坤泰膠囊對圍絕經(jīng)期大鼠血管內(nèi)皮損傷及卵巢組織中血管內(nèi)皮生長因子和胰島素樣生長因子-1表達的影響

李艷瑩，范立磊，吳玲玲，張潔莉，王秀娟，李慧蕓

作者單位：1邢臺醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校第二附屬醫(yī)院婦科，河北 邢臺 054000；2邢臺市平鄉(xiāng)縣人民醫(yī)院內(nèi)科，河北 邢臺 054500；3邢臺醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校教研處，河北 邢臺054000

衰老是正常的生理過程，卵巢是對衰老最敏感的器官。卵巢老化的主要特征是卵泡數(shù)量和卵母細胞質(zhì)量下降［1］。圍絕經(jīng)期是女性衰老的最主要標(biāo)志，絕經(jīng)后，隨著卵巢功能的下降，卵巢的抗氧化能力可能會降低［2］。圍絕經(jīng)期婦女過多的卵巢活性氧（ROS）產(chǎn)生會破壞細胞的脂質(zhì)、脂肪酸和蛋白質(zhì)組成，從而破壞細胞的正常結(jié)構(gòu)和功能［3］。中醫(yī)認為腎虛是其卵巢老化的基礎(chǔ)病因，沖任氣血失調(diào)是其發(fā)病的主要機制，包含虛、實兩個方面，虛者由于沖任虧敗，源斷其流；實者因邪氣阻隔沖任，經(jīng)血不通。而西醫(yī)則認為卵巢老化、功能衰退與自身免疫、遺傳、先天酶缺乏、醫(yī)源性等因素有關(guān)，尤其是長期憂郁、焦慮等不良情緒、不規(guī)律的飲食起居等生活習(xí)慣對卵巢功能有較大的損傷。坤泰膠囊是一種經(jīng)典的中藥方劑，最早見于《傷寒雜病論》［4］。坤泰膠囊的處方由熟地黃、黃連、白芍、黃芩、阿膠及茯苓等6 種中草藥組成，主要用于改善女性圍絕經(jīng)期相關(guān)癥狀［5］。先前的研究表明，坤泰膠囊與亮丙瑞林聯(lián)合治療子宮內(nèi)膜異位時，坤泰膠囊能明顯降低陰道出血率和乳房脹痛的發(fā)生率［6］。有研究發(fā)現(xiàn)，坤泰膠囊能通過其抗氧化和抗凋亡作用，對毒性藥物誘導(dǎo)的大鼠子宮和卵巢毒性起到預(yù)防作用［7］。但有關(guān)坤泰膠囊對圍絕經(jīng)期大鼠血管內(nèi)皮及卵巢組織保護作用的研究較少，坤泰膠囊對延緩卵巢衰老的作用機制也尚未闡明。本研究于2017年5月至2018 年1 月以圍絕經(jīng)期雌性大鼠和原代培養(yǎng)的卵巢顆粒細胞為研究對象，探討坤泰膠囊是否具有保護卵巢功能的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物40只SPF雌性SD 大鼠，12月齡，體質(zhì)量（348.00±40.05）g，購于河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物公共服務(wù)平臺，許可證號：SCXK（冀）2020-001。坤泰膠囊（0.5 克∕粒）購于貴陽新天藥業(yè)股份有限公司，批號Z20000083，實驗中用蒸餾水配置成混懸液進行大鼠灌胃。實驗方案符合中華人民共和國科技部《實驗動物管理國家標(biāo)準(zhǔn)及規(guī)范》。所有大鼠均飼養(yǎng)在（25±3）℃恒溫環(huán)境內(nèi)，12 h 為一個光暗周期，可以自由獲取食物和水。由于體質(zhì)量對圍絕經(jīng)期大鼠激素分泌水平有明顯影響，因此采用隨機區(qū)組設(shè)計對大鼠進行分組。首先對40 只大鼠進行稱重，將大鼠根據(jù)體質(zhì)量從大到小分為10 個區(qū)，即每個區(qū)4 只大鼠。在每個區(qū)中，再利用隨機數(shù)字表法隨機抽取大鼠分別進入對照組（n=10）、坤泰膠囊低劑量組（L-KT 組，n=10）、坤泰膠囊中劑量組（M-KT組，n=10）、坤泰膠囊高劑量組（H-KT 組，n=10）。對照組：給予大鼠灌胃對照溶液；L-KT 組：給予坤泰膠囊灌胃1.0 g∕kg；M-KT 組：給予坤泰膠囊灌胃2.0 g∕kg；H-KT 組：給予坤泰膠囊灌胃4.0 g∕kg，每天一次，連續(xù)12 w。為了評估大鼠發(fā)情周期的不同階段，在治療前和治療后的15 d 里，每天檢查陰道涂片。陰道涂片用0.04%錐蟲藍染色，用明視場顯微鏡觀察細胞學(xué)特征。本研究符合一般動物實驗倫理學(xué)原則。

1.2 卵巢顆粒細胞原代培養(yǎng)成年雌性SD 大鼠（21日齡）皮下注射孕馬血清促性腺激素50 IU，48 h后處死。取卵巢立即用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗，置于DMEM∕F12 培養(yǎng)液中。在解剖顯微鏡下對卵泡進行針刺，收獲顆粒細胞，然后用200 μm 不銹鋼網(wǎng)過濾純化。1 000g離心5 min 后，將細胞懸浮于培養(yǎng)基中，用血細胞計數(shù)儀計數(shù)。將細胞接種于96 孔板（1×105個∕孔）或6 孔板（1×107個∕孔），在含有15%胎牛血清、睪酮、100 U∕mL 青霉素和100 g∕L 鏈霉素的DMEM∕F12 培養(yǎng)基中37 ℃和5%二氧化碳培養(yǎng)48 h，使細胞貼壁。將細胞按隨機數(shù)字表法分為五組：對照組、H2O2干預(yù)組、H2O2聯(lián)合3 種濃度的坤泰膠囊（5 μM、20 μM 和50 μM）干預(yù)，培養(yǎng)6 h后，用放射免疫法測定培養(yǎng)液中雌二醇的生成量。提取細胞總蛋白，用蛋白質(zhì)印跡法檢測蛋白表達。

1.3 細胞活力測定采用CCK-8 比色法測定細胞存活率。培養(yǎng)結(jié)束時，向96 孔板中細胞中加入200 μl DMEM∕F12+20 μL CCK-8 試劑，37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育3 h。使用微型平板閱讀器在450 nm 波長下測量每個孔的光密度（OD）值。根據(jù)公式，細胞相對活力=實驗組OD 值∕對照組平均OD 值進行計算。每組設(shè)5 個復(fù)孔，每次測量至少重復(fù)3次。采用放射免疫法測定雌二醇、卵泡刺激素（FSH）和黃體生成素（LH）水平。

1.4 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測采用RT-PCR 檢測卵巢組織中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和胰島素樣生長因子-1（IGF-1）的mRNA 表達。用TRIzol 試劑提取卵巢總RNA。根據(jù)供應(yīng)商的說明，使用PrimeScript first Strand cDNA 合成試劑盒從2 μg 總RNA 合成互補DNA（cDNA）。使用SYBR PreMix Ex TaqμⅡ試劑盒和10 μL 的SYBR PreMix Ex Taq?Ⅱ試劑盒，進行實時定量?擴增，將基因的表達水平歸一化為β-肌動蛋白mRNA 的表達水平。使用應(yīng)用生物系統(tǒng)7500 型進行實時聚合酶鏈反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95 °C 5 min，95 °C 30 s，63°C 50 s，72 °C 60 s，30 個循環(huán)，72 °C 5min。基因引物序列見表2。目的基因的相對表達量由2-ΔΔCt計算表示。見表1。

表1 基因引物序列

1.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測蛋白表達提取細胞總蛋白，利用BCA 蛋白分析試劑盒進行蛋白質(zhì)定量。用10% SDS-PAGE 分離總蛋白（20 μg），并將其轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。將5%脫脂奶粉溶于含0.1%吐溫20 的Tris-Buffer 溶液中進行封閉，然后與VEGF 多克隆抗體（1∶1 000 稀釋，美國Abcam 公司）、IGF-1多克隆抗體（1∶1 000稀釋，美國Abcam公司）、GAPDH 單克隆抗體（1∶1 000 稀釋，美國Abcam公司）在4 ℃下孵育過夜。第2 天，PBS 洗膜3 次，與辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的山羊抗兔IgG 抗體在室溫下孵育1 h。在暗室加入適量的ECL 光液顯影固定，掃描條帶后用ImageJ 軟件進行灰度值分析，計算蛋白質(zhì)的相對表達量。

1.6 HE 染色及免疫組化HE 染色：分離卵巢組織，在4%多聚甲醛緩沖液中固定48 h，石蠟包埋切片。用旋轉(zhuǎn)式切片機將組織切割成厚度為5 μm 的連續(xù)切片。切片用二甲苯脫蠟，用梯度濃度乙醇脫水，然后用蘇木素和伊紅染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察。免疫組織化學(xué)：取大鼠卵巢石蠟切片，二甲苯脫蠟，分級濃度乙醇脫水。在95 ℃的檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0）中孵育20 min，然后在室溫下冷卻1 h。切片用0.3%H2O2在暗室中處理10 min，以抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性。阻斷非特異性反應(yīng)30 min 后，與VEGF、IGF-1 兔多克隆抗體在4 ℃孵育12 h。然后，與二抗在37 ℃孵育1 h，再用DAB和蘇木素進行復(fù)染。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 20.0 和GraphPad Prism 5.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料采用表示，多組間比較采用隨機區(qū)組設(shè)計的方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 坤泰膠囊對大鼠一般情況及動情周期的影響用坤泰膠囊治療圍絕經(jīng)期大鼠15 d，每日陰道細胞學(xué)檢查測定其動情周期。雌性大鼠的正常發(fā)情周期為4～5 d，可分為動情前期、動情前期、動情后期和動情間期四個時期。所有15 月齡大鼠的動情周期均終止于動情期（50%）或動情間期（50%），表明所有大鼠的動情周期均已終止。與對照組相比，3 種劑量的坤泰膠囊對圍絕經(jīng)期大鼠的發(fā)情周期均無明顯影響。見表2。

表2 坤泰膠囊對大鼠發(fā)情周期的影響∕只

2.2 坤泰膠囊對大鼠主動脈血管壁結(jié)構(gòu)的影響HE染色顯示，對照組大鼠主動脈內(nèi)皮可見凸起或缺損改變，動脈中膜明顯增厚，內(nèi)膜結(jié)構(gòu)紊亂，層次分界欠佳。L-KT 組、M-KT 組、H-KT 組大鼠主動脈內(nèi)皮細胞均有不同程度改善，未見明顯凸起或缺損改變，內(nèi)膜相對光滑，血管壁各層次分界清晰。見圖1。

圖1 坤泰膠囊對大鼠主動脈血管壁結(jié)構(gòu)的影響（HE染色×40）

2.3 坤泰膠囊對大鼠宮腔壁結(jié)構(gòu)的影響HE 染色顯示，對照組、L-KT 組大鼠宮腔壁明顯較薄，柱狀上皮失去部分正常結(jié)構(gòu)，細胞排列紊亂，腺體數(shù)量減少。M-KT組、H-KT組大鼠宮腔壁結(jié)構(gòu)明顯改善，柱狀上皮結(jié)構(gòu)相對完整，細胞排列整齊，黏膜層出現(xiàn)腺體。見圖2。

圖2 坤泰膠囊對大鼠子宮宮腔壁結(jié)構(gòu)的影響（HE染色×200）

2.4 坤泰膠囊對大鼠卵巢形態(tài)學(xué)改變的影響7為驗證坤泰膠囊對圍絕經(jīng)期大鼠卵巢形態(tài)學(xué)改變的影響，對卵巢石蠟切片進行HE 染色，結(jié)果顯示，對照組大鼠卵巢呈現(xiàn)明顯的衰老特征，表現(xiàn)為卵泡儲備耗竭，卵巢間質(zhì)致密，卵巢基質(zhì)比例明顯增加。與對照組相比，L-KT 組、M-KT 組、H-KT 組大鼠的原始卵泡數(shù)量、竇狀卵泡數(shù)目都有一定程度的恢復(fù)，結(jié)構(gòu)趨于改善。見表3。

表3 四組大鼠各級卵泡數(shù)量比較∕（個，）

表3 四組大鼠各級卵泡數(shù)量比較∕（個，）

注：①與對照組比較，P＜0.05。②與L-KT組比較，P＜0.05。③與M-KT組比較，P＜0.05。

2.5 坤泰膠囊對圍絕經(jīng)期大鼠血清激素水平的影響與對照組相比，L-KT 組、M-KT 組、H-KT 組大鼠外周血雌二醇水平逐漸升高（P＜0.05），F(xiàn)SH、LH 水平顯著下降（P＜0.05）。兩兩比較后發(fā)現(xiàn)，H-KT組大鼠雌二醇水平顯著高于L-KT 組、M-KT 組，而H-KT組大鼠FSH、LH 水平顯著低于L-KT 組、M-KT 組，均差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表4 坤泰膠囊對圍絕經(jīng)期大鼠血清激素水平的影響∕

表4 坤泰膠囊對圍絕經(jīng)期大鼠血清激素水平的影響∕

注：FSH為卵泡刺激素，LH為黃體生成素。①與對照組比較，P＜0.05。②與L-KT 組比較，P＜0.05。③與MKT組比較，P＜0.05。

2.6 坤泰膠囊對圍絕經(jīng)期大鼠卵巢VEGF、IGF-1表達的影響RT-PCR 檢測結(jié)構(gòu)顯示，對照組、L-KT組、M-KT 組、H-KT 組VEGF mRNA 相對表達量分別為1±0.1、1.6±0.2、2.3±0.4、3.1±0.4，IGF-1 mRNA 相對表達量分別為1±0.1、1.4±0.1、2.1±0.3、2.8±0.5，HKT組VEGF mRNA、IGF-1 mRNA相對表達量均顯著高于其他組。蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果與RT-PCR 結(jié)果趨勢一致。這表明，坤泰膠囊可以提高圍絕經(jīng)期大鼠卵巢中VEGF、IGF-1 的mRNA 及蛋白的表達。見圖3。

圖3 坤泰膠囊對圍絕經(jīng)期大鼠卵巢VEGF、IGF-1表達的影響

2.7 免疫組化檢測VEGF、IGF-1 蛋白表達采用免疫組化進一步檢測VEGF、IGF-1 蛋白的表達和定位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VEGF、IGF-1 在卵巢中的表達主要定位于生長卵泡顆粒細胞和黃體細胞。與對照組相比，L-KT 組、M-KT 組、H-KT 組大鼠卵巢組織中VEGF、IGF-1蛋白的陽性表達率顯著更高。見圖4。

圖4 免疫組化檢測大鼠卵巢組織血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、胰島素樣生長因子-1（IGF-1）蛋白表達（免疫組化法×200）

2.8 坤泰膠囊對大鼠卵巢顆粒細胞活力和雌二醇產(chǎn)生的影響CCK-8法檢測坤泰膠囊對體外培養(yǎng)的顆粒細胞活力的影響。與對照組相比，H2O2（400 μM）組細胞存活率下降約40%（P＜0.01）。然而，當(dāng)H2O2與不同濃度的坤泰膠囊（5 μM、20 μM、50 μM）共同作用時，我們發(fā)現(xiàn)20 μM 和50 μM 的坤泰膠囊可以挽救H2O2誘導(dǎo)的細胞損傷（P＜0.001），提示坤泰膠囊對體外培養(yǎng)的顆粒細胞具有保護作用。此外，采用放射免疫法檢測了坤泰膠囊對培養(yǎng)的顆粒細胞產(chǎn)生雌激素的影響。結(jié)果表明，經(jīng)H2O2處理后，雌激素分泌量較對照組減少約39%（P＜0.001）。見表5。

表5 坤泰膠囊對大鼠卵巢顆粒細胞活力和雌二醇產(chǎn)生的影響∕

表5 坤泰膠囊對大鼠卵巢顆粒細胞活力和雌二醇產(chǎn)生的影響∕

注：①與對照組比較，P＜0.05。②與H2O2干預(yù)組比較，P＜0.05。

3 討論

在本研究中，我們利用12 月齡的SD 大鼠模擬圍絕經(jīng)期女性的生理狀態(tài)。首先，通過測定圍絕經(jīng)期雌性大鼠的動情周期，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，12 月齡大鼠都已進入圍絕經(jīng)期，發(fā)情周期不規(guī)則或延長。給予坤泰膠囊干預(yù)后，與對照組相比，坤泰膠囊干預(yù)組大鼠動情周期無明顯變化。這表明，坤泰膠囊對維持或逆轉(zhuǎn)圍絕經(jīng)期大鼠的動情周期沒有明顯作用。圍絕經(jīng)期時，雌激素水平下降，而LH 和FSH 水平升高。有研究發(fā)現(xiàn)，中藥制劑人參皂苷Rg3 可抑制胎盤和卵巢微粒體中雄烯二酮芳轉(zhuǎn)化為雌酮，抑制睪酮芳轉(zhuǎn)化為雌二醇。也可發(fā)揮大鼠卵巢細胞對氯化鎘誘導(dǎo)的生殖激素失衡的保護作用［8］。FSH 和LH 與卵巢組織的生長和生殖活性的控制密切相關(guān)［9］，在絕經(jīng)期、卵巢切除術(shù)后及早熟性卵巢衰竭患者中，可檢測到FSH 明顯上升，F(xiàn)SH 與LH 之間及FSH與雌激素之間的異常關(guān)系與多囊卵巢病等密切相關(guān)［10］。LH濃度升高多見于性腺功能減退，男性多見于原發(fā)性睪丸衰竭和精細管發(fā)育不全等［11］。坤泰膠囊的處方由熟地黃、黃連、白芍、黃芩、阿膠及茯苓等6種中草藥組成［12］，劉穎等［13］研究發(fā)現(xiàn)，高劑量阿膠干預(yù)后小鼠子宮系數(shù)明顯增大，血清雌二醇水平升高，血清FSH、LH 水平降低，這表明，阿膠對正常雌性小鼠具有一定的雌激素樣作用。魏丹、張旭東［14］報道稱，含茯苓成分的膠囊可顯著改善卵巢早衰大鼠性激素水平，減少卵巢細胞凋亡，這可能與抑制Fas∕FasL信號通路有關(guān)。對大鼠外周血激素進行檢測后發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，L-KT 組、M-KT 組、H-KT 組大鼠外周血雌二醇水平逐漸升高，F(xiàn)SH、LH水平顯著下降。尤其H-KT 組效果最為顯著，這表明，高劑量坤泰膠囊對大鼠外周血激素失衡的調(diào)節(jié)作用最為明顯。

雌激素在體內(nèi)具有血管保護效應(yīng)［15］。動物試驗和臨床流行病學(xué)資料顯示，雌激素具有降低血脂，抑制血小板黏附聚集，抑制血管平滑肌細胞增殖、遷移和細胞外基質(zhì)合成的作用，從而發(fā)揮抗動脈硬化效應(yīng)［16］。絕經(jīng)后由于雌激素減少，血液中膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、三酰甘油水平上升。本研究通過HE 染色發(fā)現(xiàn)，對照組大鼠主動脈內(nèi)皮可見凸起或缺損改變，動脈中膜明顯增厚，內(nèi)膜結(jié)構(gòu)紊亂，層次分界欠佳經(jīng)坤泰膠囊干預(yù)后，各組大鼠主動脈內(nèi)皮細胞均有不同程度改善，內(nèi)膜相對光滑，血管壁各層次分界清晰。這表明，坤泰膠囊在改善大鼠激素水平及卵巢功能的同時，對大鼠血管功能也有一定的保護作用。

IGF-1 能調(diào)節(jié)心臟的生理和病理狀況，具有舒張血管，降低血管阻力，增加器官血流量的作用［17］。VEGF 是主要的血管生成調(diào)節(jié)因子，參與內(nèi)皮細胞生理的多個方面。生物信息學(xué)分析表明，VEGF 與核編碼的線粒體基因在小鼠多種生理條件下緊密共表達，在新陳代謝中起著關(guān)鍵作用［18-19］。本研究發(fā)現(xiàn)，坤泰膠囊可以提高圍絕經(jīng)期大鼠卵巢中VEGF、IGF-1 的mRNA 及蛋白的表達。這表明，坤泰膠囊可能通過促進血管生成、調(diào)節(jié)生殖激素改善卵巢儲備功能。為了進一步證實體內(nèi)實驗結(jié)果，我們將原代卵巢顆粒細胞在H2O2和3種濃度坤泰膠囊培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，坤泰膠囊可以修復(fù)H2O2誘導(dǎo)的細胞損傷，提示坤泰膠囊對體外培養(yǎng)的卵巢顆粒細胞的具有保護作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，坤泰膠囊對圍絕經(jīng)期大鼠的血管功能有一定保護作用，且能通過促進卵巢細胞中VEGF、IGF-1的表達促進卵巢功能。

（本文圖1，2，4見插圖6-3）