微生物有機肥對連作菜薹生長及土壤性質(zhì)的影響

郭巨先， 歐陽碧珊， 李桂花*， 符梅， 羅文龍， 駱善偉， 陸美蓮

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所，廣東省蔬菜新技術(shù)研究重點實驗室，廣州 510640；2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學院，廣州 510225）

菜薹（心）（Brassica parachinensisBailey）是十字花科蕓薹屬一、二年生草本植物，為我國華南地區(qū)的特產(chǎn)蔬菜之一，其風味佳、口感好、適應范圍廣，在湖南、江西、浙江、福建、北京、上海等地都有較大面積的種植[1]。菜心生長周期較短，有早、中、晚熟等多種類型，每年可以生產(chǎn)9～10茬，復種指數(shù)高，可以周年生產(chǎn)[2]。在生產(chǎn)過程中為了實現(xiàn)高產(chǎn)，農(nóng)民多采用過量施用化肥的生產(chǎn)模式。研究表明，長期連作會導致土壤地力下降、病蟲害嚴重、土壤酶活性降低、微生物環(huán)境惡化和作物品質(zhì)下降等一系列連作障礙問題[3-4]。蔬菜連作3 年以上會以每年10%～20%的速度減產(chǎn)，抗逆性也會降低，病蟲害更加嚴重[5-6]。生產(chǎn)上常常采用水旱輪作、多種作物輪作、間作等多種栽培模式來減少連作障礙的發(fā)生，增施有機肥和根際促生菌也是預防連作障礙的有效途徑[7-8]。研究表明，通過施用微生物菌肥，可以改善土壤的微生態(tài)環(huán)境，減少作物的發(fā)病率，提高作物的產(chǎn)量和品質(zhì)[9-12]。劉沙沙等[13]研究發(fā)現(xiàn)，有機肥替代75%的化肥可提高上海青產(chǎn)量、品質(zhì)和氮磷肥利用率。Gao 等[14]研究表明，增施雞糞和玉米秸稈等有機肥可以改善土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能，增強辣椒的抗病能力，降低土傳病害。柳玲玲等[15]研究表明，施用生物有機肥對土壤養(yǎng)分和微生物群落結(jié)構(gòu)及馬鈴薯的農(nóng)藝性狀、出苗率、產(chǎn)量和薯塊品質(zhì)均有改善。此外，雷菲等[16]研究發(fā)現(xiàn)，增施有機肥和減施化肥能顯著增加種植番茄土壤的有機質(zhì)含量，提升土壤pH，改善土壤微生物環(huán)境，提高番茄的產(chǎn)量和品質(zhì)?？梢姡┯梦⑸镉袡C肥或有機肥與化肥合理配施對提高肥料利用率、改善根際土壤環(huán)境、促進植物生長和提高其產(chǎn)量與品質(zhì)具有重要意義。然而，關(guān)于微生物有機肥在菜薹上應用效果的研究相對較少，對于施用微生物有機肥對菜薹連作的根際土壤影響的研究還未見報道。本文以‘粵薹1 號'菜薹為材料，研究不同施用量微生物有機肥對連作菜薹生長、品質(zhì)、根際土壤的理化性質(zhì)和微生物多樣性的影響，通過分析微生物有機肥對連作菜薹相關(guān)生長和營養(yǎng)指標、土壤根際的相關(guān)酶活性和生物多樣性的影響，確定合理的微生物有機肥施用方案，為連作菜薹種植生產(chǎn)中科學施用微生物有機肥、減少化肥用量、提高肥料利用率、改善土壤環(huán)境、解決連作障礙問題和避免農(nóng)田二次污染以及提高菜薹產(chǎn)量和品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗在廣東省農(nóng)業(yè)科學院白云試驗基地進行，試驗地前茬作物為菜薹，供試土壤為沙壤土，土壤初始性質(zhì)：pH 6.37，有機質(zhì)25.42 g·kg-1，堿解氮89.26 mg·kg-1，有效磷105.05 mg·kg-1，速效鉀295.5 mg·kg-1。

1.2 試驗材料

試驗品種‘粵薹1 號'菜薹由廣東省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所提供。微生物有機肥（以下稱有機肥）由四會綠參林農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司提供，N+P2O5+K2O≥5%，有機質(zhì)含量≥70%，pH 7.5。復合肥為挪威復合肥，由廣州市綠合益農(nóng)資連鎖有限公司提供(N∶P2O5∶K2O=15%∶15%∶15%)。

1.3 試驗設計

試驗設置T1、T2、T3、T4和對照（CK) 共5個處理，T1:有機肥3 000 kg·hm-2+復合肥225 kg·hm-2；T2:有機肥4 500 kg·hm-2+復合肥150 kg·hm-2；T3:有機肥6 000 kg·hm-2+復合肥75 kg·hm-2；T4:有機肥7 500 kg·hm-2；CK：復 合 肥300 kg·hm-2（詳 見表1）。所有肥料分4次施入。每個處理設置3次重復，每小區(qū)面積20 m2，隨機區(qū)組排列。于2021 年3 月10 日播種育苗，4 月2 日定植，4 月28 日在抽薹期采用五點取樣法取樣，分別測定菜薹的株高、薹長、單株質(zhì)量、主薹質(zhì)量和常規(guī)營養(yǎng)指標；并采集根際土壤2 份，用冰盒帶回實驗室，1 份在室內(nèi)自然風干后測定土壤酶活和土壤肥效指標；另1份直接測定土壤微生物數(shù)量，同時取CK和T4處理的土壤送百邁克生物科技有限公司測定土壤微生物多樣性。

表1 施肥方案Table 1 Treats of fertilizer （kg·hm-2）

1.4 測定方法

1.4.1 植株生長指標與營養(yǎng)指標的測定 菜薹生長指標的測定：株高、薹長用卷尺測量，單株質(zhì)量以及主薹質(zhì)量用電子天平測定。

常規(guī)營養(yǎng)指標的測定：維生素C 含量采用2,6-二氯靛酚滴定法測定；還原糖含量采用直接滴定法測定；蛋白質(zhì)含量采用分光光度法測定；粗纖維含量采用纖維測定儀進行；可溶性固體物含量采用折射儀法測定[17]。

1.4.2 土壤化學性質(zhì)的測定 土壤pH采用pH計法測定；有機質(zhì)采用重鉻酸鉀容量法測定；堿解氮含量采用擴散吸收法測定；有效磷含量采用碳酸氫鈉浸提-硫酸鉬銻抗比色法測定；速效鉀含量采用火焰光度計法測定；電導率（electrical conductance，EC）采用電導儀（土水比1∶5）測定[18]。

1.4.3 根際土壤酶活性的測定 采用南京建成生物工程研究所的試劑盒，按照試劑盒的使用方法測定土壤酶活性。采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法測定脲酶活性；采用3，5-二硝基水楊酸比色法測定蔗糖酶活性；采用紫外分光光度法測定過氧化氫酶活性；采用磷酸苯二鈉比色法測定酸性磷酸酶活性[4,19]。

1.4.4 根際土壤微生物數(shù)量的測定 參照《土壤微生物研究原理與方法》[19]，采用稀釋涂布平板計數(shù)法對細菌、真菌和放線菌的數(shù)量進行測定。

1.4.5 土壤微生物多樣性的測定 土壤微生物的多樣性分析委托北京百邁克生物科技有限公司進行，樣品收集后液氮冷凍保存，采用Trizol 法提取樣品DNA，并用Illumina Novaseq 6000 平臺，對細菌的16S 區(qū)進行高通量測序。對測序得到的 Raw reads 通過Trimmomatic v0.33 軟件進行過濾；用cutadapt 1.9.1 軟件識別并去除引物序列，得到Clean reads。每個樣品的Clean Reads 通過Usearch v10 軟件進行拼接并對拼接后數(shù)據(jù)進行長度過濾。使用UCHIME v4.2軟件鑒定并去除嵌合體序列，得到最終有效數(shù)據(jù)?；诳刹僮鞣诸悊卧╫perational taxonomic units, OTUs）和擴增子序列變體（amplicon sequence variants, ASVs）等特征的分析結(jié)果，對樣本進行分類分析，得到相應的豐度分布信息。

中心數(shù)據(jù)顯示，目前中心日間手術(shù)床位28張，單個手術(shù)間單日日間手術(shù)最高可達22臺。目前，全院共開設七大?？?、130多種兒科日間手術(shù)，80余種婦科日間手術(shù)，這些手術(shù)使患者等待時間縮短了50%以上，住院時間由原來2～3天縮短為4～6小時。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)的方差分析和相關(guān)性分析采用 SPSS 22.0 軟件，利用QIIME2 分析微生物樣本的Alpha多樣性。

2 結(jié)果與分析

2.1 有機肥對菜薹植株生長的影響

如表2 所示，施用有機肥后，T1～T4 處理的菜薹單株質(zhì)量分別比CK 顯著增加了36.56%、22.80%、68.01%、93.67% (P＜0.05)。T2、T3、T4 處理的主薹質(zhì)量與CK 相比存在顯著性差異，分別增加了19.28%、69.18%、104.96%(P＜0.05)，以T4處理下菜薹的單株質(zhì)量和主薹質(zhì)量最大。

表2 不同有機肥施用處理下菜薹植株的生長情況Table 2 Growth of Chinese flowering cabbage under different fertilization treatments

2.2 有機肥對菜薹營養(yǎng)品質(zhì)的影響

如表3 所示，與CK 比較，T4 處理增加了菜薹的維生素C、還原糖、蛋白質(zhì)、粗纖維及可溶性固體物含量，分別增加了6.28%、0.84%、12.39%、5.30%、37.38%，除還原糖外其他營養(yǎng)指標均與CK有顯著性差異。

表3 不同有機肥施用處理下菜薹的營養(yǎng)品質(zhì)Table 3 Quality of Chinese flowering cabbage under different fertilization treatments

2.3 有機肥對連作菜薹根際土壤化學性質(zhì)的影響

不同有機肥施用處理下菜薹根際土壤化學性質(zhì)見表4，土壤有機質(zhì)、堿解氮含量和電導率隨著有機肥施用量的增加而增加，其中T4處理下各指標均最高；與CK 相比，T4 處理的有機質(zhì)、堿解氮含量和電導率分別顯著增加59.67%、97.63%和175.76%。有效磷和速效鉀含量隨著有機肥施用量的增加呈現(xiàn)先升后降的趨勢，T1 處理的有效磷和速效鉀含量最高，分別比CK 顯著增加80.98%和8.89%。

表 4 不同有機肥施用處理下土壤的化學性質(zhì)Table 4 Soil chemical properties under different fertilization treatments

2.4 有機肥對連作菜薹根際土壤酶活性的影響

不同有機肥施用處理下菜薹根際土壤酶活性見表5，各施用有機肥處理的脲酶活性均有所降低，酸性磷酸酶和蔗糖酶活性則有所增加，過氧化氫酶變化不大。與CK 相比，T1、T2、T3、T4處理的脲酶活性分別顯著降低17.20%、5.19%、5.34%、8.39%；T2、T3 和T4 處理的酸性磷酸酶活性分別顯著增加32.24%、18.33%和23.10%；T3 與T4 處理的過氧化氫酶活性分別增加5.15%和7.40%，但差異不顯著；土壤蔗糖酶活性隨有機肥施用量的增加呈逐漸上升趨勢，T1、T2、T3、T4 處理的蔗糖酶活性分別顯著增加65.99%、78.48%、91.58%和116.92%。

表 5 不同有機肥施用處理下菜薹根際土壤酶活性Table 5 Soil enzyme activity under different fertilization treatments

2.5 有機肥對連作菜薹根際土壤微生物數(shù)量的影響

2.6 有機肥對連作菜薹根際土壤微生物群落多樣性的影響

2.6.1 有機肥對連作菜薹根際土壤細菌多樣性的影響 為進一步了解微生物有機肥對菜薹根際土壤微生物群落的影響，測定了T4 處理和CK 根際土壤的細菌群落的Alpha 多樣性，結(jié)果如表7 所示，不施用有機肥的CK 與施用有機肥的T4 處理相比，辛普森指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)呈極顯著差異（P＜0.01）。施用有機肥的T4 處理的香農(nóng)指數(shù)大于沒有施用有機肥的CK，說明施用有機肥的土壤細菌的物種種類更多。

表 6 不同有機肥施用處理下菜薹根際土壤微生物的數(shù)量Table 6 Microbial populations in soil under different fertilization treatments

表7 土壤細菌群落Alpha多樣性指數(shù)Table 7 Alpha diversity index of soil bacteria community

2.6.2 有機肥對連作菜薹根際土壤細菌群落物種組成的影響 有機肥處理對細菌群落門水平組成及相對豐度的影響如圖1 所示，變形菌門（Proteobacteria）是最豐富的，而酸桿菌門（Acidobacteria）、綠灣菌門（Chloroflexi）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）依次降低。T4 處理的土壤中優(yōu)勢菌門的相對豐度與CK 存在著顯著性差異。施用有機肥后，酸桿菌門（Acidobacteria）和綠灣菌門（Chloroflexi）的相對豐度增加,而變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）的相對豐度降低。

圖1 土壤細菌門水平組成及相對豐度Fig. 1 Composition and relative abundance of soil bacteria at the Phyla level

2.6.3 有機肥對菜薹連作根際土壤真菌多樣性的影響 由表8 可知，不同有機肥施用處理的土壤真菌群落多樣性不同。不施用有機肥的CK 與施用有機肥的T4 處理相比，Chao1 指數(shù)、ACE 指數(shù)以及辛普森指數(shù)均沒有顯著性差異，而香農(nóng)指數(shù)和覆蓋率的差異顯著（P＜0.05）。施用有機肥的T4 處理的香農(nóng)指數(shù)大于沒有施加有機肥的CK，說明施加有機肥的土壤中物種種類更多。

表8 土壤真菌群落的 Alpha 多樣性指數(shù)Table 8 Alpha diversity index of soil fungal community

2.6.4 有機肥對連作菜薹根際土壤真菌群落物種組成的影響 將所獲的高質(zhì)量序列在97%相似性水平上進行聚類，共得到860個OTUs，代表序列經(jīng)物種注釋后歸屬10個門、25個綱、62個目、124個科、258個屬、311個種。真菌群落門的水平組成及相對豐度如圖2 所示，子囊菌門（Ascomycota）是最豐富的，而壺菌門（Chytridiomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）、霉菌門（Mortierellomycota）、羅茲菌門（Rozellomycota）依次降低。同時可以看到，T4處理的土壤中優(yōu)勢菌門的相對豐度與CK 存在顯著性差異，其中，壺菌門（Chytridiomycota）的相對豐度在施用有機肥后顯著下降，而霉菌門（Mortierellomycota）和擔子菌門（Basidiomycota）的相對豐度在施用有機肥后顯著增加。

圖2 土壤真菌門水平組成及相對豐度Fig. 2 Composition and relative abundance of soil fungi at the Phyla level

3 討論

3.1 微生物有機肥有利于提升連作菜薹的產(chǎn)量和品質(zhì)

菜薹的單株質(zhì)量和主薹質(zhì)量是菜薹植株營養(yǎng)生長的外在表現(xiàn)，也是保證菜薹產(chǎn)量的基礎。本試驗中，施用微生物有機肥后能夠顯著提高連作菜薹單株質(zhì)量及主薹質(zhì)量，可見施用微生物有機肥對植株的生長大有益處，這與童輝等[20]研究生物有機肥促進了菜薹的生長結(jié)果一致。T4 處理可顯著提高菜薹維生素C、蛋白質(zhì)、還原糖、粗纖維和可溶性固形物含量，顯著改善菜薹的營養(yǎng)品質(zhì)，與王冰清等[21]研究化肥減量施用提高了3種蔬菜的可溶性糖、維生素C 和蛋白質(zhì)含量，降低了蔬菜的硝酸鹽含量，從而提高了蔬菜的品質(zhì)的結(jié)果相似。其原因可能是微生物有機肥施入土壤后，其含有的功能菌改善了土壤根際微生物環(huán)境，提高根系活力，進而促進根系對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。

3.2 微生物有機肥有效提升了土壤的肥力和酶活指標

連作容易引起土壤營養(yǎng)失衡[3]。土壤電導率作為土壤理化性質(zhì)中的基礎指標，能夠清楚表明含鹽量的多少。而土壤溶解性有機質(zhì)則是土壤微生物生態(tài)水平的關(guān)鍵指標之一，可表征容易被土壤微生物直接分解利用的土壤有機質(zhì)含量的高低。土壤速效鉀、堿解氮和有效磷都是反映土壤化學肥力水平的關(guān)鍵指標[21]。本研究表明，增施微生物有機肥減量化肥處理總體上能顯著增加菜薹土壤有機質(zhì)、堿解氮含量和電導率,其中T4 處理的有機質(zhì)、堿解氮和電導率都是最高的。可見施用微生物有機肥對提高土壤肥力具有較好的作用，由于有機肥自身含有有機質(zhì)和有益微生物菌，施入土壤后在提高碳源的同時，微生物分解產(chǎn)生的酸類物質(zhì)也可促進土壤中無效態(tài)養(yǎng)分的活化，進而增加土壤中速效養(yǎng)分含量。

土壤酶是一類具有生物催化活性的蛋白質(zhì)，在土壤中非?；钴S，不僅可以分解大分子物質(zhì)，還可以參與腐殖質(zhì)的生成，土壤酶的活性可以直接反映土壤的代謝功能,是土壤健康的重要指標[22-24]。本研究表明，與CK 相比，微生物有機肥處理總體上能顯著提高土壤酸性磷酸酶和蔗糖酶活性，而脲酶活性則明顯下降。磷酸酶能夠活化有機磷，在植物吸收磷元素方面發(fā)揮著重要作用。本試驗結(jié)果與Yang 等[23]研究認為化肥與有機肥配施生物炭后顯著提高了堿性磷酸酶活性的研究結(jié)果類似。本試驗中增施微生物有機肥對脲酶活性產(chǎn)生了抑制作用，這與王一昭等[24]研究生物有機肥能顯著提高小白菜土壤脲酶活性的結(jié)果相反，可能與試驗地立地條件、土壤性狀以及有機肥種類不同有關(guān)。綜合分析，微生物有機肥可提高菜薹連作的根際土壤酶活性，其中以T4處理的效果最佳。

3.3 根際土壤微生物群落多樣性對微生物有機肥的響應機制

土壤微生物群落結(jié)構(gòu)受到農(nóng)田施肥管理措施的影響，不同的施肥措施通過改變土壤 pH，碳、氮和磷等含量直接或間接地影響土壤微生物活性、數(shù)量和結(jié)構(gòu)。土壤微生物作為土壤的重要組成成分，其中細菌數(shù)量較多，放線菌和真菌數(shù)量較少。研究表明，有機肥料的合理施用，可提高土壤細菌數(shù)量、調(diào)整土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，土壤中細菌數(shù)量的增加有利于土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化，能為植物的生長提供良好的環(huán)境，而土壤中放線菌數(shù)量的增加不僅能轉(zhuǎn)化土壤有機質(zhì)，對植物的土傳病原菌也起到一定的拮抗作用，可促進土壤微生物區(qū)系向健康方向發(fā)展[25-28]。Yang 等[23]研究表明，施用加拮抗菌多粘類芽胞桿菌和哈茨木霉菌的腐熟堆肥提高了香蕉根際土壤細菌和放線菌的數(shù)量，并提高了植株的抗病性。Zhou 等[28]研究表明，微生物菌肥接種提高了太白鳳仙根際土壤酶活性和微生物總數(shù)。本研究表明，微生物有機肥處理能增加菜薹根際土壤細菌、放線菌和真菌數(shù)量，T4 處理下各指標都達到最大值，可見，化肥減量配施微生物有機肥對菜薹連作土壤的微生物區(qū)系的調(diào)控作用更為顯著，這可能是因為微生物有機肥為土壤微生物提供了更為豐富的碳源、氮源以及大量有益微生物，創(chuàng)造了一個營養(yǎng)充裕的土壤微生態(tài)環(huán)境，使土壤微生物區(qū)系發(fā)生變化。其中，以T4處理提高細菌和真菌數(shù)量效果最佳，說明大量微生物有機肥的施用提供的養(yǎng)分滿足了土壤微生物代謝活動的需要，同時緩解了土壤不適宜的酸堿度對微生物的影響，此外，有機肥的施用量較高也相應地向土壤中輸入了較多的外源微生物，在一定程度上起到了“接種”的作用。

對CK和T4處理土壤的分析表明，施加微生物有機肥可以顯著增加土壤細菌和真菌物種種類，改變物種豐度。在門分類水平上，各處理土壤真菌的種類遠遠小于細菌。這與安詳瑞等[9]研究顯示施用微生物有機肥能夠同時提高根際土壤細菌和真菌的豐富度及多樣性，而羊糞處理則提高了根際土壤的細菌多樣性和真菌豐富度的研究結(jié)果相似。另外，在門分類水平上，土壤細菌、真菌群落和優(yōu)勢物種的組成基本相同，但是相對豐度存在一定差異，細菌中的優(yōu)勢菌落酸桿菌門（Acidobacteria）和綠灣菌門（Chloroflexi）在施加有機肥后相對豐度增加, 而變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）的相對豐度降低,真菌中的優(yōu)勢菌落壺菌門（Chytridiomycota）在施加有機肥后相對豐度顯著下降，霉菌門（Mortierellomycota）和擔子菌門（Basidiomycota)在施用有機肥后相對豐度顯著增加，但是施加微生物有機肥對于土壤長期的肥效、土壤酶活性、微生物種群數(shù)量、微生物活性以及菜薹生長之間的關(guān)系還有待深入研究，不同種微生物有機肥對菜薹連作生產(chǎn)的影響也有待進一步研究。

本研究結(jié)果表明，施用微生物有機肥可以改進土壤肥力，增加土壤微生物的多樣性并且有助于連作菜薹產(chǎn)量與品質(zhì)的提升，其中以T4處理的效果最好，結(jié)果對于緩解連作菜薹的連作障礙以及科學使用微生物有機肥、減少化肥施用、避免農(nóng)田二次污染提供了理論參考。