ICU環(huán)境中耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌耐藥性及同源性分析

羅卓躍 盧鮮萍 鄧建平 段肖麗 吳晶 萬露

[摘要]?目的?了解重癥監(jiān)護病房（intensive?care?unit，ICU）環(huán)境中耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（Carbapenem-resistant?Klebsiella?pneumoniae，CRPK）的分布及同源性，為有效防控院內(nèi)感染提供依據(jù)。方法?2022年5月18日對黃石愛康醫(yī)院ICU環(huán)境進行采樣，監(jiān)測CRKP定植情況，對ICU環(huán)境中的CRKP菌株及該病房已確診感染CRKP患者攜帶病原菌進行耐藥基因及同源性分析。結(jié)果?環(huán)境物表中CRKP分離率為12.90%，且與患者感染菌的耐藥基因均主要為blaKPC-2型（占比83.33%），分析顯示呈高度同源性，相似系數(shù)達92%～98%。結(jié)論?ICU環(huán)境物表中CRKP定植比例較高，多為泛耐藥或全耐藥且具有同源性，提示院內(nèi)環(huán)境開展CRKP主動監(jiān)測的重要性。

[關(guān)鍵詞]?環(huán)境物表；耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌；耐藥基因分型；同源性分析

[中圖分類號]?R37??????[文獻標(biāo)識碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2023.08.023

Homology?analysis?of?resistance?and?homology?of?carbapenem-resistant?Klebsiella?pneumoniae?in?the?ICU?environment

LUO?Zhuoyue，?LU?Xianping，?DENG?Jianping，?DUAN?Xiaoli，?WU?Jing，?WAN?Lu

Department?of?Laboratory，?Huangshi?Aikang?Hospita，?Huangshi?435001，?Huibei，?China

[Abstract]?Objective?To?understand?the?distribution?and?homology?of?carbapenem-resistant?Klebsiella?pneumoniae?（CRPK）?in?intensive?care?unit?（ICU）?environment，?so?as?to?provide?the?basis?for?effective?prevention?and?control?of?nosocomial?infection.?Methods?The?ICU?environment?of?Huangshi?Aikang?Hospital?was?sampled?on?18th?May?2022?to?monitor?CRKP?colonization?and?to?analyze?the?resistance?genes?and?homology?of?CRKP?strains?in?the?ICU?environment?and?pathogens?carried?by?patients?with?confirmed?CRKP?infection?in?this?ward.?Results?The?separation?rate?of?CRKP?in?the?environment?was?12.90%，?and?blaKPC-2?type?was?the?main?drug?resistance?gene?in?the?bacteria?infected?with?patients?（83.33%）.?The?homology?analysis?showed?high?homology，and?similarity?coefficient?reached?92%-98%.?Conclusion?The?proportion?of?CRKP?colonization?in?ICU?ward?environment?is?high，?and?most?of?them?are?pandrug-resistant?or?fully?drug-resistant?with?homology，?suggesting?the?importance?of?active?monitoring?of?CRKP?in?hospital?environment.

[Key?words]?Environment?object?table;?carpenter-resistant?Klebsiella?pneumoniae;?Drug?resistance?genotyping;?Homology?analysis

肺炎克雷伯菌（Klebsiella?pneumoniae，KPN）是常見條件致病菌，廣泛存在于醫(yī)院環(huán)境中，可引起肺炎、血流感染、泌尿系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的醫(yī)院感染，且死亡率高，是醫(yī)院感染的重要病原菌之一[1]。近年來，耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant?Klebsiella?pneumoniae，CRKP）在世界范圍內(nèi)迅速流行[2-3]，已成為嚴重的公共衛(wèi)生負擔(dān)。2022年黃石愛康醫(yī)院ICU病房在短時間內(nèi)檢出多例CRKP感染患者。為控制CRKP菌株繼續(xù)傳播，醫(yī)院微生物學(xué)實驗室協(xié)助院感辦公室對ICU環(huán)境清潔消毒前進行多部位撒網(wǎng)式采樣并對其結(jié)果進行分析，以便查找感染的根源，為醫(yī)院感染防控提供依據(jù)，指導(dǎo)臨床科室醫(yī)務(wù)人員及時采取控制措施，防止交叉感染的發(fā)生，具體如下。

1??資料與方法

1.1??一般資料

2022年5月18日黃石愛康醫(yī)院對重癥監(jiān)護病房（intensive?care?unit，ICU）環(huán)境物表與醫(yī)務(wù)人員手進行采樣，監(jiān)測CRKP定植情況。采樣點包括床單元周圍環(huán)境的高頻接觸部位（床欄、床頭柜、床單、枕套、被套、患者尿袋、心電監(jiān)護儀及臺面、治療車臺面及治療盤、垃圾桶表面等）、公共區(qū)域（大門把手、洗手水池、洗手液支架及水龍頭等）、護士站（桌面、病歷夾、電腦、鼠標(biāo)、鍵盤）、心電圖機及推車等。本研究獲得黃石愛康醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（倫理審批號：2022-HSAKYY-YXLL-?LW-01）。

1.2??方法

1.2.1??檢測方法??無菌拭子浸入無菌生理鹽水后，根據(jù)WS/T367—2012《醫(yī)療機構(gòu)消毒技術(shù)規(guī)范》[4]中的相關(guān)要求，對ICU病房未進行環(huán)境清潔消毒前多個部位撒網(wǎng)式按規(guī)范涂抹式采樣，將采樣棉拭子頭以無菌方式裝入10ml無菌營養(yǎng)肉湯（杭州濱和有限公司提供）中，將采樣后的肉湯管置37℃孵育24h后轉(zhuǎn)種于麥康凱平板（鄭州安圖生物工程股份有限公司提供）。次日選取特征菌落（粉紅色、大而黏、有拉絲）轉(zhuǎn)種麥康凱平板進行純培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)24h后送往黃石市中心醫(yī)院進行質(zhì)譜分析，同時用質(zhì)控菌株KPN（ATCC700603）參與試驗保證質(zhì)量。檢測結(jié)果與KPN的符合率在9.000以上的為待分析菌株。

1.2.2??菌株鑒定與藥敏試驗??用美國BD公司Phoenix100微生物鑒定藥敏系統(tǒng)對已確定的KPN（已通過黃石市中心醫(yī)院質(zhì)譜分析）進行藥敏檢測，任何一種碳青霉烯抗菌藥物耐藥即為CRKP株。同時根據(jù)M100-Ed31抗菌藥物敏感性試驗性能標(biāo)準(zhǔn)[5]對亞胺培南、美羅培南進行藥敏驗證。

1.2.3??耐藥基因（blaKPC）檢測??將檢出的CRKP菌株（包括患者及病房環(huán)境）集中送往第三方醫(yī)學(xué)實驗室進行耐藥基因檢測，采用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase?chain?reaction，PCR）檢測編碼碳青霉烯酶（blaKPC-2、blaNDM-1、blaIMP）。采用寧波基內(nèi)陸生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯類抗生素基因檢測試劑，按說明書要求進行雙向擴增，測序結(jié)果用BLAST進行序列比對以確定耐藥基因亞型。

1.2.4??CRKP菌株同源性分析??將獲得的PFGE圖譜用BioNumerics?7.6數(shù)據(jù)庫軟件進行聚類分析[6]，用非加權(quán)配對算數(shù)平均法進行聚類，條帶位置差異容許度選擇1.5%，優(yōu)化值選擇1.5%，分析分型圖譜，繪出聚類分析圖。

1.3??統(tǒng)計學(xué)描述

采用EXCEL軟件對審核校對后的數(shù)據(jù)進行整理，計數(shù)資料采用例數(shù)（n）和百分比（%）表示。

2??結(jié)果

2.1??不同環(huán)境樣品中KPN的檢出情況

環(huán)境樣本中檢出KPN菌株18例，檢出率為16.51%（18/124）。其中患者床單元周圍環(huán)境的高頻接觸部位類14例（其中床欄4例，氣切霧化面罩、注射泵、尿袋、利器盒及醫(yī)療垃圾桶各2例）、診療器械類2例、醫(yī)務(wù)人員工作服2例，占比分別為11.29%（14/124）、1.61%（2/124）、1.61%（2/124）。

2.2??耐藥性分析

對環(huán)境中18株KPN菌株進行體外藥敏試驗，結(jié)果顯示，16株對亞胺培南、美洛培南耐藥，為CRKP耐藥株，CRKP分離率為12.90%（16/124）；2株為碳青霉烯類抗生素敏感株。再將16株CKPK耐藥株與8株患者感染的CRKP菌株的藥敏結(jié)果進行比對分析，發(fā)現(xiàn)耐藥譜基本一致，均表現(xiàn)為泛耐藥或全耐藥，見表1。

2.3??耐藥基因分析

24株CRKP菌株（包括8例患者病原菌及16株環(huán)境菌株）聚合酶鏈反應(yīng)均擴增出目的條帶，通過測序及在線比對，有20株CRKP菌株的耐藥基因型為blaKPC-2型，4株為blaNDM-1，檢出率分別為83.33%（20/24）、16.67%（4/24），見圖1。

2.4??同源性分析

對分離出的24株CRKP菌進行PFGE分型后得到20條電泳帶（6株患者病原菌和14株環(huán)境標(biāo)本），通過聚類分析，顯示實驗菌株高度相似，相似系數(shù)在92%～98%（85%為界值），見圖2。

3??討論

KPN廣泛存在于醫(yī)院環(huán)境中，是導(dǎo)致院內(nèi)感染的重要條件致病菌。2020年中國CHINET網(wǎng)監(jiān)測顯示，在臨床分離的腸桿科細菌中，CRKP已遠超耐碳青霉烯類大腸桿菌成為排名第1的致病菌[7]。碳青霉烯類抗生素是治療KPN重癥感染的首選藥物，然而隨著碳青霉烯類抗生素的廣泛應(yīng)用甚至濫用，CRKP分離率逐年攀升[8]，且多為全耐藥或泛耐藥菌株，為臨床治療帶來嚴峻挑戰(zhàn)。

CRKP菌株可在患者床單元的空氣及周圍環(huán)境中長期定植，已成為引發(fā)病區(qū)內(nèi)其他患者獲得性感染的重要途徑[9-10]。本研究對ICU病區(qū)清潔消毒前的環(huán)境物表進行采樣，結(jié)果顯示，在患者床單元高頻接觸部位、診療器械及醫(yī)務(wù)人員工作服上均檢出CRKP，且耐藥譜與患者菌株基本一致?；颊叽矄卧哳l接觸部位檢出CRKP的主要是床欄、氣切霧化面罩、注射泵、尿袋、利器盒及醫(yī)療垃圾桶，提示CRKP可定植于患者周圍環(huán)境物表中，且在患者四周近距離擴散，也可通過醫(yī)療操作遠距離的散播，病房環(huán)境成為院內(nèi)感染的重要途徑。而且本研究在醫(yī)務(wù)人員工作服上檢出CRKP，說明工作服有可能成為播散病原菌的媒介，提示日常清潔消毒過程存在盲區(qū)，警示醫(yī)務(wù)人員需注重工作服的清潔與消毒，并在接觸多耐患者時加強隔離防護措施。

KPN醫(yī)院耐藥嚴重，已成為醫(yī)院中的高致死率病原菌之一。本研究結(jié)果顯示，16株環(huán)境物表CRKP菌與8株患者感染CRKP菌呈全耐藥或泛耐藥菌株，對碳青霉烯類、β內(nèi)酰胺酶類、喹諾酮類等耐藥率均達100%，對氨基糖苷類耐藥率>85.0%，對氯霉素耐藥率<30.0%。與沈威[11]研究結(jié)論基本一致。CRKP在臨床治療中已缺乏有效的藥物治療，充分說明強化管理抗菌藥物合理應(yīng)用的緊迫性以及提高耐藥菌環(huán)境防控手段的重要性。

導(dǎo)致KPN對碳青霉烯耐藥的碳青霉烯酶有多種，其中最主要的是質(zhì)粒介導(dǎo)的KPC酶（編碼基因為blaKPC）。研究表明，KPC-Kp與CC258克隆復(fù)合體密切相關(guān)，其中ST11型是中國參與blaKPC-2基因廣泛流行的最主要型別[12]。本研究結(jié)果顯示，檢測出的24株CRKP菌株中有20例為blaKPC-2型陽性菌株，可見醫(yī)院CRKP的主要耐藥機制是產(chǎn)生blaKPC-2型碳青霉烯酶，這與我國其他相關(guān)報道一致[6]。本研究PFGE分型結(jié)果顯示，同一病區(qū)不同患者、不同時間段、不同標(biāo)本所檢出的CRKP菌株、與病房環(huán)境中醫(yī)務(wù)人員高頻接觸部位（包括工作人員工作服、患者床邊醫(yī)療垃圾桶及利器盒等部位）檢出菌株是相似度極高的克隆菌株，可推測污染源來自患者，通過醫(yī)務(wù)人員工作路徑接觸傳播到周圍環(huán)境中，其他患者存在極大感染CRKP風(fēng)險，說明CRKP菌株可通過克隆或通過質(zhì)粒介導(dǎo)在病房內(nèi)傳播并長期穩(wěn)定的定植在病房環(huán)境中。因此，將重點部門多重耐藥菌環(huán)境篩查工作納入院感辦日常監(jiān)測范疇，從而達到有效監(jiān)控多重耐藥菌院內(nèi)感染情況，通過系列管控措施降低物體表面多重耐藥菌的定值，從而減少患者感染的風(fēng)險保障患者安全。

綜上所述，CRKP耐藥情況嚴重且能在ICU病房環(huán)境中長期定植，是引發(fā)醫(yī)院感染的主要傳播方式[11，13]。2018年全國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)監(jiān)測結(jié)果顯示，2020年CRKP菌株的檢出率為4.90%，2020年已上升至10.9%[14]。面對CRKP檢出率持續(xù)增加的嚴峻形勢，遏制CRKP的進一步流行傳播迫在眉睫。但本研究僅對ICU單個病區(qū)進行監(jiān)測，未對耐藥菌株的傳播途徑進行跟蹤分析，后續(xù)將通過對全院重點管控科室的多重耐藥菌動態(tài)監(jiān)測、主動監(jiān)測以及分子水平的耐藥基因檢測等手段對其傳播途徑進行跟蹤分析，為有針對性地制定合理有效的防控措施提供支持。

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（收稿日期：2022–08–29）

（修回日期：2023–02–20）