膠體金免疫層析法在豇豆農(nóng)藥殘留檢測中的應(yīng)用

◎ 潘喜芳，黃全書，施顯超，黃 霞，溫 娜，鐘英海，鐘昌宇

（1.廣西壯族自治區(qū)欽州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心, 廣西 欽州 535099；2. 廣西壯族自治區(qū)欽州市欽北區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，廣西 欽州 535000；3. 廣西壯族自治區(qū)欽州市浦北縣農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測站，廣西 欽州 535399；4. 廣西壯族自治區(qū)欽州市欽南區(qū)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測管理站，廣西 欽州 535099）

豇豆又名菜豆、蕃豆，屬茄科豇豆屬，原產(chǎn)南美洲秘魯和智利，我國各地均有栽培。近年來，我國對豇豆的研究十分重視，不僅在生產(chǎn)上大力推廣應(yīng)用豇豆品種、肥料配方與技術(shù)、農(nóng)藥科學(xué)使用技術(shù)等方面的研究成果，而且在科學(xué)管理措施下提高了種植效益。但由于環(huán)境因素和管理措施等影響，豇豆中一些農(nóng)藥殘留污染問題日趨嚴重。對豇豆中農(nóng)藥殘留的研究主要集中在生產(chǎn)加工環(huán)節(jié)、使用過程及殘留檢測方法方面，對于使用的農(nóng)藥在豇豆中是否存在高含量的殘留以及檢測技術(shù)等研究較少。同時，國內(nèi)外對豇豆農(nóng)藥殘留的檢測技術(shù)很少報道，在實際檢測中也難以保證豇豆農(nóng)藥殘留的準(zhǔn)確性。因此，迫切需要加強豇豆中農(nóng)藥殘留分析的研究。

近年來，廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳持續(xù)加大對豇豆的農(nóng)藥殘留監(jiān)測力度。2015 年開始連續(xù)7 年要求各地市開展豇豆專項抽檢，采用定量法檢測甲胺磷、滅多威、毒死蜱等13 種農(nóng)藥，2017 年增加氟蟲腈、啶蟲脒、苯醚甲環(huán)唑、烯酰嗎啉等29 種農(nóng)藥。2022 年，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部開始將豇豆列為例行監(jiān)測必抽品種，將吡唑醚菌酯、甲維鹽、滅蠅胺等常規(guī)農(nóng)藥和克百威、三唑磷、乙酰甲胺磷等禁用農(nóng)藥作為必檢參數(shù)，并把豇豆農(nóng)殘治理工作作為食品安全評議考核重點?！妒称钒踩珖覙?biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763—2021）規(guī)定最大殘留限量，克百威在豇豆上的限量值為≤ 0.02 mg·㎏-1，乙酰甲胺磷在豇豆上的限量值為≤ 0.02 mg·㎏-1，三唑磷在豇豆上的限量值為≤ 0.05 mg·㎏-1，吡唑醚菌酯在豇豆上的限量值為≤ 0.02 mg·㎏-1，滅蠅胺在豇豆上的限量值為≤0.5 mg·㎏-1，甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽在豇豆上的限量值為≤0.015 mg·㎏-1，氧樂果在豇豆上的限量值為≤0.02 mg·㎏-1，毒死蜱在豇豆上的限量值為≤0.5 mg·㎏-1，啶蟲脒在豇豆上的限量值為≤ 0.2 mg·㎏-1。

目前，現(xiàn)行有效地廣泛應(yīng)用在我國新鮮果蔬中農(nóng)藥殘留檢測的定性檢測方法分為酶抑制法和紙片法，檢測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)為GB/T 5009.199—2003，這2 種速測法只能進行有機磷類和氨基甲酸酯類檢測[1]。欽州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心嘗試使用膠體金免疫快檢技術(shù)快速檢測方法檢測豇豆中的克百威、乙酰甲胺磷、吡唑醚菌酯、滅蠅胺、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽等9 種農(nóng)藥，通過對其結(jié)果準(zhǔn)確性進行測定和評價（依據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳例行監(jiān)測和風(fēng)險評估等結(jié)果），并同三重四級桿液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀結(jié)果進行對比分析，以解決農(nóng)安監(jiān)管難題。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

豇豆；克百威、乙酰甲胺磷、三唑磷、吡唑醚菌酯、滅蠅胺、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、氧樂果、毒死蜱、啶蟲脒9 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液（天津農(nóng)業(yè)部環(huán)保科研監(jiān)測所）。

1.2 儀器設(shè)備

克百威、乙酰甲胺磷、三唑磷、吡唑醚菌酯、滅蠅胺、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、氧樂果、毒死蜱、啶蟲脒9 種農(nóng)藥膠體金免疫層析速測卡；渦漩振蕩器，三重四級桿液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀（島津LCMS8040）；乙 腈(HPLC，Tedia Company)， 甲 醇(HPLC，Tedia Company)， 乙 酸 銨(LC-MS 級，CNW Technologies)，氯化鈉、無水甲酸(LC-MS 級，天津市光復(fù)科技有限公司)，超純水(Millipore 超純水機制備)，微孔濾膜(0.22 μm，Agela Technologies），QuEChERS 凈化管[50 mg PSA+150 mg MgSO4，島津技邇（上海）貿(mào)易有限公司]。

2 檢測方法

2.1 膠體金免疫層析法

檢測原理：采用競爭抑制免疫層析原理。首先，提取樣品中的農(nóng)藥，將其與膠體金標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合；然后，抑制抗體和試紙中檢測線（T 線）上的抗原結(jié)合，從而產(chǎn)生檢測線顏色深淺的變化。通過對檢測線與控制線（C 線）顏色深淺進行比較，即可對樣品中的農(nóng)藥進行定性判斷[2]。

2.2 定量分析

2.2.1 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取25.00 g(精確至0.01 g)勻漿后的豇豆樣品于100 mL 離心管中，加入50 mL 乙腈，5 ～7 g NaCl，用高速分散機以12 000 r·min-1均質(zhì)提取2 min，以8 000 r·min-1高速離心5 min；吸取上清液1.5 mL置于QuEChERS 凈化離心管（50 mg PSA+150 mg MgSO4）中渦旋1 min，100 000 r·min-1離心5 min；取上清液過0.22 μm 濾膜，濾液待測。

2.2.2 色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件：SHIMADZUC18 柱子，色譜柱(φ1.9 μm，2.1 mm×100 mm)；柱溫：40 ℃，流速0.2 mL·min-1；進樣量1 μL；流動相A 為0.5 mmol·L-1醋酸銨+0.01%甲酸水溶液，流動相B 為乙腈；洗脫方式：梯度洗脫，有機相初始濃度為10%，4 min 有機相濃度50%，15 min 設(shè)置75%，17 ～20 min 設(shè)置95%。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子化離子模式（ESI）；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)掃描方式；離子源接口電壓：ESI+，+4.5 kV；ESI-，-3.5 kV；霧化氣：氮氣3 L·min-1；干燥氣：氮氣15 L·min-1；碰撞氣：氬氣；DL 管溫度：250 ℃；加熱模塊溫度：450 ℃；對9 種農(nóng)藥單標(biāo)溶液進行質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化，確定特征母離子和子離子。

3 實驗過程與結(jié)果分析

3.1 具體操作過程

制作3組樣品A、B、C，根據(jù)不同生產(chǎn)廠家（北京勤邦、廣州食源生物、美正生物）的膠體金檢出限值，對各組樣品添加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（0.02 ～2.00 mg·kg-1），每組樣品設(shè)置3 個平行樣，分別為A1、A2、A3；B1、B2、B3；C1、C2、C3。將不同生產(chǎn)廠家的膠體金試紙檢測結(jié)果與液質(zhì)聯(lián)用儀定量分析結(jié)果進行比對。

3.2 膠體金免疫層析法結(jié)果分析

表1 為三重四級桿液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀定量檢測結(jié)果。結(jié)果顯示，3 家公司生產(chǎn)的膠體金免疫層析速測卡檢測豇豆上的克百威、乙酰甲胺磷、三唑磷等9 種農(nóng)藥在檢出限范圍內(nèi)大多數(shù)都顯示陰性，超過檢出限范圍的顯示陽性，與液質(zhì)聯(lián)用儀定量檢測結(jié)果一致或者相似，偶爾出現(xiàn)假陰性。此方法具有準(zhǔn)確性高、針對性強，檢測條件受環(huán)境影響較小、檢測時間短等優(yōu)點，可以基本滿足《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》 (GB 2763-2021)中規(guī)定的果蔬農(nóng)藥殘留最大殘留量要求。

表1 三重四級桿液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀定量檢測結(jié)果表（mg·kg-1）

4 結(jié)論

農(nóng)藥殘留檢測方法是評價農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全水平的重要指標(biāo)之一，但目前許多檢測方法還存在一些不足。目前，我國已制定了30 多個農(nóng)藥殘留標(biāo)準(zhǔn)，但不同地區(qū)、不同環(huán)境中的殘留農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一且沒有相互銜接，這就導(dǎo)致了農(nóng)藥的使用不能做到科學(xué)合理。另外，在豇豆生產(chǎn)中，由于種植方式的差異、豇豆病蟲害發(fā)生復(fù)雜多樣等原因，部分種植者為了追求高產(chǎn)高效，違規(guī)使用有毒有害的農(nóng)藥，造成環(huán)境污染嚴重。因此，應(yīng)建立適用于豇豆等農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)經(jīng)營和銷售的殘留農(nóng)藥檢測標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范，從而保障豇豆生產(chǎn)安全和食用安全。由于我國對農(nóng)產(chǎn)品中殘留農(nóng)藥檢測技術(shù)尚缺乏成熟完善的經(jīng)驗。因此，要建立適用于豇豆種植和銷售過程中殘留農(nóng)藥檢測標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范，就需要充分考慮該農(nóng)產(chǎn)品在生產(chǎn)經(jīng)營、市場銷售過程中的各種環(huán)境條件，以及在這些環(huán)境條件下所產(chǎn)生的殘留農(nóng)藥種類、含量等方面因素的影響，這樣才能使這些方法更好地為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實踐服務(wù)。

目前，國內(nèi)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣及農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管部門、市場監(jiān)管部門、批發(fā)市場快速檢測室等使用的農(nóng)藥殘留速測儀，主要針對有機磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥[3]，但是無法檢測菊酯類農(nóng)藥殘留。膠體金免疫層析技術(shù)檢測快速、簡便、特異性強、靈敏度高，能滿足國家食品安全標(biāo)準(zhǔn)[4]。在已知施藥情況的果蔬農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)基地中，果蔬上市采摘前可以對相關(guān)農(nóng)產(chǎn)品進行半定量檢測[5]，此類快速檢測產(chǎn)品的方法適合在基層農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管中推廣應(yīng)用，適用于豇豆的種植和銷售過程中，農(nóng)藥殘留檢測標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范的建立及推廣應(yīng)用。