基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析DDX27在肝細(xì)胞癌中的預(yù)后價(jià)值

朱翠雯 馬甜甜 段怡平 陳梁玥 李東旭 柳家翠 喻明霞 楊桂

肝細(xì)胞癌（liver hepatocellular carcinoma，LIHC）是一種高死亡率的原發(fā)性肝癌，是肝癌的主要組織學(xué)亞型，極少數(shù)的肝癌為膽管細(xì)胞癌及混合型［1］。我國(guó)是肝癌的高發(fā)國(guó)家，發(fā)病率和死亡率均處于較高水平，這可能與我國(guó)是乙肝大國(guó)相關(guān)。肝癌起病隱匿，在發(fā)現(xiàn)時(shí)往往已經(jīng)是晚期，且預(yù)后較差，故手術(shù)切除治療的效果不佳［2］。肝癌預(yù)后差的原因在于其復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率高，移植是治療晚期肝癌最有效的方法。肝癌的發(fā)生與長(zhǎng)期大量飲酒、丙型病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝病、乙型病毒性肝炎等因素相關(guān)，我國(guó)肝癌發(fā)生的主要原因是乙型病毒性肝炎，其中肝硬化是肝癌最大的危險(xiǎn)因素［3］。2021年的癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，肝癌的五年生存率極低，僅18%［4］。目前，肝細(xì)胞癌的診斷是通過(guò)計(jì)算機(jī)斷層掃描或磁共振成像以確認(rèn)，如果放射學(xué)檢查結(jié)果不確定，可以考慮肝活檢或重復(fù)成像以確認(rèn)［5］。早發(fā)現(xiàn)早治療是降低肝癌死亡率的最佳方式，因此研究者在尋找肝癌的腫瘤標(biāo)志物方面進(jìn)行了大量的研究，以期為肝癌的早期診斷提供更好的依據(jù)。

DEAD-BOX RNA 解旋酶（DEAD-Box Helicase 27，DDX27）基因是一種蛋白質(zhì)編碼基因。研究表明，DDX27基因與乳腺癌，胃癌，結(jié)直腸癌等的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，通過(guò)增強(qiáng)干細(xì)胞樣的特性來(lái)促進(jìn)乳腺癌的發(fā)展，能夠抑制細(xì)胞凋亡［6-8］。然而，目前關(guān)于DDX27基因與肝細(xì)胞癌之間的預(yù)后價(jià)值尚無(wú)報(bào)道。本研究基于癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)中2021 年8月25 日之前納入的肝細(xì)胞癌的表達(dá)數(shù)據(jù)及臨床數(shù)據(jù)，分析DDX27基因在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)差異，并對(duì)該基因與肝細(xì)胞癌的臨床特征以及預(yù)后相關(guān)進(jìn)行探討，最后分析了DDX27基因相關(guān)的信號(hào)通路。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)的下載與處理

在TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)官方網(wǎng)站（https：//portal.gdc.cancer.gov/）下載肝細(xì)胞癌RNA-seq（level 3，HTSeq-FPKM）數(shù)據(jù)，其中包括肝細(xì)胞癌組織樣本374 例，正常肝組織樣本50 例。利用R.4.0.3 軟件和Strawberry Perl 5.32.0.1 軟件對(duì)下載的基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，轉(zhuǎn)化后用于后續(xù)分析。在TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)下載并提取肝細(xì)胞癌患者的臨床病理特征信息，僅保留生存時(shí)間、生存狀態(tài)、年齡、性別、Stage 分期、T 分期、N 分期、M 分期信息均完整的患者數(shù)據(jù)。

1.2 DDX27 基因表達(dá)與臨床特征及預(yù)后的相關(guān)性分析

根據(jù)DDX27在肝細(xì)胞癌患者中表達(dá)水平的中位值，將肝細(xì)胞癌患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。使用IBM SPSS Statistics 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析DDX27表達(dá)與患者的年齡、性別、Grade 分期、Stage 分期、T 分期、M 分期、N 分期的相關(guān)性。使用OncoLnc在線數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.oncolnc.org/）、GEPIA 在線數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//gepia.cancer-pku.cn/）以及Kaplan-Meier Plotter 在線數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//kmplot.com/analysis/）驗(yàn)證DDX27與患者總體生存率（overall survival，OS）的關(guān)系。根據(jù)TCGA-LIHC 數(shù)據(jù)庫(kù)中肝細(xì)胞癌患者的生存數(shù)據(jù)，結(jié)合DDX27的表達(dá)量，使用單因素和多因素cox 回歸分析對(duì)DDX27在肝細(xì)胞癌患者中的預(yù)后價(jià)值進(jìn)行研究。

1.3 基因富集分析

使用GSEA 4.1.0 軟件進(jìn)行基因富集分析。以MsigDB（Molecular Signature Database）數(shù)據(jù)庫(kù)中的c2.cp.kegg.v7.0.symbols.gmt 數(shù)據(jù)集作為功能基因集。采用缺省加權(quán)富集統(tǒng)計(jì)的方法，隨機(jī)組合次數(shù)設(shè)為1 000 次。以P＜0.05 和錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）小于0.05 的基因集作為顯著富集的基因集。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；計(jì)數(shù)資料以n（%）表示；使用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)分析DDX27在肝細(xì)胞癌樣本和肝正常組織樣本中的表達(dá)差異；采用卡方檢驗(yàn)對(duì)DDX27表達(dá)與患者臨床特征進(jìn)行相關(guān)性分析；生存分析使用Kaplan-Meier法；cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型用于評(píng)價(jià)DDX27的預(yù)后意義；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DDX27在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)

在TCGA-LIHC 數(shù)據(jù)集中，與正常組織相比，腫瘤組織中的DDX27表達(dá)顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1A-B。UALCAN 數(shù)據(jù)庫(kù)的結(jié)果顯示，與TCGA 結(jié)果一致，腫瘤組織的表達(dá)量顯著高于正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1C。

2.2 DDX27與肝細(xì)胞癌患者臨床病理特征的聯(lián)系

低表達(dá)組與高表達(dá)組之間的臨床特征比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。DDX27與Grade 分期有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 DDX27表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者臨床特征的相關(guān)性分析［n（%）］Table 1 Analysis of the correlation between DDX27 expression and clinical characteristics of patients with liver hepatocellular carcinoma［n（%）］

2.3 DDX27表達(dá)與肝細(xì)胞癌預(yù)后的關(guān)系

在TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中，DDX27的表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者的總體生存率相關(guān)，且高表達(dá)組的總體生存率顯著低于低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2A；Kaplan-Meier Plotter、GEPIA、OncoLnc 在線數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證了TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)的結(jié)果，見圖2B-D。單因素和多因素cox 回歸分析結(jié)果見表2。

圖2 DDX27 與肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的相關(guān)性分析Figure 2 Analysis of the relationship between DDX27 and prognosis of patients with liver hepatocellular carcinoma

表2 肝細(xì)胞癌患者單因素和多因素cox 回歸分析Table 2 univariate and multivariate cox regression analysis of patients with liver hepatocellular carcinoma

2.4 基因富集分析結(jié)果

GSEA 分析結(jié)果顯示，DDX27主要參與了20條信號(hào)通路（P＜0.05，F(xiàn)DR＜0.05）。其中包括了RNA 降解、細(xì)胞周期、核苷酸切除修復(fù)、胞質(zhì)DNA傳感通路、同源重組、嘌呤代謝等致癌相關(guān)的途徑。見表3、圖3。

表3 DDX27 基因功能富集分析結(jié)果Table 3 results of functional enrichment analysis of DDX27 gene

圖3 DDX27 基因高表達(dá)樣本相關(guān)富集基因集Figure 3 High expression of DDX27 gene in samples correlated with enrichment of gene sets

3 討論

目前對(duì)于肝癌的早期篩查主要是通過(guò)影像學(xué)和血清學(xué)聯(lián)合監(jiān)測(cè)，甲胎蛋白是最常用的血清學(xué)標(biāo)志物，超聲檢測(cè)是最常用的影像學(xué)手段［9-11］。血清甲胎蛋白≥400 ng/mL 超過(guò)1 個(gè)月，排除妊娠、慢性或活動(dòng)性肝病、生殖腺胚胎源性腫瘤及其他消化道腫瘤后，高度提示肝細(xì)胞癌。但由于肝癌起病隱匿，進(jìn)展迅速，大多數(shù)患者在確診時(shí)已經(jīng)處于中晚期，因此，早期篩查和診斷成為提高肝細(xì)胞癌的生存率的關(guān)鍵。

為了早發(fā)現(xiàn)早治療，研究者從分子層面進(jìn)行了大量研究，發(fā)現(xiàn)與肝細(xì)胞癌密切相關(guān)的基因有PTEN基因、p53基因、IGF-2基因、TGF-α基因、c-myc基因、ras基因等，這些基因直接參與介導(dǎo)肝癌的發(fā)生、發(fā)展［12-14］。DDX27編碼的以保守基序Asp-Glu-Ala-Asp（DEAD）為特征的DEAD 盒蛋白屬于RNA 解旋酶，參與許多涉及RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)改變的細(xì)胞過(guò)程，例如RNA 運(yùn)輸、RNA 降解、葡萄糖代謝、脂質(zhì)代謝、核糖體生物合成、腫瘤發(fā)生、發(fā)展等多種過(guò)程［6，15-17］。該蛋白參與5.8S 和28S 核糖體RNA 的加工，其定位于核仁，并與PeBoW 復(fù)合物相互作用以確保47S rRNA 的正確3′末端形成［18］。

研究表明DDX27的上調(diào)能增強(qiáng)和延長(zhǎng)TNF-α介導(dǎo)的NF-κB 信號(hào)通路，而NF-кB 是參與腫瘤起始、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵，調(diào)控因子NF-κB 通路的增強(qiáng)表明DDX27可能促進(jìn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的過(guò)程，從而促進(jìn)乳腺癌和結(jié)直腸癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移［6-7］。此外，DDX27基因在胃癌中的表達(dá)上調(diào)亦有報(bào)道［8］。DDX27能夠增強(qiáng)干細(xì)胞樣特性，抑制細(xì)胞凋亡從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展［6］。這些研究結(jié)果都表明了DDX27在腫瘤中扮演了重要的角色，可作為人類腫瘤的新型分子標(biāo)志物。

本研究通過(guò)對(duì)TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，并且在多個(gè)在線數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)DDX27mRNA 在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)顯著上調(diào)，高表達(dá)患者的總體生存率顯著低于低表達(dá)患者，單因素和多因素cox 分析結(jié)果均提示DDX27與肝細(xì)胞癌的不良預(yù)后相關(guān)。并且利用GSEA 富集分析發(fā)現(xiàn)DDX27通過(guò)調(diào)控多種分子途徑參與肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展，如參與RNA 降解、細(xì)胞周期、核苷酸切除修復(fù)等途徑。以上研究提示，抑制DDX27的表達(dá)，阻斷DDX27介導(dǎo)的信號(hào)通路或許可以成為肝細(xì)胞癌的診斷和治療策略。

綜上，DDX27在肝細(xì)胞癌中高表達(dá)，并與腫瘤的惡性程度相關(guān)，高表達(dá)的DDX27提示患者預(yù)后不良。DDX27可以作為肝細(xì)胞癌的一個(gè)獨(dú)立預(yù)后因素，并有望成為肝細(xì)胞癌治療的新型分子靶點(diǎn)。