皮內(nèi)免疫部分劑量組分無細(xì)胞百白破-Sabin株脊髓灰質(zhì)炎聯(lián)合疫苗的免疫持久性

李婧妍，蔡路奎，馬艷，溫嘉納，胡文著，廖宏瑋，史荔，楊凈思

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南 昆明 650118；2.昆明市新發(fā)突發(fā)高致病性病原體疫苗研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化企業(yè)科技創(chuàng)新中心，云南 昆明 650118

隨著全球消滅脊髓灰質(zhì)炎行動計劃的推進(jìn)，各國相關(guān)免疫規(guī)劃已將脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗（inactivated poliovirus vaccine，IPV）和口服脊髓灰質(zhì)炎減毒活疫苗（oral live attenuated poliomyelitis vaccine，OPV）聯(lián)合序貫免疫逐步轉(zhuǎn)換為全程使用IPV［1］。目前，野毒株制備的IPV（wIPV）和Sabin 株制備的IPV（sIPV）產(chǎn)能無法滿足全球需求［2-3］。因此，WHO建議通過減少常規(guī)免疫IPV 的針次、改用皮內(nèi)免疫（intradermal，ID）、使用佐劑等方法減少抗原用量，以緩解該疫苗產(chǎn)能不足的情況［4-6］。皮內(nèi)具有豐富的抗原提呈細(xì)胞，能夠刺激啟動T細(xì)胞反應(yīng)，低劑量抗原進(jìn)行ID 即可誘導(dǎo)等效全劑量肌肉注射（intramuscular，IM）的免疫反應(yīng)［7-9］。2016年，印度成為第一個將ID部分劑量IPV（fIPV）引入常規(guī)免疫的國家［10］。

用IPV與脫毒后的白喉毒素（diphtheria toxin，DT）、破傷風(fēng)毒素（tetanus toxin，TT）、百日咳毒素（pertussis toxin，PT）制備的聯(lián)合疫苗（diphtheria-tetanus-acellular component pertussiss and inactivated poliovirus combined vaccine，DTaP-IPV）進(jìn)行接種可減少疫苗接種針次，提高免疫接種依從性和覆蓋率。中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所已研發(fā)出具有良好的安全性和免疫原性的組分無細(xì)胞百日破-Sabin 株脊髓灰質(zhì)炎聯(lián)合疫苗（diphtheria-tetanus-acellular component pertussis and Sabin-derived inactivated poliovirus vaccine，DTacP-sIPV）［11-13］。與目前已上市的國產(chǎn)共純化百日咳疫苗比較，組分無細(xì)胞百日咳疫苗（acellular component pertussis，acP）具有純度更高和質(zhì)量更穩(wěn)定的抗原組分［14］。以色列NanoPass technologies 公司研發(fā)的用于ID 的皮內(nèi)注射微針MicronJet600 是由3 根長度為0.6 mm 的微針頭組成，易于安裝且操作簡單，能直接將疫苗注射至真皮層［15-16］。前期研究開展了ID 部分劑量sIPV 的免疫原性研究，結(jié)果表明，ID 1／12 劑量含佐劑的sIPV 即可獲得IM 全劑量sIPV 的相同免疫效果［17］。本研究采用MicronJet600對部分劑量DTacP-sIPV 進(jìn)行ID，評價其免疫持久性，以期為ID 部分劑量DTacP-sIPV 的臨床前研究和應(yīng)用提供實(shí)驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 疫苗及菌株 DTacP-sIPV 由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所自主研發(fā)并制備，百日咳桿菌菌株（BP-L1，2019 年）由該研究所分離獲得（等位基因ptxA1、prn2、fhaB1、fim3A和ptxP3與當(dāng)前流行菌株D420一致［18-19］）。

1.2 主要試劑 DT、TT、PT、絲狀血凝素（filamentous haemagglutinin，F(xiàn)HA）和百日咳黏附素（pertactin，PRN）均由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所制備及保存；HRP 標(biāo)記的兔抗大鼠IgG 購自美國Abcam 公司；單組TMB 底物顯色液購自北京索萊寶科技有限公司；包姜氏瓊脂培養(yǎng)基購自海博生物技術(shù)有限公司；炭瓊脂培養(yǎng)基購自英國Oxoid公司；脫纖維羊血購自南京樂診生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 實(shí)驗動物 SPF 級Wistar 大鼠，雌雄各半，1 月齡，體質(zhì)量180～220 g，購自湖南天勤生物科技有限公司，動物飼養(yǎng)于無特定病原體環(huán)境中，動物使用許可證號為：SYXK（滇）K2019-0003。所有的動物實(shí)驗均符合有關(guān)法律、制度、指導(dǎo)原則及赫爾辛基宣言的道德標(biāo)準(zhǔn)，已通過所在地動物實(shí)驗倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號為：DWSP201911022）。

1.4 動物分組及給藥 將Wistar 大鼠隨機(jī)分為4 組：1／5D ID、1／10D ID、全劑量IM及空白對照組，每組10只，雌雄各半。用0.9%氯化鈉溶液將DTacP-sIPV按1∶5 和1∶10 的體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行稀釋，獲得1／5 和1／10劑量的DTacP-sIPV，1／5D 及1／10D ID 組分別經(jīng)大鼠后腿進(jìn)行ID，每只大鼠左右腿各0.05 mL；全劑量IM 組經(jīng)大鼠后腿IM 全劑量DTacP-sIPV，每只大鼠左右腿各0.25 mL；空白對照組分別經(jīng)大鼠后腿進(jìn)行ID PBS，每只大鼠左右腿各0.05 mL。于0、1、2 月共免疫3 次，末次免疫后12 個月經(jīng)尾靜脈采血，分離血清，-20 ℃保存。

1.5 脊髓灰質(zhì)炎病毒中和抗體滴度的測定 各組大鼠血清經(jīng)56 ℃滅活30 min，采用微量中和試驗法檢測抗脊髓灰質(zhì)炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型中和抗體滴度［11，20］，能夠保護(hù)50% Hep-2細(xì)胞不受100 CCID50攻擊脊髓灰質(zhì)炎病毒液感染的血清最高稀釋度即為該血清的中和抗體滴度，中和抗體滴度≥1∶8判為陽性，計算抗體幾何平均滴度（geometric mean titer，GMT）。

1.6 百白破血清IgG抗體滴度的測定 采用間接ELISA法檢測大鼠血清中抗DT、TT、PT、FHA、PRN 的IgG抗體滴度，以陰性血清2.1 倍A450為判斷終點(diǎn)，特異性抗體的終點(diǎn)滴度以最高稀釋度的倒數(shù)表示［21］，并計算GMT。免疫后抗體滴度比免疫前增長倍數(shù)≥4時判為血清陽轉(zhuǎn)。

1.7 百日咳桿菌氣霧攻擊試驗 將百日咳桿菌用含15%羊血和10%甘油的包姜氏瓊脂培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)6 d；用接種環(huán)收集菌苔至0.9%氯化鈉溶液中，稀釋至1011CFU／mL，用于氣霧攻擊試驗。于末次免疫12 個月后，各組大鼠經(jīng)霧化吸入百日咳桿菌氣霧進(jìn)行攻擊，攻擊時間為30 min［22］。氣霧攻擊后2、5及14 d，經(jīng)大鼠尾靜脈采全血300 μL，EDTA 抗凝，血球計數(shù)儀檢測白細(xì)胞數(shù)；各時間點(diǎn)每組取4 只大鼠，經(jīng)頸椎脫臼處死，無菌取肺組織及氣管，加入1 mL 0.9%氯化鈉溶液，研磨為勻漿液，用PBS 分別進(jìn)行10、100、1 000倍稀釋。用200 μL PBS沖洗小鼠鼻腔，收集鼻灌洗液。分別取稀釋后的肺組織及氣管勻漿液、鼻灌洗液各50 μL，涂布于6 cm 炭瓊脂培養(yǎng)基血平皿中，37 ℃孵育4 d，計算菌落克隆形成數(shù)（colony-forming unit，CFU）。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用GraphPad Prism 9.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析及繪圖，組間GMT、白細(xì)胞數(shù)量、CPV的比較采用方差（ANOVA）分析，組間陽性率比較采用Fisher檢驗，均以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 脊髓灰質(zhì)炎病毒中和抗體滴度 空白對照組脊髓灰質(zhì)炎病毒中和抗體log2GMT 為4，陽性率為0。與全劑量IM 組比較，1／5D ID 組Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒中和抗體log2GMT 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F分別為1.69、2.54、10.64，P均＞0.05）；1／10D ID 組Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒中和抗體log2GMT 顯著降低（F= 10. 64，P＜0.001），Ⅰ和Ⅱ型差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F分別為1.69 和2.54，P均＞0.05），見表1。與全劑量IM 組比較，1／5D 和1／10D ID 組脊髓灰質(zhì)炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型中和抗體陽性率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05），見表2。

表1 各組大鼠血清中抗脊髓灰質(zhì)炎病毒中和抗體水平（log2GMT，，n=10）Tab. 1 Level of neutralizing antibody against poliovirus in serum of rats in each group（log2GMT，，n=10）

表1 各組大鼠血清中抗脊髓灰質(zhì)炎病毒中和抗體水平（log2GMT，，n=10）Tab. 1 Level of neutralizing antibody against poliovirus in serum of rats in each group（log2GMT，，n=10）

組別1／5D ID 1／10D ID全劑量IM空白對照Ⅰ型5.47 4.69 6.35 2.00Ⅱ型3.88 2.82 4.65 2.00Ⅲ型6.45 4.48 8.30 2. 00

表2 各組大鼠血清中抗脊髓灰質(zhì)炎病毒中和抗體陽性率（%）Tab. 2 Positive rate of neutralizing antibody against poliovirus in serum of rats in each group（%）

2.2 百白破血清IgG抗體的水平 空白對照組大鼠百白破血清抗體水平較低，log2GMT在5.74～7.64范圍內(nèi)。1／10D ID 組抗DT、TT、PT 的IgG 抗體log2GMT 均顯著低于1／5D ID 組和全劑量IM 組（F分別為14.60、7.351 和5.584，P均＜0.05），抗FHA 的IgG 抗 體log2GMT顯著低于全劑量IM 組（F=5.29，P＜0.05），抗PRN 的IgG 抗體log2GMT 顯著低于1／5D ID 組（F= 3.41，P＜0.05），見表3。空白對照組百白破IgG抗體陽性率均為0，其他各組均為100%。

表3 各組大鼠百白破血清IgG抗體水平（log2GMT，，n=10）Tab.3 Level of serum IgG antibodies against DTP in rats of each group（log2GMT，，n=10）

表3 各組大鼠百白破血清IgG抗體水平（log2GMT，，n=10）Tab.3 Level of serum IgG antibodies against DTP in rats of each group（log2GMT，，n=10）

組別1／5D ID 1／10D ID全劑量IM空白對照PT 16.74 15.84 16.94 6.04 FHA 17.44 16.64 17.74 6.74 PRN 15.94 14.54 15.34 5.74 DT 18.54 16.64 18.24 7.64 TT 17.34 16.34 17.74 5.94

2.3 百日咳桿菌氣霧攻擊后大鼠的白細(xì)胞數(shù) 與攻擊后2 d比較，空白對照組大鼠經(jīng)百日咳桿菌氣霧攻擊后5 d 的白細(xì)胞數(shù)明顯升高（F=3.48，P＜0.05），隨后開始下降；其他組均隨時間的延長保持平穩(wěn)（F=0.14 ～1.30，P＞0.05）。攻擊后5 d，空白對照組大鼠白細(xì)胞數(shù)顯著高于1／10D ID 和全劑量IM 組（F=5.046，P＜0.05）。見圖1。

2.4 百日咳氣霧攻擊后大鼠肺、氣管、鼻的細(xì)菌定植情況 氣霧攻擊后，空白對照組大鼠肺部細(xì)菌載量明顯高于其他3 組（F= 19. 00～206. 00，P＜0.05），攻擊后14 d 仍可檢測到百日咳桿菌；除空白對照組外，其他3 組大鼠肺部細(xì)菌載量均于攻擊后5 d 達(dá)峰值，14 d 時基本清除，各時間點(diǎn)組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=1.14～1.25，P＞0.05）。空白對照組各時間點(diǎn)氣管和鼻部細(xì)菌載量略高于其他組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F= 0.71～3.54，P＞0.05）；除空白對照組外，其他3 組大鼠氣管和鼻部細(xì)菌載量較接近，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.75～3.41，P＞0.05）。見表4。

表4 氣霧攻擊后各組大鼠肺部、氣管及鼻灌洗液中百日咳桿菌細(xì)菌載量（lgCFU，，n=4）Tab. 4 B.pertussis loads in lung homogenate，tracheal homogenate and nasal lavage fluid of rats in each group after aerosol challenge（lgCFU，，n=4）

表4 氣霧攻擊后各組大鼠肺部、氣管及鼻灌洗液中百日咳桿菌細(xì)菌載量（lgCFU，，n=4）Tab. 4 B.pertussis loads in lung homogenate，tracheal homogenate and nasal lavage fluid of rats in each group after aerosol challenge（lgCFU，，n=4）

組別1／5D ID 1／10D ID全劑量IM空白對照肺2 d 1.92 1.73 2.78 6.48 5 d 2.26 3.14 3.16 6.66 14 d 0.00 0.00 0.00 4.33氣管2 d 3.30 3.29 1.69 3.86 5 d 2.39 3.82 2.53 4.73 14 d 2.16 2.66 2.78 3.09鼻2 d 1.64 1.41 2.25 2.65 5 d 3.06 3.29 3.25 3.60 14 d 1.05 1.43 2.29 2.16

3 討論

多項研究證明，ID 可在降低疫苗抗原使用量的情況下，誘導(dǎo)良好的免疫應(yīng)答反應(yīng)［23-24］，已完成ID 部分劑量DTacP-sIPV 免疫原性及安全性研究結(jié)果表明，基礎(chǔ)免疫3 劑次后，ID 1／5D DTacP-sIPV 的免疫水平與IM 全劑量DTacP-sIPV 的免疫水平相近［18］。本研究結(jié)果表明，3 劑次ID 1／5D DTacP-sIPV 12 個月后，可維持較高的抗體滴度，疫苗各組分間無干擾作用，其中百白破組分的持續(xù)性免疫效果較好；脊髓灰質(zhì)炎組分的中和抗體滴度均有所下降，需對其進(jìn)行加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫效果有待后續(xù)進(jìn)一步研究。3劑次ID 1／5D DTacP-sIPV 12個月后，各組分的GMT與全劑量IM 組DTacP-sIPV 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），提示ID 1／5D DTacP-sIPV 可誘導(dǎo)較高水平的免疫應(yīng)答，效果與全劑量IM 組DTacP-sIPV 相近。3 劑次免疫后12 個月，各免疫組百白破血清陽性率仍達(dá)100%，1／5D ID 組脊髓灰質(zhì)炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型中和抗體陽性率為90%、70%、100%，與全劑量IM 組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），1／10D ID組各型脊髓灰質(zhì)炎病毒中和抗體陽性率降至40%～70%。有研究表明，單獨(dú)ID sIPV 3 劑次后12 個月，全劑量IM 組脊髓灰質(zhì)炎病毒中和抗體陽性率維持在80%以上，1／5D 組70%以上，1／10D 組50%以上［25］，該結(jié)果與本研究相符。3 劑次基礎(chǔ)免疫12 個月后，1／10D ID 組疫苗各組分抗體滴度及陽轉(zhuǎn)率均低于1／5D ID 組及全劑量IM 組，1／5D ID 組末次免疫12 個月后的抗體水平及陽性率與全劑量IM 組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有良好的免疫持久性。

大鼠百日咳桿菌氣霧攻擊試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各疫苗組末次免疫12 個月后對百日咳桿菌攻擊仍具有保護(hù)效果，其白細(xì)胞數(shù)量呈平穩(wěn)狀態(tài)，無明顯變化（P＞0.05）。空白對照組大鼠在百日咳桿菌氣霧攻擊后出現(xiàn)明顯的百日咳感染癥狀，白細(xì)胞數(shù)量持續(xù)增加，在攻擊后5 d 達(dá)峰值，隨后下降（P＜0.05）；氣霧攻擊后大鼠肺部檢測到百日咳桿菌，5 d 達(dá)峰值，14 d 仍未清除，肺部的百日咳桿菌菌落數(shù)顯著高于其他各組（P＜0.05）；除空白對照組外，其他3 組大鼠在氣霧攻擊感染初期，肺、氣管、鼻灌洗液可檢測到少量百日咳桿菌定植，感染14 d 后百日咳桿菌基本被清除，3 組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），證明各組疫苗免疫12 個月后對百日咳仍具有較好的保護(hù)效果。

綜上所述，ID 1／5D DTacP-sIPV 可誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生各組分相應(yīng)的保護(hù)性抗體，且免疫效果及其免疫持久性與全劑量IM 相近，12個月后對百日咳桿菌攻擊仍具有良好的保護(hù)效果。本研究為ID 部分劑量DTacP-sIPV免疫策略的制訂提供了實(shí)驗依據(jù)。