基于血管緊張素Ⅱ/一氧化氮信號通路探究N-芐苯乙烯胺對妊娠期高血壓模型大鼠的干預(yù)機制

劉艷，劉曉夏，朱一麟

作者單位：1武漢市第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北 武漢 430022；2華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北 武漢430022

妊娠期高血壓（HDCP）是一種妊娠期女性特有疾病［1-3］。有研究表示，我國女性生育平均年齡呈現(xiàn)上升趨勢，HDCP 發(fā)病率也一直居高不下，因此越來越多的專家學(xué)者致力于HDCP 臨床治療的研究［4-5］。有研究顯示，酪氨酸蛋白激酶2（JAK2）∕信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）∕細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1（SOCS1）通路與細胞分化、血管內(nèi)皮損傷等密切相關(guān)，血管內(nèi)皮損傷在HDCP 的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［6］。本研究于2021年1—5月設(shè)計、實施實驗，建立HDCP 大鼠模型，使用JAK2 抑制劑N-芐苯乙烯胺（AG490）進行干預(yù)，觀察干預(yù)效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 選取30只SD 健康雌性大鼠及10只SD 健康雄性大鼠［湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，使用許可證號：SYXK（湘）2020-0010］，周齡范圍8～9 周，周齡（8.5±0.4）周；體質(zhì)量范圍219～237 g，體質(zhì)量（228.2±7.2）g，在溫度（24.1±2.8）℃環(huán)境中飼養(yǎng)，光照12 h∕d。本研究符合一般動物實驗倫理學(xué)原則。

1.1.2主要試劑 小鼠抗兔血肌酐、血尿素氮抗體（Hyclone 公司）；小鼠抗大鼠C 反應(yīng)蛋白（CRP）抗體（BD 公司）；兔抗大鼠白細胞介素-1β（IL-1β）抗體（Selleck 公司）；大鼠抗小鼠血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、一氧化氮（NO）抗體（Dako 公司）；大鼠抗小鼠過氧化脂、過氧化氫酶（CAT）（Gibco 公司）；兔抗大鼠JAK2、STAT3 抗體（Sigma 公司）；小鼠抗兔SOCS1 抗體（Invitrogen公司）。

1.2 建模及分組自30只SD健康雌性大鼠中采用隨機數(shù)字表法挑選10只雌鼠為正常組，不做任何處理。其余20 只雌鼠建立HDCP 模型：以2∶1 比例將20只雌鼠與10只雄鼠合籠過夜，次日清晨對雌鼠進行陰道涂片檢查，發(fā)現(xiàn)精子即為孕鼠，未發(fā)現(xiàn)精子則繼續(xù)與雄鼠合籠，直至檢查發(fā)現(xiàn)陰道出現(xiàn)精子。所有大鼠于孕12 d 皮下注射125 mg·kg-1·d-1一氧化氮合成酶抑制劑，正常組大鼠皮下注射同劑量蒸餾水，孕鼠出現(xiàn)血壓升高、蛋白尿情況為建模成功。使用隨機數(shù)字表法將20 只HDCP 大鼠分為HDCP組、AG490 組各10 只，孕18 d 起，AG490 組大鼠腹腔注射5 mg∕kg AG490，正常組、HDCP 組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。三組大鼠均連續(xù)干預(yù)7 d。

1.3 指標(biāo)檢測

1.3.1血壓水平檢測 于大鼠受孕20 d 時使用微動脈血壓檢測儀檢測大鼠尾動脈收縮壓、舒張壓水平，計算平均動脈壓。所有大鼠在呼吸平穩(wěn)狀態(tài)下檢測5次，取平均值。

1.3.2腎功能指標(biāo)檢測 取各組大鼠腹部靜脈血3 mL，2 000 r∕min 離心15 min 后-40 ℃保存。免疫透射比濁法，340、700 nm 波長處測定免疫復(fù)合物濁度，計算血肌酐、血尿素氮水平。收集大鼠24 h 尿液，使用酶法檢測各組大鼠24 h尿蛋白。

1.3.3酶聯(lián)免疫吸附實驗法檢測炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激指標(biāo)及AngⅡ、NO 水平 對酶標(biāo)板進行標(biāo)記，設(shè)置對照、標(biāo)準(zhǔn)、測定孔，對照孔加終止液、顯色劑，標(biāo)準(zhǔn)孔內(nèi)加入稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品，測定孔內(nèi)加血清及抗體，封膜后震蕩均勻，使用37 ℃保溫箱保存，1 h 后去膜清洗，將水分吸干后三孔均加入顯色劑震蕩，顯色后添加終止液，450 nm 處測吸光值，計算CRP、IL-1β、過氧化脂、CAT、AngⅡ、NO水平。

1.3.4胎鼠情況觀察 各組大鼠麻醉后進行剖宮產(chǎn)，取出胎鼠及胎盤組織，檢測各組大鼠胎鼠體長、體質(zhì)量及胎盤質(zhì)量。

1.3.5蛋白質(zhì)印跡法檢測JAK2∕STAT3∕SOCS1 通路蛋白相對表達量 取各組大鼠胎盤組織，提取50 μg 蛋白，煮至蛋白變性后進行SDS-PAGE 凝膠電泳處理，依據(jù)蛋白分子將凝膠切開、轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，封閉液（Western）室內(nèi)封閉待測、內(nèi)參蛋白，1.5 h 后添加待測蛋白抗體（1∶1 000）、內(nèi)參抗體（1∶2 000），孵育24 h后取出，使用Western 洗滌液清洗5 次，添加山羊抗兔抗體（1∶5 000），Western 洗滌液洗滌后顯色、曝光、成像，檢測JAK2、STAT3、SOCS1相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法使用SPSS 26.0 軟件分析，計量資料采用描述，多組間比較采用方差齊性檢驗，進行單因素方差分析，組間采用LSD-t檢驗比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠血壓、平均動脈壓水平比較如表1所示，與正常組比較，HDCP 組、AG490 組大鼠血壓、平均動脈壓水平較高（P＜0.05）；與HDCP 組比較，AG490 組大鼠血壓、平均動脈壓水平較低（P＜0.05）。

表1 三組大鼠血壓水平比較∕（mmHg，）

表1 三組大鼠血壓水平比較∕（mmHg，）

注：①與正常組比較，P＜0.05。②與HDCP組比較，P＜0.05。

2.2 三組大鼠腎功能比較如表2 所示，與正常組比較，HDCP 組、AG490 組大鼠24 h 尿蛋白、血肌酐、血尿素氮水平較高（P＜0.05）；與HDCP 組比較，AG490 組大鼠24 h 尿蛋白、血肌酐、血尿素氮水平較低（P＜0.05）。

表2 三組大鼠腎功能比較∕

表2 三組大鼠腎功能比較∕

注：①與正常組比較，P＜0.05。②與HDCP組比較，P＜0.05。

2.3 三組大鼠炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激指標(biāo)水平比較如表3所示，與正常組比較，HDCP組、AG490組大鼠CRP、IL-1β、過氧化脂水平較高，CAT 水平較低（P＜0.05）；與HDCP 組比較，AG490 組大鼠CRP、IL-1β、過氧化脂水平較低，CAT水平較高（P＜0.05）。

表3 三組大鼠炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激指標(biāo)水平比較/

表3 三組大鼠炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激指標(biāo)水平比較/

注：CRP為C反應(yīng)蛋白，IL-1β為白細胞介素-1β，CAT為過氧化氫酶，HDCP為妊娠期高血壓，AG490為N-芐苯乙烯胺。①與正常組比較，P＜0.05。②與HDCP組比較，P＜0.05。

2.4 三組大鼠胎盤質(zhì)量、胎鼠體長、體質(zhì)量比較如表4所示，與正常組比較，HDCP組、AG490組大鼠胎盤質(zhì)量、胎鼠體長、體質(zhì)量較低（P＜0.05）；與HDCP 組比較，AG490組大鼠胎盤質(zhì)量、胎鼠體長、體質(zhì)量較高（P＜0.05）。

表4 三組大鼠胎盤質(zhì)量，胎鼠體長、體質(zhì)量比較∕

表4 三組大鼠胎盤質(zhì)量，胎鼠體長、體質(zhì)量比較∕

注：HDCP為妊娠期高血壓，AG490為N-芐苯乙烯胺。①與正常組比較，P＜0.05。②與HDCP組比較，P＜0.05。

2.5 三組大鼠AngⅡ、NO水平比較如表5 所示，與正常組比較，HDCP 組、AG490 組大鼠AngⅡ水平較高，NO 水平較 低（P＜0.05）；與HDCP 組比較，AG490 組大鼠AngⅡ水平較低，NO 水平較高（P＜0.05）。

表5 三組大鼠AngⅡ、NO水平比較/

表5 三組大鼠AngⅡ、NO水平比較/

注：AngⅡ為血管緊張素Ⅱ，NO 為一氧化氮，HDCP 為妊娠期高血壓，AG490為N-芐苯乙烯胺。①與正常組比較，P＜0.05。②與HDCP組比較，P＜0.05。

2.6 三組大鼠JAK2/STAT3/SOCS1 通路蛋白表達比較與正常組比較，HDCP 組、AG490 組大鼠JAK2、STAT3、SOCS1 相對表達量較高（P＜0.05）；與HDCP 組比較，AG490 組大鼠JAK2、STAT3、SOCS1相對表達量較低（P＜0.05）。見表6，圖1。

圖1 三組大鼠JAK2、STAT3、SOCS1表達的蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果

表6 三組大鼠JAK2∕STAT3∕SOCS1通路蛋白表達比較∕

表6 三組大鼠JAK2∕STAT3∕SOCS1通路蛋白表達比較∕

注：JAK2 為酪氨酸蛋白激酶2，STAT3 為信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3，SOCS1 為細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1，HDCP 為妊娠期高血壓，AG490為N-芐苯乙烯胺。①與正常組比較，P＜0.05。②與HDCP組比較，P＜0.05。

3 討論

HDCP 癥狀若得不到及時有效的控制，病情嚴(yán)重的病人甚至可能最終發(fā)展為多器官功能衰竭，嚴(yán)重威脅妊娠結(jié)局甚至孕婦生命安全［7-8］。藥物治療為常用的治療HDCP 的手段，但是尚無一種特效的治療HDCP 的藥物，加之妊娠期的特殊性，導(dǎo)致HDCP 癥狀臨床治療難度較大［9-11］。本研究顯示，HDCP大鼠血壓、平均動脈壓水平較高，使用AG490 干預(yù)的HDCP 大鼠血壓、平均動脈壓水平較低。有學(xué)者在研究中表示，隨著HDCP的發(fā)生發(fā)展，血壓水平出現(xiàn)一定程度的上升，抑制HDCP 病人血壓水平上升對HDCP 病人妊娠結(jié)局的改善具有重要意義［12-13］。本研究結(jié)果說明，HDCP 大鼠血壓水平異常升高，使用AG490 干預(yù)能夠降低HDCP 大鼠血壓水平，分析其原因可能是在AG490 的干預(yù)下，HDCP 大鼠平滑肌松弛，外周血管阻力下降，從而出現(xiàn)血壓水平下降的結(jié)果。

本研究發(fā)現(xiàn)，HDCP 大鼠24 h 尿蛋白、血肌酐、血尿素氮水平相對較高，使用AG490 干預(yù)的HDCP大鼠24 h 尿蛋白、血肌酐、血尿素氮水平則相對較低。隨著HDCP 的發(fā)展，機體腎功能會出現(xiàn)一定程度的損傷，改善腎功能在HDCP 病人病情恢復(fù)中具有重要作用［14-15］。24 h 尿蛋白、血肌酐、血尿素氮為常用的評價腎功能的指標(biāo)。本研究說明，HDCP 大鼠腎功能出現(xiàn)損傷，在AG490的干預(yù)下，HDCP 大鼠腎功能損傷情況減輕，針對此研究結(jié)果，推測其原因可能是AG490干預(yù)起到了抑制HDCP大鼠鈣離子內(nèi)流、擴張平滑肌的作用，從而改善HDCP 大鼠腎功能。

本研究發(fā)現(xiàn)，HDCP 大鼠CRP、IL-1β、過氧化脂水平較高，CAT 水平較低，使用AG490 干預(yù)的HDCP大鼠CRP、IL-1β、過氧化脂水平下降，CAT 水平上升。有研究表示，HDCP 癥狀的發(fā)生發(fā)展伴隨著一定程度的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)［16-18］。CRP、IL-1β為廣譜炎癥指標(biāo)，過氧化脂、CAT 常用于氧化應(yīng)激反應(yīng)的評價。本研究說明，HDCP 大鼠出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)，在AG490 的干預(yù)下，HDCP 大鼠炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)嚴(yán)重程度減輕，說明AG490 干預(yù)能夠通過減輕HDCP 大鼠炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)起到干預(yù)效果。

本研究發(fā)現(xiàn)，HDCP 大鼠AngⅡ水平相對較高，NO 水平相對較低，使用AG490 干預(yù)的HDCP 大鼠AngⅡ水平下降，NO 水平上升。HDCP 癥狀的發(fā)展伴隨著機體血管內(nèi)皮收縮、舒張功能障礙［19-20］。本研究說明，HDCP 大鼠血管內(nèi)皮收縮、舒張功能出現(xiàn)明顯異常，在AG490的干預(yù)下，HDCP 大鼠血管內(nèi)皮功能得到有效提升。有學(xué)者通過動物實驗研究表示，抑制JAK2∕STAT3∕SOCS1 通路蛋白表達能夠起到提升妊高癥大鼠血管內(nèi)皮功能的作用［21］?；诖?，本研究對JAK2∕STAT3∕SOCS1 通路蛋白進行檢測，發(fā)現(xiàn)HDCP 大鼠JAK2、STAT3、SOCS1 相對表達量較高，使用AG490 干預(yù)的HDCP 大鼠JAK2、STAT3、SOCS1 表達下調(diào)，說明AG490 干預(yù)能夠靶向調(diào)控JAK2∕STAT3∕SOCS1 通路，從而達到改善大鼠內(nèi)皮功能的目的。

綜上所述，使用JAK2抑制劑AG490對HDCP模型大鼠進行干預(yù)，能夠改善大鼠血壓水平、腎功能水平，減輕炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激減輕，改善胎鼠狀況，大鼠內(nèi)皮功能得到提升，其原因可能是AG490能夠調(diào)控JAK2∕STAT3∕SOCS1 通路蛋白表達，為后續(xù)研究提供了一定的理論依據(jù)。