor protein, APP)被淀粉樣前體蛋白β-分泌酶(amyloid precursor protein β-secretory enzyme, BACE1)水解生成Aβ[2]。雌激素水平的降低會導(dǎo)致認(rèn)知功能下降,患AD會急劇增加,雌激素和雌激素受體與AD發(fā)病機制關(guān)系密切[3],且能夠改善神經(jīng)系統(tǒng)所誘導(dǎo)的認(rèn)知障礙,植物雌激素在AD中主要通過雌激素受體(ER)改善學(xué)習(xí)記憶能力[4]。中醫(yī)認(rèn)為,治療AD的有效方法是補腎益精填髓,補腎藥方骨碎補總黃酮富含植物雌激素成分[5],無明顯不良反應(yīng)。研究表明,雌激素作為重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子,在腦內(nèi)與雌激素受體β(estrogen receptor β, ERβ)結(jié)合成復(fù)合物,發(fā)揮雌激素樣作用,使機體代謝發(fā)生變化[6]。亞硝酸鈉所致記憶障礙模型,作用機制明確且特異性強,可較好模擬AD的行為及病理特征,亞硝酸鈉進入機體后,致使腦組織缺血缺氧,記憶能力顯著降低。劉新霞等[7]使用亞硝酸鈉引起小鼠記憶障礙。因此,可用亞硝酸鈉制備記憶障礙模型。實驗室前期工作已證明骨碎補總黃酮的有效成分對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠神經(jīng)細胞具有保護作用。鑒于此,本次研究選用亞硝酸鈉誘導(dǎo)AD模型小鼠,并觀察骨碎補總黃酮對淀粉樣蛋白生成途徑相關(guān)蛋白表達的影響及機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 昆明雄性小鼠,3月齡,體重(25.0±4.0)g(購于北京醫(yī)科利昊技術(shù)有限公司SCXK2000-0003),實驗流程符合實驗管理相關(guān)規(guī)定。

1.2試劑與儀器 骨碎補總黃酮(實驗室自提);亞硝酸鈉(01-2512山西磊鑫化工股份有限公司);抗腦衰膠囊(KN16-212502,吉林天藥本草堂有限公司);P-Tau396(bs-3446R)、CDK5(bs-10258R)、APP(bs-12503R)、BACE1(bs-11304R)購于北京博奧森;電泳儀(MiniPROTEANTetra Cell,BIO-RAD);CUT5045石蠟切片機(德國Leica公司);β-actin(BC1026,Abclonal公司)

1.3實驗分組及給藥 將75只小鼠隨機分為5組:空白組(Control)、亞硝酸鈉模型組(Sn)、抗腦衰膠囊組(Kns)、骨碎補總黃酮組(Drf)、骨碎補總黃酮+ICI182780組(Drf+ICI182780)。第1～21 d Kns組定量灌胃抗腦衰膠囊(585 mg/kg·d),Drf組定量灌胃骨碎補總黃酮97.5 mg/(kg·d),Drf+ICI182780組先定量灌胃ICI182780(0.072 mg/kg·d),再給予骨碎補總黃酮97.5 mg/(kg·d),其余組每天注射等量雙蒸水。造模時間為第22～28 d,除空白組外,其余小鼠組進行腹腔注射亞硝酸鈉100 mg/(kg·d)。造模結(jié)束后不再給藥。

1.4行為學(xué)檢測 造模結(jié)束后開始實驗,參照文獻[8-9]進行新物體識別實驗、Morris水迷宮實驗。

1.5取材 將小鼠麻醉后處死,置于冰面上取腦,分離兩側(cè)海馬組織,儲存于-80 ℃冰箱備用。

1.6HE染色 參照文獻[10]進行HE染色,觀察海馬區(qū)神經(jīng)細胞損傷形態(tài),通過組織脫水、切片(厚度設(shè)置為5 μm)、染色,對小鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞的形態(tài)學(xué)狀況進行評價,鏡下采集圖像。

1.7Western blot 參照1.5項下方法提取海馬區(qū)組織,在低溫條件下勻漿,取各組蛋白上清液,進行SDS-PAGE,注入電泳液檢查電泳槽封密性,煮沸時間為5 min,PVDF膜轉(zhuǎn)印,封閉2 h,其中一抗APP、BACE1、過度磷酸化tau蛋白(over-phosphorylated tau protein, P-Tau396)和細胞周期素依賴蛋白激酶5(cyclin-dependent protein kinase 5,CDK5)稀釋比例為1∶500,二抗孵育濃度為1∶2 000,上述過程中均用TBS洗3次,加ECL化學(xué)發(fā)光液至覆蓋均勻,掃描觀察灰度值。

2 結(jié)果

2.1各組小鼠新物體識別能力比較 與Control組相比,Sn組小鼠識別指數(shù)減小(P<0.01);與Sn組相比,Kns組和Drf組小鼠識別指數(shù)增加(P<0.01);與Drf組相比,Drf+ICI182780組小鼠識別指數(shù)減少(P<0.01)。見圖1。

圖1 Drf對Sn小鼠新物體識別實驗的影響

2.2各組小鼠Morris水迷宮水平比較 前2 d為訓(xùn)練期,各組小鼠均呈現(xiàn)下降趨勢;觀察第3、4 d時,Sn組小鼠潛伏期增加(P<0.01),穿越平臺次數(shù)和靶象限停留時間減少(P<0.01);觀察第4 d時,與Sn組相比,Kns和Drf組小鼠潛伏期減少(P<0.01),穿越平臺次數(shù)和靶象限停留時間增加(P<0.01);與Drf組相比,Drf+ICI182780組小鼠潛伏期減少(P<0.01),穿越平臺次數(shù)和靶象限停留時間降低(P<0.01)。見圖2、圖3。

圖2 Drf對Sn模型小鼠定位航行潛伏期

2.3各組小鼠病理結(jié)果比較 Control組海馬區(qū)椎體細胞結(jié)構(gòu)完整,且細胞核及核膜明顯,未出現(xiàn)核固縮現(xiàn)象;Sn組小鼠海馬區(qū)細胞排列紊亂,可見明顯海馬區(qū)錐體細胞壞死、核固縮、完整神經(jīng)細胞數(shù)較空白組明顯減少;Drf及Kns組,完整神經(jīng)細胞數(shù)較多,細胞形態(tài)接近空白組,沒有明顯核固縮現(xiàn)象;Drf+ICI182780組部分細胞縮小、核固縮、胞體變形。見圖4。

圖3 Drf對Sn模型小鼠空間探索的影響

圖4 各組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞病理形態(tài)(HE染色,×200)

2.4骨碎補總黃酮對亞硝酸鈉模型小鼠海馬區(qū)相關(guān)蛋白表達的影響 與Control組相比,Sn組APP、BACE1、CDK5、P-Tau396蛋白表達增加(P<0.01);與Sn組相比,Kns和Drf組APP、BACE1、CDK5、P-Tau396表達減少(P<0.01);與Drf組相比,Drf+ICI182780組小鼠海馬中APP、BACE1、CDK5、P-Tau396表達增加(P<0.01)。見圖5。

圖5 Drf對Sn小鼠海馬APP、BACE1、CDK5、

3 討論

本實驗中所采用的亞硝酸鈉誘導(dǎo)AD小鼠表現(xiàn)出記憶缺陷,侯悅等[11]使用120 mg/kg亞硝酸鈉致AD模型。本研究給予骨碎補總黃酮干預(yù),通過HE染色觀察海馬區(qū)神經(jīng)細胞損傷有所減輕,進一步證實該模型能夠模擬老年性記憶障礙腦內(nèi)異常病理改變。Morris水迷宮實驗表明,亞硝酸鈉模型組小鼠潛伏期增加,穿越平臺次數(shù)減少,表明模型小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的記憶衰退;同時經(jīng)骨碎補總黃酮治療后模型小鼠潛伏期減少,穿越平臺次數(shù)增加,證實骨碎補總黃酮可以增強模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

骨碎補的化學(xué)成分以黃酮類為主,主要作用體現(xiàn)在抑制Aβ沉積[12]。骨碎補總黃酮可降低APP、BACE1、P-Tau396、CDK5的表達,調(diào)節(jié)APP轉(zhuǎn)運減少Aβ的產(chǎn)生。給予ICI182780阻斷劑反向進行驗證,發(fā)現(xiàn)骨碎補總黃酮保護作用顯著降低。Aβ促使多種蛋白激酶誘導(dǎo)Tau蛋白磷酸化,如通過CDK5可以磷酸化P-Tau396[13]。張兆旭等[14]使用CDK5抑制劑能夠減輕Aβ誘導(dǎo)Tau蛋白磷酸化。淀粉樣蛋白生成途徑(APP-BACE1-Aβ)是AD發(fā)病重要病因之一,BACE1在胞外區(qū)被CDK5磷酸化調(diào)節(jié)BACE1的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運并增加其活性[15]。胞外結(jié)構(gòu)域上的CDK5對BACE1進行磷酸化,調(diào)節(jié)BACE1在細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運,提高其活性,被這種磷酸化過程阻斷后,BACE1的活性降低[16]。

研究表明,由于年齡的增長致使雌激素水平下降,雌激素通過調(diào)節(jié)APP代謝產(chǎn)生sAPP,誘導(dǎo)sAPP堆積,拮抗β-淀粉樣蛋白毒性[17-18]。CDK5介導(dǎo)sAPPα的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo),其活性和表達受sAPPα調(diào)控,sAPPα發(fā)揮神經(jīng)保護作用[19]。Jaffe等[20]使用雌激素水平較高的癌細胞,給用藥9 d后呈現(xiàn)出sAPP水平升高。CDK5異常調(diào)節(jié)干擾淀粉樣β蛋白前體(APP)的蛋白水解過程,并通過影響淀粉樣β蛋白前體(Aβ)的三種酶調(diào)節(jié)APP的水解[21]。本實驗結(jié)果表明,骨碎補總黃酮通過與ER結(jié)合降低APP、BACE1、CDK5、P-Tau396蛋白表達,還可以增加ERβ表達,減少P-P38/P38比值,發(fā)揮神經(jīng)保護作用,進而抑制淀粉樣蛋白生成途徑,促進認(rèn)知功能改善。