一種新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑在4個(gè)檢測(cè)體系中的檢出限分析

曾艷芬 吳泉明 周 歡 張秋琴 康艷麗 李 瑤 陳喜軍 黃建剛 陳發(fā)林

（1.福建省立醫(yī)院福建省臨床檢驗(yàn)中心，福建 福州 350001；2.福建省立醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建 福州 350001）

新型冠狀病毒感染是引發(fā)新型冠狀病毒肺炎的病原體[1]，新型冠狀病毒核酸檢測(cè)是確定新型冠狀病毒感染的金標(biāo)準(zhǔn)。在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行新型冠狀病毒核酸檢測(cè)的過(guò)程中，存在試劑優(yōu)化不充分、批間差異大，以及結(jié)果假陰性等問(wèn)題[2]。關(guān)于結(jié)果假陰性問(wèn)題，除受檢測(cè)試劑的靈敏度和檢測(cè)體系的性能影響外，試劑的檢出限至關(guān)重要?！夺t(yī)療機(jī)構(gòu)新型冠狀病毒核酸檢測(cè)工作手冊(cè)（試行第二版）》[3]要求選擇國(guó)家藥品監(jiān)督管理部門(mén)批準(zhǔn)的試劑，并在選擇標(biāo)本采樣管和核酸提取試劑時(shí)，使用試劑盒說(shuō)明書(shū)建議的配套標(biāo)本采樣管和提取試劑；在用于臨床標(biāo)本檢測(cè)前，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)由提取試劑、提取儀和擴(kuò)增試劑、擴(kuò)增儀等組成的檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行性能驗(yàn)證。但在實(shí)際工作中，多數(shù)實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)體系均為非配套體系。本研究對(duì)上海之江生物科技股份有限公司新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑的檢出限（200 拷貝/mL）在不同檢測(cè)體系中的性能進(jìn)行驗(yàn)證，以幫助實(shí)驗(yàn)室提升新型冠狀病毒核酸檢測(cè)質(zhì)量。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和檢測(cè)體系

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院新型冠狀病毒全序列假病毒核糖核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（編號(hào)為NIM-RM5207，批號(hào)2102），具體賦值見(jiàn)表1。選擇4個(gè)檢測(cè)體系，均為自動(dòng)提取儀（磁珠法）提取后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增的方法，其中體系1為配套體系，體系2、3、4為非配套體系，4個(gè)體系擴(kuò)增試劑均為同一品牌產(chǎn)品，各體系中的儀器、試劑均取得國(guó)家藥品監(jiān)督管理局注冊(cè)證。

表1 新型冠狀病毒全序列假病毒核糖核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)賦值

1.2 方法

1.2.1 檢出限驗(yàn)證

用中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院新型冠狀病毒全序列假病毒核糖核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)4個(gè)檢測(cè)體系進(jìn)行檢出限的性能驗(yàn)證。由于所用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)ORF1ab基因、N基因、E基因的濃度賦值不同，因此對(duì)3個(gè)基因分別進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證方法：分別使用各檢測(cè)體系病毒采樣管的保存液梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（以標(biāo)準(zhǔn)值計(jì)算）到試劑盒說(shuō)明書(shū)標(biāo)注的檢出限（200 拷貝/mL），每批重復(fù)測(cè)定5次，記錄檢測(cè)結(jié)果的陽(yáng)性數(shù)，以100%檢出為驗(yàn)證通過(guò)。

1.2.2 重新驗(yàn)證

考慮到標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)賦值存在不確定度，按照標(biāo)準(zhǔn)值與不確定度的差值重新稀釋后進(jìn)行驗(yàn)證，方法和判斷標(biāo)準(zhǔn)同檢出限的驗(yàn)證。觀察2次驗(yàn)證均未通過(guò)的體系，修改提取程序，再次驗(yàn)證。第1次和第2次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)使用優(yōu)化的核酸提取試劑，提取程序（提取程序1）見(jiàn)表2；第3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)使用優(yōu)化前的核酸提取試劑，提取程序（提取程序2）見(jiàn)表3；第4次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)將步驟2作用時(shí)間改為15 min，其他步驟同提取程序1；第5次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)提前預(yù)熱儀器至70 ℃，確保步驟2的作用時(shí)間達(dá)4 min，步驟3重復(fù)3次，其他步驟同提取程序1。實(shí)驗(yàn)方法和判斷標(biāo)準(zhǔn)同檢出限的驗(yàn)證。

表2 提取程序1步驟

表3 提取程序2步驟

2 結(jié)果

2.1 檢出限驗(yàn)證結(jié)果

4個(gè)檢測(cè)體系檢出限驗(yàn)證結(jié)果顯示，非配套體系1通過(guò)驗(yàn)證，配套體系和非配套體系2、3均未通過(guò)。見(jiàn)表4、圖1。

圖1 4個(gè)檢測(cè)體系標(biāo)準(zhǔn)值稀釋檢出限驗(yàn)證結(jié)果擴(kuò)增曲線

表4 4個(gè)檢測(cè)體系標(biāo)準(zhǔn)值稀釋檢出限驗(yàn)證結(jié)果

2.2 重新驗(yàn)證結(jié)果

2.2.1 第2次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

未通過(guò)驗(yàn)證的3個(gè)檢測(cè)體系以中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院新型冠狀病毒全序列假病毒核糖核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)值與不確定度的差值稀釋驗(yàn)證檢出限，結(jié)果顯示，配套體系和非配套體系2通過(guò)驗(yàn)證，非配套體系3未通過(guò)。見(jiàn)表5、圖2。

圖2 3個(gè)檢測(cè)體系以標(biāo)準(zhǔn)值與不確定度差值稀釋檢出限驗(yàn)證結(jié)果擴(kuò)增曲線圖

表5 3個(gè)檢測(cè)體系以標(biāo)準(zhǔn)值與不確定度差值稀釋檢出限驗(yàn)證結(jié)果

2.2.2 第3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院新型冠狀病毒全序列假病毒核糖核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)值與不確定度的差值稀釋驗(yàn)證非配套體系3檢出限，結(jié)果顯示，使用提取程序2的第3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)通過(guò)；更改提取程序的第4次、第5次實(shí)驗(yàn)均未通過(guò)。見(jiàn)表6、圖3。

圖3 非配套體系3以標(biāo)準(zhǔn)值與不確定度的差值稀釋和更改提取程序后檢出限驗(yàn)證結(jié)果擴(kuò)增曲線

表6 非配套體系3以標(biāo)準(zhǔn)值與不確定度的差值稀釋和更改提取程序后檢出限驗(yàn)證結(jié)果

表6（續(xù)）

3 討論

新型冠狀病毒核酸檢測(cè)是疫情防控的關(guān)鍵，檢測(cè)試劑的檢出限能否在相應(yīng)的檢測(cè)體系復(fù)現(xiàn)是控制假陰性結(jié)果的重要指標(biāo)。目前，我國(guó)新型冠狀病毒核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室所用檢測(cè)體系多為非配套體系，且各實(shí)驗(yàn)室均存在多個(gè)非配套體系共用的情況。為了解配套與非配套檢測(cè)體系檢測(cè)性能的差異及其實(shí)際檢出能力，本研究選擇上海之江生物科技股份有限公司新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑，依據(jù)說(shuō)明書(shū)對(duì)1個(gè)配套體系和3個(gè)非配套體系的檢出限進(jìn)行性能驗(yàn)證。

本研究結(jié)果顯示，不同檢測(cè)體系檢測(cè)性能存在差異，對(duì)檢測(cè)結(jié)果，特別是低濃度樣本的檢測(cè)結(jié)果影響較大；4個(gè)檢測(cè)體系中，檢出能力最強(qiáng)的是非配套體系1，其次為配套體系和非配套體系2。配套體系檢出能力較非配套檢測(cè)體系差的原因可能為：1）新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑審批的過(guò)程中，由于沒(méi)有充足的臨床樣本和體系性能確認(rèn)時(shí)間，且早期國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為純化后新型冠狀病毒核酸體外轉(zhuǎn)錄RNA，不能反映核酸提取效率，造成配套體系構(gòu)建不完整；2）新型冠狀病毒核酸檢測(cè)需求不斷加大，可能導(dǎo)致試劑生產(chǎn)所用原料、耗材和工藝發(fā)生改變，批間差異大；3）試劑生產(chǎn)廠商在構(gòu)建體系時(shí)無(wú)法對(duì)所有的儀器設(shè)備組合進(jìn)行性能確認(rèn)，存在未進(jìn)行確認(rèn)的設(shè)備組合性能更佳的可能。

比較本研究非配套體系3的2種提取程序，主要區(qū)別是步驟2由15 min降至4 min；步驟3由3次減至1次。步驟2主要完成細(xì)胞裂解、核酸釋放并結(jié)合至磁珠的過(guò)程，本研究提取程序1從步驟1到步驟2，儀器從室溫升至70 ℃需2～3 min，步驟2真正的作用時(shí)間只有1～2 min，導(dǎo)致細(xì)胞裂解不全、核酸釋放及磁珠結(jié)合不充分，降低了提取效率。查閱儀器說(shuō)明書(shū)，發(fā)現(xiàn)并未對(duì)升降溫速度進(jìn)行規(guī)定，而本研究發(fā)現(xiàn)，作用時(shí)間越短，升降溫的速率對(duì)實(shí)際作用時(shí)間造成的影響就越大。我們未查閱到核酸提取儀相關(guān)參數(shù)的生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)，且2021年實(shí)施的《（自動(dòng)）核酸提取儀校準(zhǔn)規(guī)范》（JJF 1874—2020）[4]亦僅對(duì)溫度示值誤差、均勻性、穩(wěn)定性進(jìn)行規(guī)定，未提及升降溫的速率，因此迫切需要相關(guān)部門(mén)出臺(tái)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)范核酸提取操作細(xì)節(jié)，指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室和試劑生產(chǎn)廠商日常工作，保證核酸檢測(cè)的質(zhì)量。步驟3是洗滌的過(guò)程，通常需使用不同的洗滌液洗滌2～4次，分別去除無(wú)機(jī)鹽離子和蛋白、脂類等抑制物，達(dá)到純化的目的[5]，僅使用1種洗滌液洗滌1次，存在洗滌不充分、干擾物質(zhì)殘留導(dǎo)致提取效率降低和抑制后續(xù)擴(kuò)增的可能。在疫情暴發(fā)流行期間，新型冠狀病毒核酸檢測(cè)樣本量大，要求出報(bào)告時(shí)間短，為加快速度，實(shí)驗(yàn)室一般會(huì)通過(guò)減少裂解時(shí)間、洗滌或磁吸次數(shù)等方法縮短提取時(shí)間，通過(guò)減少逆轉(zhuǎn)錄和各個(gè)循環(huán)的時(shí)間，或添加加速劑等方法縮短擴(kuò)增時(shí)間，給檢測(cè)體系的性能造成負(fù)面的影響，而檢出限本身就處于試劑分析敏感性的極限，任何環(huán)節(jié)的變化都可能對(duì)其產(chǎn)生較大的影響，因此實(shí)驗(yàn)室不可為了縮短出報(bào)告時(shí)間，突破速度與質(zhì)量的平衡點(diǎn)，以犧牲質(zhì)量為代價(jià)換取速度的提升。

本研究比較了4個(gè)體系的加樣量，發(fā)現(xiàn)配套體系和非配套體系1、2的加樣量均為300 μL，非配套體系3的加樣量為200 μL，非配套體系3加樣量低于其他3個(gè)體系也可能是其第1、2次驗(yàn)證未能通過(guò)的原因之一，因此實(shí)驗(yàn)室在選擇提取試劑時(shí)應(yīng)考慮起始加樣量對(duì)檢測(cè)性能的影響。非配套檢測(cè)體系變量多，每個(gè)環(huán)節(jié)都會(huì)影響檢出限，實(shí)驗(yàn)室在應(yīng)用非配套檢測(cè)體系之前，必須進(jìn)行性能驗(yàn)證，如未能通過(guò)，建議逐一梳理各個(gè)環(huán)節(jié)，如更換采樣管、更換提取試劑或優(yōu)化提取程序、優(yōu)化擴(kuò)增程序，探索最佳檢測(cè)體系，保證檢驗(yàn)質(zhì)量。另外，本研究性能驗(yàn)證是在對(duì)所選檢測(cè)體系中的儀器設(shè)備進(jìn)行維護(hù)保養(yǎng)、校準(zhǔn)后進(jìn)行的，但實(shí)際工作中，新型冠狀病毒核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室日常工作量非常大，可能存在儀器設(shè)備長(zhǎng)時(shí)間疲勞運(yùn)轉(zhuǎn)而影響檢測(cè)性能的情況，提示實(shí)驗(yàn)室工作越是繁重，越要關(guān)注儀器設(shè)備的運(yùn)行狀態(tài)，加強(qiáng)日常維護(hù)保養(yǎng)和校準(zhǔn)。

綜上所述，本研究選擇的新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑在4個(gè)檢測(cè)體系中的檢出限驗(yàn)證均能通過(guò)，但存在非配套檢測(cè)體系性能優(yōu)于配套體系的情況?？s短細(xì)胞裂解和核酸釋放與磁珠結(jié)合時(shí)間，減少核酸洗滌次數(shù)會(huì)影響試劑檢出限，實(shí)驗(yàn)室不可為追求速度輕易更換檢測(cè)體系中的任一環(huán)節(jié)。相關(guān)機(jī)構(gòu)應(yīng)建立覆蓋核酸檢測(cè)全流程相關(guān)儀器設(shè)備生產(chǎn)校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)范核酸檢測(cè)操作，指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室和廠商日常工作。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)關(guān)注加樣量、非配套體系的優(yōu)化和儀器設(shè)備的維護(hù)、保養(yǎng)、校準(zhǔn)，保證檢驗(yàn)質(zhì)量。