劉 娣 ,李皓月,馬 紅,汪 亮
(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,哈爾濱 150030;2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所,哈爾濱 150086)
民豬是我國地方品種,主要分布在東北地區(qū),具有抗逆性強(qiáng)、肉質(zhì)好、抗寒等特點(diǎn)[1],脂肪沉積情況直接影響民豬抗寒能力[2]。根據(jù)脂肪組織分布位置不同分為皮下脂肪、肌內(nèi)脂肪及內(nèi)臟脂肪。皮下脂肪占民豬總脂肪含量70%左右,大部分存在于皮下,如背部脂肪、腋下脂肪等,主要發(fā)揮保護(hù)、隔熱及儲(chǔ)存能量功能[3]。
microRNA 是內(nèi)源性啟動(dòng)的非編碼RNA,由19~25個(gè)核苷酸組成,通過和靶基因mRNA堿基配對引導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)降解mRNA 或阻礙其翻譯,發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后控制基因表達(dá)作用[4]。microRNA已被發(fā)現(xiàn)參與多種生理過程,在細(xì)胞增殖、分化、腫瘤發(fā)生、神經(jīng)元發(fā)育、脂肪形成等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6-7]。miR-19a屬于miR-17-92基因簇,參與脂肪組織的胰島信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。miR-19a已被證實(shí)促進(jìn)雞前脂肪細(xì)胞增殖[8],但在民豬中研究較少。
轉(zhuǎn)錄因子KLFs 家族(Krüppel-like factors)是DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子家族成員,在脂肪細(xì)胞分化過程中發(fā)揮重要作用[9]。Jiang 等研究發(fā)現(xiàn),KLF13通過調(diào)節(jié)PPARγ 促進(jìn)豬脂肪細(xì)胞分化[10]。生物信息學(xué)分析表明,miR-19a靶作用于KLF13基因。為揭示民豬miR-19a作用及其作用機(jī)制,本研究開展miR-19a 靶作用于KLF13 基因鑒定與分析及miR-19a對脂肪分化調(diào)控機(jī)制的研究。
脂肪在民豬抗寒過程中發(fā)揮重要作用,本研究通過對miR-19a 靶作用于KLF13 基因的鑒定分析及miR-19a 對脂肪分化標(biāo)志基因的作用,探究miR-19a對民豬脂肪沉積的影響,為研究民豬脂肪分化過程調(diào)控提供依據(jù)。
Trizol、DMEM/F12 培養(yǎng)基、熒光定量試劑均購自Life techonogies 公司;Lipofectamine 2000、胰蛋白酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、磷酸鹽緩沖溶液(PBS)、胎牛血清(FBS)均購自TaKaRa 公司;青鏈霉素混合液、地塞米松(DEX)、三碘甲狀腺原氨酸(T-3)、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、吲哚美辛、羅格列酮、胰島素、Ⅳ型膠原酶、油紅O染液均購自Sigma 公司;MicroRNA 模擬物、抑制劑、NC均由安徽通用生物系統(tǒng)有限公司設(shè)計(jì)合成。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取自黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所養(yǎng)殖基地,采集6月齡東北民豬心臟、肝臟、脾臟、肺、腎、肌肉和皮下脂肪組織用于提取RNA,采集1月齡東北民豬背部皮下脂肪組織用于前體脂肪細(xì)胞培養(yǎng)。
取民豬脂肪組織,使用PBS清洗,將組織塊剪碎,加入兩倍體積Ⅰ型膠原酶消化、離心后,取民豬前脂肪細(xì)胞,放于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。
待細(xì)胞密度長至70%~80%時(shí)轉(zhuǎn)染(35 mm皿為例),按照說明書將合適濃度模擬物、抑制劑或NC 與250 μL 的DMEM/F 12 混 勻,5 μL Lipofectamine 2000 與250 μL 的DMEM/F 12 混勻。再將二者混合孵育15 min,逐滴加入培養(yǎng)皿中,24 h后換液。
前脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24 h 換液,更換為2 mL 完全培養(yǎng)基(含1%雙抗、10%FBS),每毫升培養(yǎng)基中含終濃度1 μmoL a.i.·L-1吲哚美辛、0.5 μmoL a.i.·L-1IBMX、5 ng a.i.·mL-1胰島素、1 μmoL a.i.·L-1羅格列酮、1 μmoL a.i.·L-1地塞米松、1 μmoL a.i.·L-1三碘甲狀腺原氨酸(T3),2 d 后換液,替換成含有終1 μmoL a.i.·L-1三碘甲狀腺原氨酸(T3)、濃度5 ng a.i.·mL-1胰島素、1 μmoL a.i.·L-1羅格列酮的完全培養(yǎng)基(含1%雙抗、10%FBS)。
根據(jù)說明書使用Trizol 法提取RNA,提取的RNA根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA,在LightCycler?96熒光定量PCR儀中進(jìn)行PCR反應(yīng)。
以民豬前脂肪細(xì)胞cDNA為模板,用KLF13-F和KLF13-R引物,PCR擴(kuò)增KLF13的3′UTR區(qū)。回收擴(kuò)增片段,將目的片段插入psiCHECK-2 vector,構(gòu)建psiCHECK-2-KLF13-3′-UTR-WT(野生型)。采用重疊延伸方法突變KLF 13 基因3′UTR 區(qū)中miR-19a 結(jié)合位點(diǎn),構(gòu)建相應(yīng)的突變型KLF 13 基因報(bào)告載體(見圖1)。所有構(gòu)建載體均測序驗(yàn)證結(jié)果無誤。
圖1 KLF13 3′UTR序列和突變序列對比Fig.1 Comparison of KLF13 3′UTR sequence and mutant sequence
將PK15 細(xì)胞接種至12 孔板(2.5×105個(gè)·孔-1)中,待融合至80%以上時(shí)將野生型報(bào)告載體和突變型報(bào)告載體分別與miR-19a 模擬物和NC 共轉(zhuǎn)染到PK 15 細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后24 h,使用Promega GloMax 20/21 和Dual Luciferase Reporter AssayKit 試 劑 盒 檢測雙熒光素酶活性。試驗(yàn)步驟嚴(yán)格參考試劑盒說明書操作。
將誘導(dǎo)分化至8 d 的前脂肪細(xì)胞去除培養(yǎng)基,PBS輕洗3次,加入1 mL 4%甲醛溶液固定30 min,PBS洗3次去除甲醛,加入油紅O工作液1 mL,避光染色30 min 后,吸出工作液,再用PBS 清洗3次,使用相差顯微鏡觀察。
用Excel 2019處理數(shù)據(jù),GraphPad Prism 8.0.2.236繪制圖像,由SPSS 26分析獲得統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果,采用單因素方差分析,油紅O染色脂滴計(jì)數(shù)使用image J 8.0。P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果采用2-△△ct法計(jì)算。
表1 引物序列Table 1 Primer sequences
為研究miR-19a 和KLF13 在民豬不同組織中表達(dá)模式,取6 月齡民豬心、肝臟、脾、肺、腎、肌肉和脂肪組織,實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測miR-19a及KLF13相對表達(dá)量。結(jié)果顯示,miR-19a在心臟和肌肉表達(dá)量最高,其次是肝臟、肺、腎和脂肪,脾中表達(dá)量最低(見圖2)。KLF13在心臟表達(dá)量最低,其次是肌肉、肝臟、脂肪、脾臟和腎臟,肺中表達(dá)量最高(見圖3)。
圖2 miR-19a在民豬不同組織表達(dá)情況Fig.2 Expression of miR-19a in different tissues of Min pigs
圖3 KLF13在民豬不同組織表達(dá)情況Fig.3 Expression of KLF 13 in different tissues of Min pigs
根據(jù)TargetScan 和Ensembl 網(wǎng)站分析豬KLF13基因(NM_001011505.1)mRNA 的3′ UTR 序列。結(jié)果表明,KLF13 基因是miR-19a 的一個(gè)潛在靶基因,KLF13 基 因3′ UTR 序 列 中192~197 bp 與miR-19a 成熟序列3~9 bp 完全互補(bǔ)。對人、小鼠、豬、兔KLF13 基因3′ UTR 序列對比發(fā)現(xiàn),上述物種KLF13 基因3′ UTR 均具有該保守miR-19a 結(jié)合位點(diǎn)(見圖4),提示KLF13 基因3′ UTR可能是miR-19a 結(jié)合位點(diǎn)參與KLF13 基因表達(dá)調(diào)控。
圖4 不同物種KLF13基因3′UTR與miR-19a結(jié)合位點(diǎn)對比Fig.4 Comparison of 3'UTR and miR-19a binding sites of KLF13 gene in different species
為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-19a 對KLF13 基因調(diào)控作用,構(gòu)建KLF13 基因3′UTR 報(bào)告基因載體psi-CHECK-2-KLF13-3′-UTR-WT(野生型)和psi-CHECK-2-KLF13-3′-UTR-MUT(突變型),序列測序結(jié)果完全正確(見圖5)。
圖5 野生型載體和突變型載體測序結(jié)果對比Fig.5 Comparison of sequencing results of wild-type vector and mutant vector
共轉(zhuǎn)染至PK 15細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后24 h檢測熒光強(qiáng)度,計(jì)算比值。結(jié)果表明,miR-19a 和WT 共轉(zhuǎn)海腎熒光和螢火蟲熒光比值與對照組對比,結(jié)果極顯著降低(P<0.01),降低1.5 倍(見圖6)。而miR-19a與MUT共轉(zhuǎn)則對熒光比值結(jié)果與對照組相比無差異,說明miR-19a 可與KLF 13 3′UTR 結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合,抑制KLF 13表達(dá)。
圖6 雙熒光素酶報(bào)告基因載體熒光強(qiáng)度結(jié)果Fig.6 Fluorescence intensity results of dual luciferase reporter gene vector
通過結(jié)合位點(diǎn)分析初步預(yù)測miR-19a 影響KLF13 基因表達(dá),為進(jìn)一步驗(yàn)證KLF13 是否為miR-19a 靶基因,轉(zhuǎn)染miR-19a 的模擬物與抑制劑,24 h 后回收細(xì)胞,進(jìn)行熒光定量PCR 檢測miR-19a 和KLF13 表達(dá)量。結(jié)果表明,過表達(dá)miR-19a 模擬物后,miR-19a 表達(dá)量極顯著提高(P<0.01),是對照組350 倍;KLF13 mRNA 表達(dá)水平極顯著降低(P<0.01),降低至0.3 倍。過表達(dá)miR-19a 抑制劑后,miR-19a 表達(dá)量極顯著降低(P<0.01),與對照組相比降低至約0.2 倍;KLF13表達(dá)水平顯著提高(P<0.05),提高至1.6 倍(見圖7)。結(jié)果表明,miR-19a對KLF13的表達(dá)具有負(fù)調(diào)節(jié)功能。
圖7 過表達(dá)及抑制miR-19a后miR-19a和KLF13表達(dá)情況Fig.7 Overexpression,miR-19a,KLF13 expression after inhibition of miR-19a
檢測轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)分化后2 d 脂肪分化標(biāo)志基因,脂肪分化標(biāo)志基因選取KLF13、LPL、AP2、C/EBPα、NFR1、PPARα、BRCA1和ALDH1A1。過表達(dá)miR-19a 后,KLF13、LPL、C/EBPα、NFR1、ALDH1A1表達(dá)量極顯著降低(P<0.01),與對照組相比,分別降低至0.2、0.1、0.2、0.15、0.3倍;AP2、PPARα、BRCA1表達(dá)量顯著降低(P<0.05),降低至0.4、0.5、0.4倍。抑制miR-19a表達(dá)后,KLF13、LPL、NRF1、PPARα 表達(dá)量與對照組相比極顯著升高(P<0.01),分別升高1.7、2.8、10.5、1.8 倍;AP2、C/EBPα、BRCA 1、ALDH1A1 表達(dá)量顯著升高(P<0.05),升高1.3、1.35、1.3、1.37倍(見圖8)。結(jié)果表明,miR-19a可負(fù)向調(diào)控脂肪分化標(biāo)志基因表達(dá)。
圖8 脂肪分化標(biāo)志基因表達(dá)情況Fig.8 Expression of adipogenic differentiation marker genes
檢測轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)分化后2 d 脂肪酸代謝基因表達(dá)量,脂肪酸代謝標(biāo)志基因選取RXRA、LIPE、PDGRFA 和RARB 基因,過表達(dá)miR-19a后,RXRA、PDGRFA 和RARB 表達(dá)量極顯著升高(P<0.01),與對照組相比,分別升高2.7、2.0、1.8 倍,LIPE 表達(dá)量無變化。抑制miR-19a表達(dá)后,RXRA、PDGRFA、RARB 表達(dá)量顯著降低(P<0.05),分別降低至0.6、0.5、0.4 倍(見圖9),而LIPE 表達(dá)量極顯著提高(P<0.01),提高1.8 倍。結(jié)果表明,miR-19a 可正向調(diào)控多個(gè)脂肪酸代謝標(biāo)志基因表達(dá),對LIPE 調(diào)控機(jī)制尚不明確。
圖9 脂肪酸代謝相關(guān)基因表達(dá)情況Fig.9 Expression of genes related to fatty acid metabolism
民豬前脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-19a模擬物、抑制劑及對照后誘導(dǎo)細(xì)胞成脂,為保證模擬物和抑制劑持續(xù)發(fā)揮作用,間隔1 d對細(xì)胞轉(zhuǎn)染1次,誘導(dǎo)成脂8 d,對細(xì)胞進(jìn)行油紅O 染色,結(jié)果如圖10 所示。與NC 相比,轉(zhuǎn)染miR-19a 模擬物誘導(dǎo)分化8 d 形成的脂滴數(shù)極顯著降低(P<0.01),降低至105 937;轉(zhuǎn)染miR-19a 抑制劑誘導(dǎo)分化8 d 形成的脂滴數(shù)與NC 相比極顯著提高(P<0.01),提高到304 818(見圖11)。結(jié)果表明,miR-19a 可負(fù)向調(diào)控民豬前脂肪細(xì)胞脂滴形成。
圖10 過表達(dá)、抑制miR-19a油紅O染色Fig.10 Overexpression,inhibition of miR-19a oil red O staining
圖11 誘導(dǎo)成脂油紅O染色脂滴數(shù)量Fig.11 Number of lipid droplets induced into lipid oil red O staining
miRNA 對基因表達(dá)具有重要調(diào)控作用。在動(dòng)物中,miRNAs 通過結(jié)合目標(biāo)mRNA 3′UTR 互補(bǔ)序列導(dǎo)致翻譯抑制或基因沉默[11],許多研究表明,miRNA可促進(jìn)或抑制前脂肪細(xì)胞分化[5-8]。miR-19a已被證實(shí)在肌肉細(xì)胞增殖、分化和心肌細(xì)胞增殖過程中具有重要作用[13-14]。因此在組織表達(dá)譜中,心臟組織和肌肉組織有較高表達(dá)量。
為研究miR-19a在民豬前脂肪細(xì)胞分化作用的分子機(jī)制,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-19a下調(diào)脂肪分化標(biāo)志基 因 LPL、 AP2、 C/EBPα、 NFR1、 PPARα、BRCA1 和ALDH1A1 的表達(dá)。甘油三酯脂肪酶(LPL)主要由脂肪細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞分泌,在3T3-L1 脂肪細(xì)胞中,抑制LPL 表達(dá)可抑制脂肪積累[12],C/EBPα、脂肪酸結(jié)合蛋白(AP2)、氧化應(yīng)激刺激核呼吸因子1(nuclear respiratory factor 1,NFR1)、PPARα在脂肪細(xì)胞分化過程中發(fā)揮促進(jìn)作用[15-17],Jackson 等通過誘導(dǎo)BRCA1 DNA 修復(fù)相關(guān)基因(BRCA1 DNA repair associated,BRCA1)降低線粒體呼吸提高脂肪積累[18],Hu 等研究結(jié)果顯示,乙醛脫氫酶1 家族成員A1(aldehyde dehydrogenase 1 family member A1,ALDH1A1)可促進(jìn)脂肪分化[19],本試驗(yàn)結(jié)果說明miR-19a對脂肪分化標(biāo)志基因發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用;過表達(dá)miR-19a上調(diào)脂肪酸代謝標(biāo)志基因RXRA、PDGRFA、RARB 的表達(dá),RXRA、維甲酸受體β(維甲酸受體β,RARB),RXRA 與PPARS 結(jié)合促進(jìn)糖代謝與脂代謝,RARB 和RXRA 可降低牛肌內(nèi)脂肪形成[20],Lee等通過高脂飼養(yǎng)發(fā)現(xiàn)小鼠中的血小板衍生生長因子受體α(platelet derived growth factor receptor alpha,PDGFRα),PDGFR+細(xì)胞通過高脂飼養(yǎng)可增加脂肪細(xì)胞分化[21],Taniguchi 等研究發(fā)現(xiàn)PDGRFα表達(dá)量與PPARα 表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)[22],本試驗(yàn)說明miR-19a 對脂肪酸代謝標(biāo)志基因發(fā)揮正調(diào)控作用;過表達(dá)后誘導(dǎo)分化8 d脂滴數(shù)量降低,反之,miR-19a 可能對前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。脂肪分化標(biāo)志基因和脂肪酸代謝標(biāo)志基因變化趨勢與Jackson 等研究結(jié)論一致,脂肪酶E(lipase E,LIPE)通過編碼調(diào)控激素敏感脂肪酶促進(jìn)脂肪積累,LIPE 在過表達(dá)時(shí)無變化而抑制時(shí)顯著升高,可能是因LIPE 主要作用是脂肪積累[23],過表達(dá)miR-19a時(shí)僅能減少脂肪細(xì)胞分化,不能完全抑制分化,因此LIPE 與對照組相比無明顯變化,抑制miR-19a 時(shí)脂肪累計(jì)增加,LIPE 顯著提高?;谀M或抑制miR-19a表達(dá)對成脂分化標(biāo)志基因和脂肪酸代謝標(biāo)志基因的調(diào)控作用及誘導(dǎo)8 d 油紅O 染色結(jié)果,證明miR-19a在民豬前脂肪細(xì)胞分化過程中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。
通過在線軟件預(yù)測miR-19a 可能的靶基因,KLF13是miR-19a靶基因之一,生物信息學(xué)分析顯示,KLF13基因3′UTR具有保守的miR-19a結(jié)合位點(diǎn),大量研究證明KLF 家族在調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用[24-25]。本試驗(yàn)通過轉(zhuǎn)染miR-19a 模擬物或抑制劑顯著降低或提高KLF13 表達(dá)量,為進(jìn)一步驗(yàn)證二者關(guān)系,KLF13基因3′UTR報(bào)告基因分析和定點(diǎn)突變分析證實(shí)KLF13 是miR-19a 靶基因。Jiang 等研究結(jié)果表明,KLF13 通過結(jié)合PPARγ的Promotor區(qū)激活表達(dá),促進(jìn)豬脂肪細(xì)胞分化[26],說明miR-19a可能通過調(diào)節(jié)KLF13表達(dá)調(diào)控脂肪形成。大多數(shù)miRNAs 通過與靶基因mRNA的3′UTR 不完全互補(bǔ)配對,抑制靶基因mRNA 翻譯,調(diào)節(jié)靶基因表達(dá),這種作用方式影響蛋白表達(dá)水平[11]。本試驗(yàn)未進(jìn)行蛋白層面驗(yàn)證,未來將補(bǔ)充過表達(dá)或抑制miR-19a后KLF13蛋白表達(dá)情況,進(jìn)一步明確miR-19a對KLF13的調(diào)控作用。
本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),miR-19a在民豬前脂肪分化過程中發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)作用,證明促進(jìn)豬脂肪分化基因KLF13 是miR-19a 靶基因,結(jié)果為進(jìn)一步研究miR-19a是否通過影響KLF13表達(dá)進(jìn)而影響民豬前脂肪細(xì)胞分化提供支持,也為分析microRNA 對民豬前體脂肪細(xì)胞分化調(diào)節(jié)提供參考。