一株纖維素降解菌株篩選及在低溫好氧堆肥起爆應(yīng)用

周東興，劉 煜，葛 閆，李云飛，路濟(jì)陽(yáng)，楊妍娜，王 旭

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030）

根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部《全國(guó)農(nóng)作物秸稈綜合利用情況報(bào)告》顯示，2021年全國(guó)農(nóng)作物秸稈利用量6.47億t，綜合利用率達(dá)88.1%，但大量農(nóng)業(yè)廢棄物仍是主要污染環(huán)境因素[1]。好氧堆肥是作物秸稈無(wú)害化處理與資源利用的重要方式[2]。但秸稈堆肥中，纖維素是作物秸稈中含量最高的一類(lèi)物質(zhì)，纖維素與半纖維素以及木質(zhì)素等物質(zhì)所組成的復(fù)雜空間結(jié)構(gòu)通常阻礙微生物對(duì)秸稈資源利用，因此，提高堆肥系統(tǒng)對(duì)纖維素降解效率尤為重要[3]。中國(guó)東北地區(qū)，一年中有4～5 個(gè)月環(huán)境溫度在0 ℃以下，內(nèi)外溫差導(dǎo)致堆肥系統(tǒng)熱量向外流失，環(huán)境溫度在15 ℃以下時(shí)，微生物代謝活性降低，堆肥過(guò)程中溫度上升困難，最終堆肥失敗。低溫環(huán)境下堆肥迅速起溫是決定堆肥進(jìn)入高溫期、實(shí)現(xiàn)無(wú)害化的關(guān)鍵步驟。低溫環(huán)境中，中溫菌和高溫菌難以降解堆肥中的大分子有機(jī)物質(zhì)，維持生長(zhǎng)繁殖。傳統(tǒng)的解決方法是加入糖、蛋白質(zhì)等微生物易于利用的化學(xué)物質(zhì)作物作為起爆劑，增加起始階段微生物活性[4]。復(fù)配接種耐冷或嗜冷等活性微生物，實(shí)現(xiàn)低溫發(fā)酵啟動(dòng)是目前研究熱點(diǎn)。細(xì)菌具有較強(qiáng)抗逆性，是對(duì)耐冷或嗜冷微生物篩選的主要研究對(duì)象。Melo 等在南北極環(huán)境中分離具有較高纖維素分解能力的微生物[5]，Chevalier 等在南極湖泊中篩選出耐冷藍(lán)細(xì)菌[6]，Dai 等在青海高原中分離出可在低溫環(huán)境中生存，具有降解纖維素與幾丁質(zhì)能力的微生物種群[7]。除極地與高原極端環(huán)境以外，寒冷地區(qū)土壤中也有相關(guān)微生物被篩選分離的研究報(bào)道，Sun等在寒冷地區(qū)土壤中篩選一株嗜冷細(xì)菌Pseudomonas sp.[8]。

細(xì)菌同時(shí)也是堆肥過(guò)程中最重要和最豐富的微生物，硬壁菌門(mén)與變形菌門(mén)是堆肥細(xì)菌中主要門(mén)類(lèi)[9]。許多細(xì)菌接種劑均由硬壁菌門(mén)中芽孢桿菌屬的微生物制備，Yin等研究表明，硬壁菌門(mén)微生物可耐受高溫環(huán)境，在堆肥中高溫階段最為豐富[10]。硬壁菌門(mén)微生物作為接種劑，在堆體處于較低溫度前期可能達(dá)不到理想效果。變形菌門(mén)微生物在許多秸稈堆肥中被認(rèn)為是關(guān)鍵因素，在堆肥升溫期與高溫期均占主導(dǎo)地位，更適合作為堆肥初期接種微生物[11]。

本試驗(yàn)從寒地農(nóng)田腐爛玉米秸稈碎塊中篩選耐低溫纖維素降解菌株，通過(guò)顯微形態(tài)檢測(cè)、菌株生理生化特征檢驗(yàn)，以及16S rDNA 分子鑒定方式鑒定菌株，結(jié)合同類(lèi)型菌株培養(yǎng)結(jié)果優(yōu)化培養(yǎng)條件響應(yīng)面，優(yōu)化最佳培養(yǎng)條件。同時(shí)，利用小型低溫堆肥試驗(yàn)驗(yàn)證其啟動(dòng)效果，旨在為低溫環(huán)境下秸稈好氧堆肥處理提供新的菌株資源。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)向陽(yáng)試驗(yàn)示范基地農(nóng)場(chǎng)收集農(nóng)田腐爛玉米秸稈碎塊及周?chē)寥罉悠贰?/p>

1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：CMC-Na 15.0 g，(NH4)2SO41.0 g，酵母浸粉1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO4·2H2O 1.0 g，NaCl 0.3 g，去離子水1 L，pH為7[12]。

鑒別培養(yǎng)基：CMC-Na 1.5 g，酵母浸粉0.1 g，蛋白胨0.2 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，K2HPO4·2H2O 1.0 g，NaCl 0.25 g，Agar 4 g，去離子水200 mL，pH為7[13]。

LB培養(yǎng)基（Luria-Bertani）：蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，NaCl 10 g，去離子水1 L[14]。

休-利夫森培養(yǎng)基（Hugh-Leifson medium）：蛋白胨2 g，K2HPO4·2H2O 0.2 g，NaCl 5 g ，葡萄糖10 g，Agar 6 g，溴麝香草酚藍(lán)1%水溶液3 mL，去離子水1 000 mL，pH為7[15]。

1.3 菌種篩選

1.3.1 菌種初篩

在無(wú)菌環(huán)境下，將采集的土壤及玉米秸稈碎塊混合樣品粉碎后稱取1 g，加入裝有10 mL 蒸餾水離心管中，在振蕩器上震蕩30 min，吸取懸濁液1 mL 加入富集培養(yǎng)基，將樣品180 r·min-1，30 ℃富集培養(yǎng)72 h。將富集培養(yǎng)的菌液梯度稀釋成10-6、10-7、10-83 個(gè) 濃 度 梯 度，吸 取0.1 mL 菌液，在鑒別培養(yǎng)基中涂布培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程中保持環(huán)境溫度5 ℃。利用剛果紅染色法初篩菌株，為防止細(xì)菌降解剛果紅產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果，用培養(yǎng)后染色方法初期鑒別。菌株培養(yǎng)72 h 后，在鑒別培養(yǎng)基中添加1 mg·mL-1剛果紅溶液，10～15 min后，倒去剛果紅溶液，加入1 mol·L-1NaCl 溶液，15 min后倒掉NaCl 溶液，選取菌落周?chē)霈F(xiàn)透明圈菌株備用[16]。

將以上分離單菌落菌株分離純化后，用培養(yǎng)前染色方式研究菌株纖維素能力。將菌株接種到添加有10 mg·mL-1剛果紅溶液的鑒別培養(yǎng)基中央。纖維素降解能力以水解圈（R）與菌落半徑（r）比值為指標(biāo)，記錄鑒別培養(yǎng)基中水解圈半徑和菌落半徑。

1.3.2 菌種復(fù)篩

濾紙崩解試驗(yàn)：選取初篩單菌落，接種LB 培養(yǎng)基，25 ℃恒溫180 r·min-1培養(yǎng)72 h；將10 cm2定量濾紙片加置培養(yǎng)基中，25 ℃恒溫120 r·min-1，以不添加菌株作為空白對(duì)照，培養(yǎng)72 h，根據(jù)濾紙破損程度分析菌株降解能力。

纖維素酶活性測(cè)定：選濾紙崩解復(fù)篩單菌落，接種LB 培養(yǎng)基中，25 ℃恒溫160 r·min-1培養(yǎng)72 h得到菌液，將菌液使用紗布過(guò)濾，過(guò)濾后12 000 r·min-1離心5 min，取上清液制成粗酶液。在試管中加入1.5 mL 0.5%CMC-Na 的檸檬酸緩沖液，再加入0.5 mL 粗酶液，輕輕搖晃混合均勻，在50 ℃水浴鍋中處理30 min 后取出立即按DNS 法測(cè)定糖[17]。通過(guò)還原的葡萄糖含量確定室溫條件下（25 ℃）酶活性。

1.4 菌種鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定

將待鑒定菌株在鑒別培養(yǎng)基劃線得到單菌落，觀察其菌落形態(tài)。將菌株復(fù)染色，在透射電鏡下觀察其微觀形態(tài)。

1.4.2 生理生化鑒定

生理生化特征檢測(cè)參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行鑒定[14]。微生物利用各種糖、醇類(lèi)物質(zhì)發(fā)酵特性使用休-利夫森培養(yǎng)基進(jìn)行鑒別，將待測(cè)物質(zhì)按比例添加用以代替培養(yǎng)基中葡萄糖。

1.4.3 分子生物學(xué)鑒定

使用引物27F/1492R[由生工生物工程（上海）股份有限公司合成]擴(kuò)增16S rDNA 片段。PCR（Polymerase Chain Reaction）反應(yīng)體系與反應(yīng)程序如下。

PCR 反應(yīng)體系（25 μL）：ddH2O 9.5 μL，模板DNA 1 μL，引物27F 1 μL，引物1492R 1 μL，50 mmol·L-1MgSO4，5 U·μL-1TaqDNA 聚合酶，10 mmol·L-1dNTP，PCR緩沖液共12.5 μL。

PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)30 次，72 ℃延伸10 min。

用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序獲得的16S rDNA 基因序列與GenBank 中相關(guān)數(shù)據(jù)分析同源性，分別下載與其同源性最高的序列，用MEGA 5.0 軟件“W”功能比對(duì)并手工校正后，使用MEGA 5.0 軟件鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.5 響應(yīng)面法優(yōu)化

根據(jù)菌株鑒定結(jié)果，結(jié)合同屬菌株生物學(xué)特性及發(fā)酵參數(shù)，根據(jù)實(shí)際堆肥環(huán)境指標(biāo)，以溫度、pH 及接種量3 種因素作為自變量，培養(yǎng)菌液紫外吸光度（OD600）值作為響應(yīng)變量，試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)[18]。對(duì)該菌株進(jìn)行3 因素5 水平正交旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)，利用響應(yīng)面進(jìn)行建模優(yōu)化最適生長(zhǎng)條件。完成二次回歸擬合及方差分析檢驗(yàn)，得出各變量最佳參數(shù)，檢驗(yàn)?zāi)Ｐ蛿M合結(jié)果。

1.6 堆肥起爆研究

1.6.1 接種劑制備

挑取純化后菌株單菌落接種至LB 培養(yǎng)基培養(yǎng)，調(diào)整菌液濃度為1×109cfu·mL-1，制成接種劑備用。

1.6.2 小型堆肥起爆試驗(yàn)

以玉米秸稈為原料進(jìn)行堆肥起爆試驗(yàn)。堆肥試驗(yàn)在堆肥容器中進(jìn)行，堆肥容器為聚苯乙烯泡沫箱，尺寸為460 mm×410 mm×340 mm（長(zhǎng)×寬×高），箱內(nèi)壁厚度為50 mm，將玉米秸稈粉碎至1～2 cm，填充至堆肥箱中，約2 kg干物質(zhì)，添加尿素調(diào)整碳氮比為30:1，含水率控制在65%，設(shè)置接種組以及空白對(duì)照組，每個(gè)處理組3次重復(fù)。接種組（J）參考《農(nóng)用微生物菌劑》（GB 20287-2006）要求，按照秸稈干重2%添加接種劑[19]。對(duì)照組（CK）添加相同量水。接種后，堆體充分?jǐn)嚢杈鶆?。堆肥全程在恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行，溫度保持在5 ℃，每隔12 h測(cè)溫并翻動(dòng)堆體保證氧氣供應(yīng)。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Excel 2019與R 4.2.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，標(biāo)準(zhǔn)誤差用Excel 2019 計(jì)算，顯著性檢驗(yàn)用R 4.2.0 中t.test 函數(shù)進(jìn)行t檢驗(yàn)（P＜0.01 為極顯著）。使用Rstudio進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化。Design Expert 10.0軟件分析響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果，建立回歸模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫纖維素降解菌株初篩

篩選得到一株在培養(yǎng)溫度為5 ℃下，鑒別平板上具有降解圈菌株，編號(hào)為L(zhǎng)YG-01（見(jiàn)圖1），剛果紅試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該菌株菌落半徑為4.00 mm，剛果紅降解圈半徑為10.67 mm。降解圈半徑與菌落半徑之比為2.74。該比值大于2時(shí)，一般認(rèn)為該微生物具有一定纖維素酶活性[20]。剛果紅染色法因剛果紅易被分解，可能出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，需作復(fù)篩試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖1 LYG-01的菌落形態(tài)與顯微形態(tài)Fig.1 Colony morphology and micromorphology of LYG-01

2.2 木質(zhì)纖維素降解能力復(fù)篩驗(yàn)證

復(fù)篩菌株纖維素降解能力。①濾紙崩解試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，72 h后，接種菌劑的培養(yǎng)基內(nèi)濾紙成團(tuán)糊狀，證明篩選菌株具有降解木質(zhì)纖維素的能力。②檢測(cè)菌株纖維素酶活性試驗(yàn)。通過(guò)測(cè)定菌液制粗酶液酶活性，證實(shí)該菌株有纖維素降解能力，通過(guò)DNS 法測(cè)定該菌株纖維素酶活性為1.77 U·mL-1。

2.3 菌株鑒定

2.3.1 菌株形態(tài)學(xué)鑒定

菌株形態(tài)如圖1所示，單菌落為圓形、表面光滑、濕潤(rùn)、菌落顏色為白色、不透明，挑取菌落呈黏稠狀。使用透射電鏡觀察其顯微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，該菌呈桿狀，有鞭毛，菌體長(zhǎng)1～2 μm，寬約1 μm。

2.3.2 菌株分子生物學(xué)鑒定

系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（見(jiàn)圖2）顯示菌株LYG-01 與Lelliottia屬菌[Lelliottiasp. GL2（KM458060）]的親緣關(guān)系最近（相似性99.93%），結(jié)合其形態(tài)特征，將LYG-01 鑒定為L(zhǎng)elliottia屬一種（Lelliottiasp.）。按分類(lèi)學(xué)而言，該菌屬于變形菌門(mén)，γ-變形菌綱，腸桿菌目，腸桿菌科，Lelliottia屬。

圖2 菌株LYG-01系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of strain LYG-01

2.3.3 生理生化檢驗(yàn)

生理生化特征結(jié)果顯示，該菌種同變形菌門(mén)微生物一致，均為革蘭氏陰性細(xì)菌。接觸酶活性呈陰性。除可降解纖維素外，可利用淀粉以及阿拉伯糖。不能利用乳糖，蔗糖及葡萄糖發(fā)酵，表明該菌株屬于好氧型細(xì)菌。甲基紅試驗(yàn)呈陰性，說(shuō)明該菌株為腸桿菌一種，與系統(tǒng)發(fā)育分類(lèi)結(jié)果一致。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.4.1 響應(yīng)面試驗(yàn)方案與結(jié)果

選取3個(gè)對(duì)培養(yǎng)條件影響較大同時(shí)易于控制的因素pH，溫度以及接種量，以菌液吸光度作為響應(yīng)值建立模型。以pH 為6.8，溫度為20 ℃，接種量為3%作為中心值建立3 因素5 水平正交旋轉(zhuǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)（見(jiàn)表1）。使用Design Expert 10.0得到具體試驗(yàn)方案（見(jiàn)表2）。

表1 各因子與水平Table 1 Factors and levels

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Response surface test scheme and results

2.4.2 回歸方程與方差分析

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，運(yùn)用響應(yīng)曲面法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)式擬合，得出三因素與響應(yīng)變量OD600之間二次多項(xiàng)式方程如下：

其中，A為pH；B為溫度；C為接種量；Y為OD600。

對(duì)上述方程進(jìn)行方差分析，模型F值為10.54，表明該模型擬合結(jié)果顯著（見(jiàn)表3）。模型F值可能因干擾因素出現(xiàn)的概率僅為0.92%，表明該擬合結(jié)果具有高度顯著性，該模型符合良好預(yù)測(cè)。根據(jù)回歸模型標(biāo)準(zhǔn)化系數(shù)絕對(duì)值可見(jiàn)，生長(zhǎng)條件因素對(duì)菌體生長(zhǎng)影響作用順序?yàn)椋簻囟龋窘臃N量＞pH。而交互項(xiàng)中顯著性影響因素從強(qiáng)到弱依次是溫度與接種量、pH與溫度、pH與接種量。二次項(xiàng)中顯著性影響因素從強(qiáng)到弱依次為溫度、pH、接種量。

表3 模型方差分析Table 3 ANOVA of the model

對(duì)回歸模型進(jìn)一步分析處理，可知在試驗(yàn)設(shè)計(jì)各因素水平范圍內(nèi)，其他因素為中間水平時(shí)，OD600與pH、溫度以及接種量間關(guān)系如圖3 所示。當(dāng)三因素均為較低水平時(shí)，pH 的主效應(yīng)高于溫度與接種量，pH 和接種量的數(shù)值相近；當(dāng)三因素為較高水平時(shí)，溫度主效應(yīng)高于pH和接種量。

圖3 單因素對(duì)吸光度的影響Fig.3 Effects of single factor on OD600

2.4.3 響應(yīng)面曲線圖與等高線圖分析

響應(yīng)曲面坡度及等高線偏離程度可反映兩兩因素間交互作用，響應(yīng)面坡度越陡，表明二者間交互作用越顯著，對(duì)微生物培養(yǎng)的影響較大，反之越平緩則影響越小。各因素交互作用響應(yīng)曲面圖以及等高線圖如圖4 所示。pH 與溫度、溫度與接種量交互作用顯著高于pH與接種量交互作用，該結(jié)果與回歸模型方程中方差分析檢驗(yàn)結(jié)果一致。

圖4 三因素交互作用的響應(yīng)面和等值線Fig.4 Response surface and contour plots for three factor interaction

由圖4a所示，接種量固定在零水平3%時(shí)，菌液濃度隨溫度升高而升高，隨pH 升高先升后降，溫度和pH有一定負(fù)交互作用。由圖4b所示，當(dāng)溫度固定在零水平20 ℃時(shí)，菌液濃度隨接種量濃度升高而升高，隨pH升高先升后降，接種量和pH有一定負(fù)交互作用。由圖4c所示，當(dāng)pH固定在零水平6.8 時(shí)，菌液濃度隨溫度以及接種量升高而升高，說(shuō)明溫度與接種量為正交互作用。

通過(guò)對(duì)曲線圖與等高線圖分析可得出，響應(yīng)面存在最大值，通過(guò)Design Expert 10.0分析結(jié)果表明，當(dāng)pH 為6.8，培養(yǎng)溫度為24.18 ℃，接種量達(dá)3.12%時(shí)，為該菌株最適培養(yǎng)條件。

2.5 堆肥效果試驗(yàn)

小型低溫堆肥試驗(yàn)溫度變化規(guī)律顯示（見(jiàn)圖5），以溫度達(dá)到50 ℃作為高溫階段閾值，處理組在第72 h 已達(dá)到50.3 ℃，進(jìn)入高溫階段，對(duì)照組則是在第96 h 達(dá)到50.7 ℃，進(jìn)入高溫階段，此時(shí)處理組溫度為60.2 ℃。從進(jìn)入高溫階段時(shí)間看，處理組比對(duì)照組升溫時(shí)間短33%。同時(shí)，從整個(gè)升溫過(guò)程中峰值溫度看，處理組在第96 h達(dá)到溫度峰值60.2 ℃，對(duì)照組峰值溫度為58.7 ℃，略低于處理組。

圖5 堆肥過(guò)程中溫度變化Fig.5 Temperature change during composting

從高溫階段持續(xù)時(shí)間看，處理組高溫階段時(shí)間為48 h，對(duì)照組高溫階段持續(xù)時(shí)間卻少于24 h。處理組高溫階段比對(duì)照組長(zhǎng)33%。

試驗(yàn)結(jié)果表明，高溫階段對(duì)比常溫環(huán)境下好氧堆肥時(shí)間短，除環(huán)境溫度（5 ℃）過(guò)低，堆肥系統(tǒng)內(nèi)與環(huán)境溫差過(guò)大致使熱量迅速流失。原因可能是堆體過(guò)小導(dǎo)致熱量流失過(guò)快，在實(shí)際應(yīng)用時(shí)應(yīng)選用較大體積堆肥或做好堆體保溫措施，減少熱量流失。

試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌株可使低溫環(huán)境下（5 ℃）秸稈好氧堆肥加速升溫，延長(zhǎng)高溫期持續(xù)時(shí)間，提高峰值溫度。綜上，該菌株具備制成良好的堆低溫肥起爆菌劑的潛力。

3 討 論

3.1 耐冷纖維素降解菌篩選

本試驗(yàn)從農(nóng)田土壤中篩選一株在低溫環(huán)境具有纖維素降解能力的菌株，將其命名為L(zhǎng)YG-01。該菌株為Protebacteria中Lelliottia屬一類(lèi)細(xì)菌。Protebacteria門(mén)微生物在自然界中廣泛存在。土壤中分離篩選該門(mén)纖維素降解細(xì)菌的研究是以Pseudomonadaceae屬微生物為主[21]。Lelliotlia作為植物促生菌及重金屬污染修復(fù)的微生物，部分菌株具有纖維素降解功能[22-24]。與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

3.2 菌株培養(yǎng)條件優(yōu)化

微生物培養(yǎng)過(guò)程中，可建立數(shù)學(xué)模型對(duì)微生物動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行預(yù)測(cè)與評(píng)價(jià)。響應(yīng)面優(yōu)化法對(duì)培養(yǎng)微生物的優(yōu)化工作可發(fā)揮較好效果，該優(yōu)化法可對(duì)模型進(jìn)行方差檢驗(yàn)確定優(yōu)化方案準(zhǔn)確性以及各因素重要程度。在菌株培養(yǎng)條件優(yōu)化及菌株產(chǎn)酶優(yōu)化方面均有應(yīng)用。實(shí)際應(yīng)用中，因素選擇主要為培養(yǎng)溫度、pH、接種量、培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)基轉(zhuǎn)速等。李婷等對(duì)降解纖維素的耐冷細(xì)菌優(yōu)化培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基成分和pH影響耐冷菌生長(zhǎng)主要條件[25]。董雪麗等對(duì)耐低溫纖維素降解菌進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，接種量與培養(yǎng)時(shí)間交互作用對(duì)菌株影響顯著[26]。結(jié)合菌株耐低溫的特性，本試驗(yàn)最終選取溫度、pH以及接種量進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

通過(guò)響應(yīng)面結(jié)果看，交互項(xiàng)中顯著性影響因素從強(qiáng)到弱依次是溫度與接種量、pH與溫度、pH與接種量。二次項(xiàng)中顯著性影響因素從強(qiáng)到弱依次為溫度、pH、接種量。對(duì)菌體生長(zhǎng)影響最大因素的多項(xiàng)式系數(shù)僅為0.4，反映實(shí)際培養(yǎng)中，在10～30 ℃，該菌種均可正常生長(zhǎng)，即使10 ℃低溫環(huán)境，仍保持最佳培養(yǎng)條件的56.25%生長(zhǎng)速率。對(duì)影響較弱的pH，按照模型預(yù)測(cè)結(jié)果，其影響幅度低于10%。說(shuō)明該菌株對(duì)低溫環(huán)境及環(huán)境中pH 均有一定耐性，菌株對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，滿足作為低溫好氧堆肥接種菌條件。

3.3 接種對(duì)玉米秸稈堆肥溫度的影響

通過(guò)對(duì)添加菌劑與空白對(duì)照中好氧堆肥溫度的研究，驗(yàn)證接種Lelliottiasp.對(duì)玉米秸稈好氧堆肥腐熟的影響。溫度是影響堆肥當(dāng)中微生物活動(dòng)以及堆肥腐熟的重要因素。在堆肥過(guò)程中，以50 ℃為閾值通過(guò)溫度變化將堆肥分為3個(gè)階段：升溫階段、高溫階段與降溫階段。溫度是反映好氧堆肥過(guò)程是否順利的標(biāo)志，可用作評(píng)判堆肥過(guò)程的指標(biāo)。堆肥過(guò)程中溫度產(chǎn)生的本質(zhì)為微生物進(jìn)行的生命活動(dòng)。試驗(yàn)結(jié)果表明，處理組比對(duì)照組更快進(jìn)入高溫階段，這可能是因接種菌劑增加堆體初期微生物豐度，同時(shí)，因易降解物質(zhì)被快速降解，處理組較對(duì)照組退出高溫階段更早，與Wang等研究結(jié)果一致[9]。因易降解的有機(jī)物及纖維素等物質(zhì)被分解，導(dǎo)致堆體更有利于微生物生長(zhǎng)繁殖，使處理組對(duì)比對(duì)照組保持高溫階段更久，與本試驗(yàn)及Sun 等研究結(jié)果一致[8]。綜合升溫速度以及高溫階段持續(xù)時(shí)間，Lelliottia sp.接種對(duì)玉米秸稈堆肥發(fā)揮積極影響。

本研究存在一定局限，溫度僅反映部分堆肥過(guò)程信息，在后續(xù)試驗(yàn)中將研究堆肥過(guò)程中各類(lèi)理化指標(biāo)及堆肥各階段微生物群落信息，對(duì)Lelliottia sp.接種玉米秸稈堆肥效果進(jìn)行全面研究。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)利用剛果紅檢驗(yàn)法與低溫環(huán)境培養(yǎng)篩選方法，從腐爛玉米秸稈及周?chē)寥乐泻Y選出一株在低溫環(huán)境具有木質(zhì)纖維素降解能力菌株，DNS法測(cè)定該菌株CMC 酶活性為1.77 U·mL-1，通過(guò)濾紙崩解試驗(yàn)與酶活性檢驗(yàn)證明其有一定的木質(zhì)纖維素降解能力。

通過(guò)鑒定其形態(tài)及分子生物學(xué)方式，確定其為L(zhǎng)elliottia屬菌一種。響應(yīng)面分析結(jié)果表明，對(duì)菌體生長(zhǎng)促進(jìn)作用順序?yàn)椋簻囟龋窘臃N量＞pH。當(dāng)pH為6.8，培養(yǎng)溫度為24.18 ℃，接種量達(dá)到3.12%時(shí)，為該菌株最適培養(yǎng)條件。

通過(guò)小型堆肥試驗(yàn)測(cè)試其起爆效果發(fā)現(xiàn)，添加菌劑處理較對(duì)照組而言，升溫至高溫階段時(shí)間縮短33%，同時(shí)高溫階段時(shí)間延長(zhǎng)33%。該菌株可顯著提高堆體升溫速度，并增加高溫期時(shí)間。該菌株的發(fā)現(xiàn)對(duì)豐富低溫環(huán)境下秸稈好氧堆肥接種菌劑資源具有重要意義，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)工程菌株提供新菌源。