外周血NLR、VEGF、miRNA let-7a水平與喉癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關性

舒中獻 詹紅星 王越 白春雄

喉癌為頭頸部多發(fā)腫瘤疾病，發(fā)病率約占惡性腫瘤的5.7%～7.6%［1］。近年來，通過各種改良手術方式、放療、化療、生物治療等方法使喉癌預后明顯改善，但其遠期生存年率仍不理想，5 年生存率僅有51%，復發(fā)轉(zhuǎn)移是喉癌患者的主要死亡原因［2］。若患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，則5 年生存率會降低約50%，因此明確有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，有利于臨床盡早確定干預方案，延長患者生命，改善生存質(zhì)量［3］。全身炎癥免疫反應在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和治療方案具有重要作用，中性粒細胞/淋巴細胞比例（neutrophil/lymphocyte ratio，NLR）與惡性腫瘤患者預后具有一定相關性［4］。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）誘導能力較強，能夠特異性作用于血管內(nèi)皮細胞，使其增殖、遷移及生長，參與腫瘤的血管形成過程［5］。miRNA 是非編碼小RNA，幾乎參與調(diào)節(jié)所有的生物過程，可作為抑癌基因和致癌基因。let-7a 是miRNA 分子的一員，可與癌基因的3′非編碼翻譯區(qū)相互結(jié)合抑制靶基因的表達，抑制腫瘤的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移等生物學過程［6］。本研究選取喉癌患者，探討外周血NLR、VEGF、miRNA let-7a 水平與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關性，為臨床喉癌病情評估提供參考，現(xiàn)將所得結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018 年1 月至2021 年1 月運城第一醫(yī)院收治的60 例喉癌患者作為喉癌組，30 例喉部良性病變患者為對照組。納入標準：①喉癌組經(jīng)過病理檢查確診為喉浸潤癌［7］，即喉組織活檢明確突破上皮基底膜向深部組織浸潤的癌，以鱗狀細胞分化為特征；②既往未接受放化療治療；③喉癌組和對照組均接受手術治療；排除標準：①急性炎癥期者；②合并心腦血管疾病或其他惡性腫瘤者；③近期有手術史及輸血史者；④妊娠或哺乳期孕婦者。另選取同期來院體檢的健康人30 名為健康組。喉癌組男38 例，女22 例；平均年齡（59.53±5.89）歲；腫瘤分型為聲門上型15 例，聲門型45 例；分化程度為低分化2 例，中分化7 例，高分化51 例；TNM 分期為Ⅰ～Ⅱ47 例，Ⅲ～Ⅳ13 例。對照組男17 例，女13 例；平均年齡（60.22±6.02）歲。健康組男16 名，女14 名；平均年齡（58.68±5.45）歲。三組性別、年齡等一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)院倫理委員會審批通過，所有參與研究人員均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 指標檢測方法

采集患者入院第2 d 空腹外周靜脈血5 mL（健康組采樣時間為體檢當日），以3 000 r/min 的速度、半徑10 cm 離心10 min，離心后取上層清液，置于-70℃冰箱待測。采用全自動血液細胞儀檢測中性粒細胞、淋巴細胞，計算NLR 水平；采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測VEGF 水平，儀器為上海巴玖SAF-680T 酶標儀（上海巴玖實業(yè)有限公司），試劑盒購自武漢艾美捷科技有限公司。

采用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）兩步法檢測外周血miRNA let-7a 表達水平，檢測儀器為ABI 7500 型定量PCR 儀，結(jié)果采用2-ΔΔCt反映各樣品相對于對照組樣品目的基因的表達水平［ΔCt=目的基因Ct 值-內(nèi)參Ct 值，-ΔΔCt=（對照組）ΔCt 平均值-（各樣品）ΔCt 值］，每個樣品設3 個復孔。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 24.0 統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計量資料使用（）表示，兩組獨立、正態(tài)、方差齊資料組間比較采用t檢驗，多組間比較采用重復測量方差，繪制受試者工作特征曲線（ROC）曲線評估外周血NLR、VEGF、miRNA let-7a 水平對喉癌患者有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的診斷價值，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 三組外周血NLR、VEGF、miRNA let-7a 水平比較

外周血NLR、VEGF：喉癌組＞對照組＞健康組，miRNA let-7a：喉癌組＜對照組＜健康組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 三組外周血NLR、VEGF、miRNA let-7a水平比較（±s）Table 1 Comparison of levels of peripheral blood NLR，VEGF and miRNA let-7a among the three groups（±s）

表1 三組外周血NLR、VEGF、miRNA let-7a水平比較（±s）Table 1 Comparison of levels of peripheral blood NLR，VEGF and miRNA let-7a among the three groups（±s）

注：與對照組相比，aP＜0.05；與健康組相比，bP＜0.05。

2.2 有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況喉癌患者外周血NLR、VEGF、miRNA let-7a 水平比較

60 例喉癌患者中無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28 例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移32 例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者NLR、VEGF 水平均明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，miRNA let-7a 表達明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況喉癌患者外周血NLR、VEGF、miRNA let-7a 水平比較（±s）Table 2 Comparison of levels of peripheral blood NLR，VEGF and miRNA let-7a in patients with laryngeal cancer and presence or absence of lymph node metastasis（±s）

表2 有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況喉癌患者外周血NLR、VEGF、miRNA let-7a 水平比較（±s）Table 2 Comparison of levels of peripheral blood NLR，VEGF and miRNA let-7a in patients with laryngeal cancer and presence or absence of lymph node metastasis（±s）

2.3 外周血NLR、VEGF、miRNA let-7a 對喉癌患者有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的診斷價值

繪制NLR、VEGF、miRNA let-7a 診斷喉癌患者有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的ROC 曲線，NLR、VEGF、miRNA let-7a 及其聯(lián)合檢測的AUC 分別為0.733、0.807、0.752、0.894（P＜0.05）。見表3、圖1。

表3 外周血NLR、VEGF、miRNA let-7a 診斷喉癌患者有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的ROC 曲線分析Table 3 ROC curve analysis of peripheral blood NLR，VEGF and miRNA let-7a in the diagnosis of presence or absence of lymph node metastasis in patients with laryngeal cancer

圖1 ROC 曲線Figure 1 ROC curves

3 討論

喉癌是頭頸部常見的原發(fā)惡性腫瘤，早期確診并制定針對性治療方案對改善患者預后具有重要意義［8］。影響喉癌患者預后的因素較多，其中具有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者病死率明顯較高［9］。探索敏感實驗室指標早期預測喉癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況十分必要。

NLR 作為反映機體炎癥免疫的標志，其水平升高提示體內(nèi)形成利于腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的炎癥微環(huán)境，該環(huán)境可抑制細胞凋亡，促進血管生成，進而刺激腫瘤生長，同時，淋巴細胞的減少表明腫瘤防御機制下降，與腫瘤發(fā)生、進展有關［10］。在這種炎癥反應的情況下，中性粒細胞增殖，釋放進入血液，外周血中粒細胞計數(shù)升高，炎癥反應加重，淋巴細胞功能被抑制，腫瘤進展加速，機體抗腫瘤反應受到抑制，從而影響患者預后。NLR 已在胃癌、結(jié)腸癌、肺癌等多種實體腫瘤中證實與患者預后顯著相關［11］。腫瘤血管生長在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有重要作用，VEGF 作為血小板衍生生長因子家族的重要成員，在人體多個組織中均廣泛分布，是特異性高、作用強的血管形成調(diào)控因子［12］。VEGF 通過與受體結(jié)合特異性作用于血管內(nèi)皮，能提高血管通透性，刺激血管內(nèi)皮細胞增殖，形成新生血管，從而參與腫瘤生長、轉(zhuǎn)移，因此VEGF 能夠作為腫瘤發(fā)生及進展的標志物［13］。外周血循環(huán)中miRNA是評估某些疾病和預后的重要標志物，let-7a 是第二個被發(fā)現(xiàn)的miRNA，其序列、表達模式、調(diào)控功能均高度保守［14］。let-7a 家族能夠維持人類正常生理功能，其與原癌基因結(jié)合，抑制靶基因的表達，影響其穩(wěn)定性，導致原癌基因降解，參與腫瘤的發(fā)生及發(fā)展，同時，其還可通過調(diào)節(jié)多種致癌信號起到腫瘤抑制作用［15］。本研究結(jié)果表明外周血NLR、VEGF、miRNA let-7a 均參與到喉癌的發(fā)生，這一結(jié)果可為喉癌新的腫瘤標志物檢測提供依據(jù)。

本文還發(fā)現(xiàn)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者NLR、VEGF 更高，miRNA let-7a 更低，提示外周血NLR、VEGF、miRNA let-7a 可參與喉癌進展。NLR 水平越高，意味著機體炎癥水平越高，使得機體對腫瘤抑制作用下降，利于腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移，故有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者NLR 水平更高。VEGF 是血管形成標志物，而微血管生成和腫瘤的持續(xù)生長、轉(zhuǎn)移及侵襲有密切關系，因此有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者VEGF 水平更高。研究指出，let-7a 可通過抑制高遷移率族蛋白A2 的mRNA 和蛋白表達，進而抑制喉癌細胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移［16］。對伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者而言，機體對喉癌細胞增殖、侵襲抑制作用下降，可能與miRNA let-7a 表達下降后，機體對高遷移率族蛋白A2 負向調(diào)控作用減弱有關。高偉等［17］研究顯示，NLR 升高與聲門上型喉癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關。王永寶等［18］報道曾指出，血清VEGF、miRNA let-7a 對喉癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及復發(fā)均有一定預測價值。上述報道均支持本研究結(jié)果。本研究ROC 結(jié)果顯示，NLR、VEGF、miRNA let-7a 分別為0.733、0.807、0.752，進一步證實了NLR、VEGF、miRNA let-7a 對喉癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有預測價值；三組聯(lián)合檢測的AUC 為0.894，說明三者聯(lián)合檢測的價值更高，提示臨床或可通過NLR、VEGF、miRNA let-7a聯(lián)合檢測早期預測喉癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風險。

綜上所述，喉癌患者外周血NLR、VEGF 水平明顯升高，miRNA let-7a 表達降低，三者與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有一定相關性，能夠輔助臨床診斷喉癌患者有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，為臨床診斷和治療提供一定參考依據(jù)，臨床需對外周血NLR、VEGF 水平升高、miRNA let-7a 表達降低的患者應給予密切觀察。