高效液相色譜法測定玉米中玉米赤霉烯酮

◎ 房文苗，王小蘭，季德媛，周元元

（揚州市食品藥品檢驗檢測中心，江蘇 揚州 225000）

玉米是我國重要的糧食作物和食品原料，在生長、運輸和儲藏過程中，經(jīng)常會受到真菌毒素的污染，玉米赤霉烯酮則是世界上污染糧食最廣泛的真菌毒素之一。玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）又名F2 毒素，1962 年由Stob 等從發(fā)霉玉米中分離得到，是一種由禾谷鐮刀菌、三線鐮刀菌、木賊鐮刀菌、粉紅鐮刀菌和串珠鐮刀菌等多種鐮刀菌屬真菌產(chǎn)生的有毒次級代謝產(chǎn)物[1]，具有分布廣、繁殖快、耐熱、代謝產(chǎn)物多、毒性大和殘留時間長等特性。玉米赤霉烯酮的毒性會引起雌性綜合征，有著強烈的致畸作用，會破壞生殖系統(tǒng)，影響內(nèi)臟器官發(fā)育[2]，對人和動物的健康產(chǎn)生極大危害，對糧食經(jīng)濟造成嚴重損失。

現(xiàn)階段，對糧食中玉米赤霉烯酮的檢測方法主要有液相色譜法、熒光光度法、液相色譜-質(zhì)譜法[3]和膠體金快速定量法[4]。液相色譜法是目前使用最廣泛、最權(quán)威的檢測方法，可以高效且快速地對玉米赤霉烯酮進行定量檢測和定性分析。與其他檢測方法相比較，高效液相色譜法在毒素檢測方面有著靈敏度高、重復(fù)性好、分離效率高以及分析速度快的優(yōu)勢[5]，且主觀影響因素少，容易操作。該方法的原理是利用有機溶劑作為提取試劑，將玉米中的玉米赤霉烯酮提取出來，玉米赤霉烯酮在免疫親和柱內(nèi)和抗體相結(jié)合，之后洗滌去除未和抗體相結(jié)合的無關(guān)物質(zhì)，達到凈化效果，用甲醇洗脫后收集，用帶有熒光檢測器的高效液相色譜儀測定。根據(jù)樣品中的各組分在色譜柱內(nèi)保留時間和峰面積，用外標法對樣品中玉米赤霉烯酮含量進行測定。

1 材料和方法

1.1 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（1260，安捷倫），配備FLD 熒光檢測器；全自動平行濃縮儀（Auto EVA 80，?？疲?；低溫連續(xù)錘式旋風磨（TWD-5000，同信天博）；電子天平（XSR204，梅特勒-托利多），感量0.01 g；離心機（Centrifuge5430，艾本德）；固相萃取儀（24-ports SPE Vacuum，美國MEDIWAX），含真空泵；超純水機（Milli-Q Reference，密理博）。

1.2 材料與試劑

乙腈（色譜純，Dikma）；甲醇（色譜純，Supelco）；氯化鈉（分析純，國藥集團）；玉米赤霉烯酮標準物質(zhì)（50.1 mg·L-1，上海安譜）；玉米赤霉烯酮免疫親和柱（江蘇蘇微）；玻璃纖維濾紙（普瑞邦）；有機濾膜（0.22 μm，Millipore）；實驗過程中用水為一級純化水。

1.3 實驗方法

1.3.1 試劑配制

提取液：量取420 mL 乙腈和80 mL 水，混合均勻備用；流動相：量取46 mL 乙腈、46 mL 水和8 mL甲醇，混合均勻備用。

1.3.2 樣品提取

取500 g 左右玉米樣品，去除樣品中雜質(zhì)，經(jīng)錘式旋風磨粉碎（過40 目篩），混合均勻，稱取40 g（準確到0.1 g）均勻試樣，加入4 g 氯化鈉和100 mL 樣品提取液，渦旋混勻儀高速提取15 ～20 min，用定量濾紙進行過濾，移取10.0 mL 濾液加入40 mL 水稀釋混勻，經(jīng)玻璃纖維濾紙過濾，取上清液備用。

1.3.3 樣品凈化

取10 mL 樣液過免疫親和柱，控制樣液的過柱速度穩(wěn)定在1 ～2 滴/s，直至有空氣進入；用5 mL 水淋洗免疫親和柱，控制流速為1 ～2 滴/s，直至有空氣進入；用1.5 mL 甲醇洗脫免疫親和柱，自然重力下收集全部洗脫液于試管中，用氮吹儀在55 ℃條件下吹至近干；加入1 mL 流動相溶解殘留物，經(jīng)漩渦混勻器混勻，有機濾膜（孔徑0.22 μm）過濾，收集濾液于進樣瓶，上液相色譜儀檢測。

1.3.4 標準溶液的配制

準備50.1 mg·L-1玉米赤霉烯酮標準物質(zhì)溶液，準確移取1 mL，用流動相定容到10 mL 容量瓶中，得到濃度為5 μg·mL-1的標準溶液；再用流動相按梯度將5 μg·mL-1的 標 準 溶 液 配 制 成10.16 ng·mL-1、50.80 ng·mL-1、101.60 ng·mL-1、203.20 ng·mL-1和508.00 ng·mL-1的標準工作液。

1.3.5 液相色譜實驗條件

檢測器：FLD 熒光檢測器；檢測器波長：激發(fā)波長274 nm，發(fā)射波長440 nm；色譜柱：C18柱（4.6 mm×150 mm，3.5 μm）；柱溫：35 ℃；流動相：V乙腈∶V水∶V甲醇=46 ∶46 ∶8；進樣量：100 μL；流速：1.0 mL·min-1；樣品采集時間：15 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線

將配制的標準溶液上機檢測，以玉米赤霉烯酮標準溶液的濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標，生成標準曲線圖，見圖1。玉米赤霉烯酮線性范圍 為10.16 ～508.00 ng·mL-1， 標 準 曲 線 方 程 為y=0.043 4x+0.011 8，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 93。測定20 次樣品空白，計算得到標準偏差，按照3 倍標準偏差/標曲斜率得到檢出限。通過計算，得出玉米赤霉烯酮的檢出限為0.12 μg·kg-1。

圖1 玉米赤霉烯酮標準曲線圖

2.2 回收率、精密度和準確度

取玉米陰性樣品，選取玉米赤霉烯酮最高殘留限量（MRL）[6]、最低檢出限以及一中間合適點，進行3 水平的加標回收試驗[7]，同時對回收率部分進行3水平添加測試，對變異系數(shù)進行考查，結(jié)果見表1。經(jīng)檢測得出回收率為84.0%～92.4%，按照國家標準GB/T 27404—2008 附錄F 中F.1 回收率要求，被測組分含量＜0.1 mg·kg-1時，回收率為60%～120%，變異系數(shù)為0.8%～2.6%，滿足標準要求。取一陰性樣品加標準品，基于“最低檢出限”進行加標，平行測定兩次，分析結(jié)果見表2。測得偏差為-1.5%。標準GB/T 27404—2008 附錄F 中F.5 準確度的要求為-20%～+10%，滿足標準要求。

表1 回收率和精密度表

表2 準確度表

2.3 樣品凈化效率對比

在實驗中樣品的提取對實驗結(jié)果有很大的影響。在樣品前處理過程中，樣品中存在的色素等雜質(zhì)干擾較大，會導致玉米赤霉烯酮提取液在過免疫親和柱過程中會出現(xiàn)阻塞、抗原抗體結(jié)合不充分等情況。以玉米粉中的玉米赤霉烯酮質(zhì)控樣為例，本文對比了水和PBS 緩沖液對提取液進行稀釋后玉米赤霉烯酮的凈化效果，結(jié)果如表3 所示。PBS 緩沖液稀釋的提取液回收率優(yōu)于水稀釋的提取液，原因在于PBS 緩沖液可以平衡玉米赤霉烯酮提取液的pH，為抗原抗體之間的免疫結(jié)合提供一個穩(wěn)定條件，從而提高玉米赤霉烯酮和抗體的結(jié)合效率。

表3 檢測結(jié)果對比表

3 結(jié)論

存在于玉米等糧食作物中的玉米赤霉烯酮嚴重危害人體健康，利用高效液相色譜法可以有效且準確地對樣品的玉米赤霉烯酮進行檢測，此方法檢出限低且有著較高的準確度和精密度。其中用PBS 緩沖液稀釋樣品提取液可以提升樣品的凈化效率，加強玉米赤霉烯酮和免疫親和柱內(nèi)抗體的結(jié)合，提高回收率。