HPLC-MS/MS 同時(shí)測(cè)定紹興黃酒中15 種活性成分的含量

◎ 倪慧慧，錢 菁，章媛媛，求杰英，楊慧萍，陳媛媛

（1.新昌縣食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，浙江 新昌 312500；2. 新昌縣市場(chǎng)監(jiān)督管理局，浙江 新昌 312500）

黃酒源于中國(guó)，且唯中國(guó)有之，其釀造和飲用歷 史已有5 000 余年，是我國(guó)傳統(tǒng)的發(fā)酵食品，在世界三大釀造酒（黃酒、葡萄酒和啤酒）中占有重要地位，被稱為“國(guó)酒”[1]。黃酒的釀造主要選用稻米、黍米、小米、小麥等為原料，經(jīng)選米、浸泡、蒸米、加曲、糖化、發(fā)酵、壓榨、過濾、煎酒、貯存、勾兌等多個(gè)環(huán)節(jié)制作而成[2]，其特殊的釀造工藝會(huì)產(chǎn)生和保留許多對(duì)人體有益的活性和功能性成分，如氨基酸、核苷、生物堿等[3-6]，具有較高的營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值，周建弟等[7-9]發(fā)現(xiàn)黃酒具有抗氧化、增強(qiáng)體質(zhì)、提高新陳代謝、保護(hù)心血管功能等生理功效。

在民間，黃酒的藥用功能早被先人所知，自古以來被認(rèn)為是“百藥之長(zhǎng)”，具有通絡(luò)、益氣、活血、行氣等保健作用，特別是在許多中醫(yī)方子中常將黃酒作為藥引。據(jù)中醫(yī)典籍《湯液醪醴論》記載，黃酒“得天地之和，高下之宜，故能至完，伐取得時(shí)，故能至堅(jiān)也”。李時(shí)珍在《本草綱目》中也多次提及，黃酒入藥有行藥勢(shì)之功效，可見黃酒是中醫(yī)藥上重要的輔料和藥引子[10]。因此，充分了解中國(guó)傳統(tǒng)黃酒的營(yíng)養(yǎng)、保健功能尤為重要，這能從根本上改變消費(fèi)者對(duì)黃酒的認(rèn)知。

現(xiàn)有文獻(xiàn)顯示，對(duì)于黃酒中活性物的研究目前只停留在定性的基礎(chǔ)上，尚缺乏深入研究，因此，必須加強(qiáng)對(duì)黃酒中有效成分的研究，以推進(jìn)我國(guó)黃酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前市場(chǎng)上黃酒的品牌很多。其中，浙江紹興黃酒是黃酒中地位顯著、歷史悠久、最有代表性的產(chǎn)品，其以精白糯米、優(yōu)質(zhì)小麥和鑒湖水為主要原料，采用自然發(fā)酵工藝釀造而成的優(yōu)質(zhì)黃酒，本試驗(yàn)以高品質(zhì)的傳統(tǒng)紹興黃酒為試驗(yàn)對(duì)象，使用HPLC-MS/MS 對(duì)黃酒中篩選的活性物含量進(jìn)行測(cè)定，可以為黃酒的保健功能提供一定的科學(xué)依據(jù)，提升黃酒的知名度和價(jià)值，從而加快黃酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 儀器、試劑與材料

1.1 儀器

Agilent 1260-6470 高效液相—三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜(美國(guó)Agilent 公司)；KQ-5200B 超聲波清洗機(jī)(昆山超聲儀器有限公司，超聲功率500 W，40 kHz)；BSA2245 型電子分析天平(德國(guó)賽多利斯公司)。

1.2 試劑

對(duì) 照 品 組 胺（ 批 號(hào)70678）、 賴 氨 酸（ 批號(hào)710001）、精氨酸（批號(hào)71197）、胞苷（批號(hào)70160）、腺苷（批號(hào)70166）、纈氨酸（批號(hào)77288）、脯氨酸（批號(hào)77408）、尿苷（批號(hào)70164）、胸苷（批號(hào) 200202）、肌苷（批號(hào)70691）、4-氨基丁酸（批號(hào)77415）、酪胺（批號(hào)77616）、鳥苷（批號(hào)71086）、色胺（批號(hào)71579）、反-對(duì)香豆酸（批號(hào)71726）購(gòu)自壇墨質(zhì)檢科技有限公司，純度＞98%。試驗(yàn)用水為超純水(由Millipore 純水器制備)，甲醇為色譜純(德國(guó)默克公司)；甲酸、甲酸銨(色譜純，Macklin 公司)。試樣為市售的不同品牌黃酒，黃酒品牌具體信息如表1 所示。

表1 不同品牌黃酒名稱、發(fā)酵年份及廠家信息表

2 試驗(yàn)方法

2.1 溶液配制

精密稱取對(duì)照品組胺、賴氨酸、精氨酸、胞苷、腺苷、纈氨酸、脯氨酸、尿苷、胸苷、肌苷、4-氨基丁酸、酪胺、鳥苷、色胺、反-對(duì)香豆酸各5.00 mg，置于10 mL 容量瓶，分別加水定容至刻度（加入1 mol·L-1NaOH 溶液助溶），得最終濃度為0.5 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，儲(chǔ)備液分別用水稀釋成一定濃度，最終配制混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，4 ℃存放備用。

2.2 供試品溶液的制備

將不同品牌待測(cè)黃酒過0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.3 色譜條件

色譜柱：Agilent Poroshell 120 HILIC-Z（3.0 mm×100 mm，2.7 μm）。流動(dòng)相：A，水(含0.1%甲酸和5 mmol甲酸銨)；B，甲醇。柱溫：40 ℃。進(jìn)樣量：1 μL。梯度洗脫條件表見表2。

表2 梯度洗脫條件表

2.4 質(zhì)譜條件

離子源：ESI 源；電噴霧電壓：3 500 V；干燥氣和碰撞氣：氮?dú)?；離子源溫度：300 ℃；霧化器壓力：310.275 kPa；鞘氣溫度：250 ℃；鞘氣流：11 L·min-1。采用MRM 模式對(duì)樣品進(jìn)行定量分析。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察

精密吸取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用水將其稀釋至不同濃度，進(jìn)行測(cè)定，記錄各成分的色譜峰面積，以色譜峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，對(duì)照品溶液的濃度（X，μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.5.2 精密度試驗(yàn)

取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液稀釋至一定濃度，重復(fù)測(cè)定6 次，以色譜峰面積積分值計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品，按供試品制備方法平行制備6 份，分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜峰面積積分值，計(jì)算RSD。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液放置0，1，4，6，12，24，48 h后進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜峰面積積分值，計(jì)算RSD。

2.5.5 回收率試驗(yàn)

取供試品儲(chǔ)備液，用水稀釋至一定含量，精密量取已知含量的供試品溶液9 份，每份1 mL，分成3 組，每組3 份，分別精密添加相當(dāng)于已知含量的15 種對(duì)照品的混合對(duì)照品溶液0.5，1.0，1.5 mL，制備供試品溶液進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算平均回收率及RSD。

2.5.6 含量測(cè)定

分別精密吸取14 批不同品牌的黃酒，制備供試品溶液進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算。

3 試驗(yàn)結(jié)果及分析

3.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

通過核苷、生物胺和氨基酸的結(jié)構(gòu)可知，其在正離子模式下電離較為穩(wěn)定，且正離子模式下核苷、生物胺和氨基酸具有較高的靈敏度和較清晰的質(zhì)譜圖，更易確認(rèn)分子離子峰。因此，選擇正離子模式作為核苷、生物胺和氨基酸的離子化模式。15 種成分的質(zhì)譜具體參數(shù)、提取離子色譜圖分別見表3 及圖1。

圖1 15 種成分的提取離子流圖

表3 對(duì)照品質(zhì)譜信息表

（續(xù)表3）

3.2 色譜條件優(yōu)化

HILIC 模式色譜柱適用于分析在反相色譜柱上沒有保留的極性或強(qiáng)化合物，對(duì)強(qiáng)極性物質(zhì)有很好的保留，本試驗(yàn)選擇HILIC-Z 色譜柱進(jìn)行分離。另外，對(duì)流動(dòng)相（甲醇-水、乙腈-水）、添加劑（甲酸銨、乙酸銨等）、柱溫等進(jìn)行考察，結(jié)果表明：采用水( 含0.1% 甲酸和5 mmol 甲酸銨) 及甲醇作為流動(dòng)相時(shí)，可以提高檢測(cè)靈敏度和改善化合物的峰形，各物質(zhì)的響應(yīng)也有所提高。

3.3 方法學(xué)考察結(jié)果

15 個(gè)成分的線性方程及范圍如表4 所示。由表4可知，各化合物峰面積響應(yīng)值與濃度呈良好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)均大于0.999，可滿足檢測(cè)需求。精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性結(jié)果見表5，15 個(gè)成分的峰面積RSD 均小于5%，說明儀器精密度良好，該方法重復(fù)性良好，供試品在48 h 內(nèi)較穩(wěn)定。加樣回收試驗(yàn)中，15 個(gè)成分的加樣回收率均在95%～110%，RSD在0.35%～4.18%，表明方法準(zhǔn)確度良好，加樣回收率結(jié)果見表6。

表4 15 個(gè)成分的線性方程、相關(guān)系數(shù)及范圍表

表5 15 個(gè)成分的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性結(jié)果表

表6 15 個(gè)成分的加樣回收率結(jié)果表

3.4 樣品含量測(cè)定

通過文獻(xiàn)和試驗(yàn)研究，從黃酒中篩選15 種活性化合物，14 批不同品牌黃酒制備的供試品溶液中含量結(jié)果見表7。結(jié)果表明，14 批黃酒均檢測(cè)出組胺、色胺、酪胺、精氨酸、纈氨活性物酸、脯氨酸、賴氨酸、胞苷、尿苷、胸苷、4-氨基丁酸。不同品牌黃酒中精氨酸和賴氨酸含量都較高，且隨著釀造年份的增長(zhǎng)，不同氨基酸含量逐年遞增；核苷類成分（腺苷、鳥苷、胸苷等）在大部分品牌黃酒中都能鑒定到，核苷具有抗血小板聚集、抗心律失常、舒張血管等藥理活性，有學(xué)者[11-13]認(rèn)為核苷可能是補(bǔ)益食品的共同物質(zhì)基礎(chǔ)，是發(fā)揮黃酒保健功能的有效成分之一；其余成分（生物胺類、有機(jī)酸類等）在不同品牌黃酒中的含量差異不大。

表7 14 批不同品牌黃酒制備的供試品溶液活性物含量結(jié)果表（單位：μg·mg-1）

4 結(jié)論

黃酒是中國(guó)古老的酒種，被譽(yù)為“國(guó)粹”，深受消費(fèi)者的喜愛，且具有營(yíng)養(yǎng)保健功能，正逐步得到消費(fèi)者的認(rèn)可。本試驗(yàn)通過優(yōu)化試驗(yàn)條件和色譜方法，建立了HPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定紹興黃酒中氨基酸、核苷、生物胺、有機(jī)酸等成分的含量，該方法前處理簡(jiǎn)便，重復(fù)性、精密度、穩(wěn)定性均滿足定量分析要求，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，從而為檢測(cè)黃酒中活性成分的含量提供可靠試驗(yàn)方法，同時(shí)為更好地研究黃酒中的活性成分提供一定技術(shù)支持。