小麥葉枯病病原菌的形態(tài)學(xué)與多基因系統(tǒng)學(xué)鑒定

鄭童童， 楊雯迪， 王寧， 馬俊杰， 劉龍， 郭慶元

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆農(nóng)林外來(lái)入侵有害生物監(jiān)測(cè)預(yù)警與綜合防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830052）

小麥（Triticum aestivumL.）是世界三大糧食作物之一[1]。在新疆，小麥栽培面積占糧食作物面積的2/3以上，種植面積達(dá)8.57×104hm2，是新疆最主要的糧食作物[2-3]。2019 年6 月，新疆塔城地區(qū)額敏縣小麥種植區(qū)發(fā)現(xiàn)一種罕見病害，癥狀疑似小麥葉枯病，發(fā)病植株葉片常具有黃色不規(guī)則病斑，病斑周圍有黃色暈圈產(chǎn)生，隨著病情的加重病斑顏色變暗、病斑擴(kuò)大，嚴(yán)重時(shí)植株枯萎。由于國(guó)內(nèi)對(duì)該類病害的研究報(bào)道較少，癥狀上較難準(zhǔn)確診斷，且對(duì)其病原物種類和病害規(guī)律尚未掌握，缺乏有效的防治方法。因此，對(duì)該病害的準(zhǔn)確診斷是進(jìn)一步開展針對(duì)該病防控研究的基礎(chǔ)。

小麥葉枯病最早于1924 年在印度發(fā)現(xiàn)，此后發(fā)展成為南亞最主要的小麥病害[1,4]。我國(guó)最早在20世紀(jì)30年代發(fā)現(xiàn)小麥葉枯病，90年代以來(lái)在全國(guó)發(fā)生逐漸嚴(yán)重[5-9]。王春江等[10]通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察報(bào)道了小麥鏈格孢（Alternaria triticina）是引起小麥葉枯病的致病菌。劉鑫燕等[11]通過(guò)病斑表型和菌落、孢子形態(tài)及真菌ITS1、5.8rDNA 和ITS2區(qū)域序列的進(jìn)化分析鑒定出交鏈鏈格孢（Alternaria alternata）為小麥葉枯病的致病菌。許新江等[12]根據(jù)病原菌形態(tài)學(xué)觀察結(jié)合真菌ITS1 和ITS4 區(qū)域序列的進(jìn)化分析將新疆伊犁地區(qū)小麥葉枯病病原菌鑒定為細(xì)極鏈格孢（Alternaria tenuissima)。

目前，世界上報(bào)道的小麥葉枯病病原菌有20 多種，我國(guó)鑒定出的小麥葉枯病病原菌有10 多種，造成的病害主要有雪腐葉枯病、鏈格孢葉枯病、殼針孢葉枯病、根腐葉枯病等[10,13-16]。新疆小麥生產(chǎn)區(qū)發(fā)生的小麥葉枯病大多為雪腐葉枯病和雪霉葉枯病[17]，而鏈格孢葉枯病報(bào)道較少，且大多由單一病原菌引起。針對(duì)新疆塔城地區(qū)新發(fā)生的疑似小麥葉枯病，本研究擬通過(guò)對(duì)該病的實(shí)地調(diào)查、癥狀對(duì)比、病原分離鑒定及柯赫氏證病試驗(yàn)初步確認(rèn)其病原菌，并利用形態(tài)學(xué)與多基因系統(tǒng)學(xué)鑒定方法準(zhǔn)確鑒定該病病原，準(zhǔn)確診斷病害種類，為該病的進(jìn)一步研究及有效防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病樣采集

在新疆塔城地區(qū)額敏縣小麥生產(chǎn)區(qū)隨機(jī)選取發(fā)病田塊，采集有不規(guī)則斑點(diǎn)及病斑（癥狀上疑似小麥葉枯?。┑闹仓?，帶回實(shí)驗(yàn)室-20 ℃保存。

1.2 病原菌的分離

采用常規(guī)組織分離法對(duì)采集的小麥病葉進(jìn)行病原菌分離。使用滅菌的手術(shù)剪將帶有病斑的葉片從小麥植株上剪下，用無(wú)菌水洗凈；然后使用滅菌濾紙吸干表面水分，在超凈工作臺(tái)中使用1%次氯酸鈉浸泡1 min，75%酒精浸泡30 s，無(wú)菌水沖洗3～5 次；用滅菌濾紙吸干葉片表面水分。在病健交界處切取輕度變色的葉片組織(約3 mm×3 mm)放 于PDA（potato dextrose agar）培養(yǎng)基上25 ℃恒溫培養(yǎng)；待7 d 左右長(zhǎng)出菌落后，用接種針挑取菌落邊緣的菌絲在PDA 上進(jìn)行培養(yǎng)，通過(guò)單孢分離法獲得各分離物的純培養(yǎng)。將純化的所有菌株挑取菌絲和孢子置于35%甘油凍存管，保存于-20 ℃冰箱備用。

1.3 病原菌的致病性測(cè)定

采用離體接種和活體接種2 種方法進(jìn)行致病性測(cè)定。

1.3.1 離體接種 在小麥品種新冬22號(hào)種植17 d后（3～4葉期）采集葉片；然后將其剪成7～8 cm長(zhǎng)，置于事先備好裝有水瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿（直徑90 mm）中。葉片兩端使用一次性無(wú)菌注射器扎5～8 個(gè)孔，用直徑6 mm 菌餅接種于刺傷部位，每菌株3 次重復(fù)，同時(shí)以無(wú)菌水瓊脂餅作為空白對(duì)照。5 d后移去菌餅觀察發(fā)病情況，并比較發(fā)病葉片上的病原菌與原接種菌的培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征是否一致。

1.3.2 活體接種 使用新冬22 號(hào)小麥種子，在10 cm×10 cm 育苗盆中培育17 d 后（3～4 葉期），每盆選擇3 株長(zhǎng)勢(shì)健壯且無(wú)其他病菌感染跡象的小麥苗進(jìn)行針次接種，依然使用一次性無(wú)菌注射器進(jìn)行刺傷，然后接種直徑6 mm 菌餅，保鮮膜纏繞固定，保證菌餅不脫落，同時(shí)起到保濕的作用。5 d后觀察接種情況并記錄。

1.4 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

選取代表性菌株進(jìn)行病原鑒定。將菌株接種于PDA 培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)；第3 天開始觀察并拍照記錄，以后每隔2 d記錄1次，觀察菌株變化，至菌落長(zhǎng)滿全皿2/3 為止。使用打孔器制作菌餅接種于PCA培養(yǎng)基[10]上，于接種菌餅旁45°斜插滅菌的蓋玻片，5 d后取下蓋玻片在電子顯微鏡下觀察分生孢子、厚垣孢子的形態(tài)特征，各測(cè)量50 個(gè)孢子的大小，將菌株的平板生長(zhǎng)狀態(tài)以及分生孢子、厚垣孢子形態(tài)特征與《中國(guó)真菌志》[18]進(jìn)行對(duì)比，初步確定菌株種類。

1.5 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

1.5.1 病原菌DNA提取 根據(jù)病原菌形態(tài)學(xué)鑒定和致病力驗(yàn)證結(jié)果，將分離所得的致病菌接種于在PDA 培養(yǎng)基，25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d 后，用滅菌刀片刮取菌絲置于滅菌的研缽中使用液氮充分研磨，使用新型植物基因組DNA 提取試劑盒（北京天根科技有限公司），參考其操作說(shuō)明提取真菌DNA。

1.5.2 病原菌rDNA-ITS 和EF-1、Alt基因的PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定 對(duì)真菌核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）和EF-1、Alt基因進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增引物如表1 所示，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR 體系均采用25 μL，包括PCRTaqMix 12.5 μL，正、反向引物各1 μL（10 μmol·L-1），模 板DNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL。 PCR 程 序：94 ℃ 4 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。EF-1PCR 程 序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃30 s，72 ℃ 1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。Alt PCR程 序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30s，72 ℃1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%Agarose 進(jìn)行凝膠成像觀察及拍照，選擇條帶清晰的擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生物工程有限公司測(cè)序。

表 1 擴(kuò)增片段及其引物Table 1 Primer sequence for PCR amplification

1.5.3 BLAST 比對(duì)分析 得到菌株序列后在NCBI 上進(jìn)行BLAST 比對(duì)分析，利用MEGA 7.0 軟件進(jìn)行多基因拼接，并以鄰接法（neighbor-joining）聚類分析，構(gòu)建同一個(gè)屬不同種的系統(tǒng)發(fā)育樹，重復(fù)500次。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥葉枯病的田間癥狀

小麥葉枯病于苗期開始出現(xiàn)，抽穗期發(fā)病嚴(yán)重。發(fā)病初期在葉片基部出現(xiàn)淡黃色小斑點(diǎn)；后期擴(kuò)展為橢圓形或梭形，病斑大小不一，病斑中央為黃色或黃褐色，周邊有黃色暈圈（圖1）。

圖1 田間發(fā)病Fig. 1 Field incidence

2.2 致病性測(cè)定

2.2.1 離體接種 從病株上共得到76 個(gè)分離菌株，依次將其編號(hào)為 LK1、LK2 …… LK49、LK50和YC1、YC2 ……YC25 、YC26。對(duì)76個(gè)菌株進(jìn)行離體接種，結(jié)果（圖2）表明，接種3 d 后，接種部位均開始出現(xiàn)明顯的黃化斑點(diǎn)或黃化斑，空白對(duì)照無(wú)變化；接種5 d 出現(xiàn)褐色壞死斑，癥狀與田間癥狀大致相同。由此表明，分離菌株培養(yǎng)后感染植株的病癥和菌落、孢子形態(tài)均與原分離菌株相同，說(shuō)明76個(gè)分離菌株均為致病菌株。

圖2 部分菌株室內(nèi)離體葉接種癥狀Fig. 2 Some strains showed symptoms of inoculation in vitro

2.2.2 活體接種 對(duì)隨機(jī)挑取的15 個(gè)分離菌株（編號(hào)為L(zhǎng)K1、LK3、LK5、LK9、LK10、LK19、LK30、LK37、LK40、LK49、YC3、YC10、YC15、YC19）進(jìn)行活體接種，結(jié)果（圖3）表明，接種3 d 后，接種部位均不同程度出現(xiàn)黃化斑，空白對(duì)照無(wú)變化；5 d 后接種部位出現(xiàn)褐色壞死斑，病斑中央暗褐色邊緣紅褐色，外圍有較大黃色暈圈；將發(fā)病葉片剪下處理后進(jìn)行分離培養(yǎng)后感病癥狀和菌落、孢子形態(tài)均與原分離菌株相同。這進(jìn)一步說(shuō)明了分離菌株均存在致病性。

圖3 部分菌株室內(nèi)活株葉接種癥狀Fig. 3 Some strains showed symptoms of leaf inoculation in room

2.3 培養(yǎng)性狀及形態(tài)學(xué)鑒定

對(duì)所有致病菌株進(jìn)行培養(yǎng)性狀和菌體特征觀察，根據(jù)其顯著不同的組間特征與高度相似的組內(nèi)特征將所有菌株分為3 組：以YC3 菌株為代表的38 個(gè)菌株、以LK19 菌株為代表的20 個(gè)菌株和以LK3菌株為代表的18個(gè)菌株。

2.3.1 YC3等菌株的形態(tài)學(xué)鑒定 以YC3菌株為代表的38 個(gè)菌株最初菌落顏色為淡褐色，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，逐漸變?yōu)榘底睾稚?；菌餅中央顏色較暗，邊緣顏色逐漸變淺、整齊，蛛網(wǎng)狀白色氣生菌絲發(fā)達(dá)，分支較多（圖4A 和B）。YC3 為鏈格孢屬的小孢子種。初生分生孢子梗從培養(yǎng)基或氣生菌絲上產(chǎn)生，直或彎曲，分隔，分生孢子單生或2～7 個(gè)鏈生，孢子鏈有0～4 個(gè)分支；孢子形狀多為倒棍棒型與卵圓形，壁光滑或具細(xì)疣，孢子體黃色或深褐色，2～5 個(gè)橫隔，0～2 個(gè)縱隔，分隔出略益縮；孢子體尺度（15～45） μm×（10～30） μm，初生和次生分生孢子具喙和假喙，（0～15） μm×（2.5～4） μm（圖4C 和D）。根據(jù)病原菌培養(yǎng)性狀及形態(tài)學(xué)特性，將YC3及其具有相同形態(tài)特征的38個(gè)分離菌株鑒定為交鏈鏈格孢（A. alternata），在本次調(diào)查中的分離頻率為50%。

圖4 菌株YC3培養(yǎng)性狀及形態(tài)學(xué)特征Fig. 4 Strain YC3 characters and morphological characteristics

2.3.2 LK19 等菌株的形態(tài)學(xué)鑒定 以LK19 菌株為代表的20個(gè)菌株最初菌落中心正面顏色為淺綠色，表面密絨狀，菌絲為灰白色，邊緣整齊；背面淺綠棕色，具同心輪紋；隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，菌絲逐漸由灰白色生長(zhǎng)為墨綠色，氣生菌絲稀疏（圖5A和B）。LK19 為鏈格孢屬中的小孢子種。分生孢子梗從培養(yǎng)基表面生出或由氣生菌絲生出，分散，直立或膝狀彎曲，分隔明顯，不分支；分生孢子單生或2～6 個(gè)鏈生，孢子鏈有0～5 個(gè)分支；孢子形狀為倒梨型、錐形、卵圓形，壁光滑，孢子體暗褐色，2～5個(gè)橫隔，0～3個(gè)縱隔，分隔出不益縮或略益縮；孢子體尺度（15～40） μm×（10～20） μm；初生和次生分生孢子具錐狀真喙（圖5C和D）。根據(jù)病原菌培養(yǎng)性狀及形態(tài)學(xué)特性，將LK19及其具有相同形態(tài)特征的20個(gè)分離菌株鑒定為玫瑰鏈格孢（A. rose），在本次調(diào)查中的分離頻率為26.3%。

圖5 菌株LK19培養(yǎng)性狀及形態(tài)學(xué)特征Fig. 5 Strain LK19 characters and morphological characteristics

2.3.3 LK3 等菌株的形態(tài)學(xué)鑒定 以LK3菌株為代表的18 個(gè)菌株最初菌落顏色為灰白色，隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，逐漸生長(zhǎng)為灰青綠色，白色邊緣整齊，氣生菌絲較多（圖6A 和B）。LK3 為鏈格孢屬中的小孢子種。分生孢子梗從培養(yǎng)基或氣生菌絲上產(chǎn)生，直或略彎，分隔，分支或不分支；分生孢子單生或2～6個(gè)鏈生，孢子鏈有0～3個(gè)分支；孢子形狀多為倒棍棒型，少數(shù)為卵圓形、長(zhǎng)橢圓形，壁光滑或具微細(xì)疣，孢子體暗黃色，2～4個(gè)橫隔，0～2個(gè)縱隔，分隔出不益縮或略益縮；孢子體尺度（20～50） μm×（5～30） μm；初生和次生分生孢子無(wú)喙（圖6C 和D）。根據(jù)病原菌培養(yǎng)性狀及形態(tài)學(xué)特性，將LK3所代表的18 個(gè)菌株鑒定為侵染鏈格孢（A.infectoria），在本次調(diào)查中的分離頻率為23.7%。

圖6 菌株LK3培養(yǎng)性狀及形態(tài)學(xué)特征Fig. 6 Strain LK3 characters and morphological characteristics

2.4 病原菌的多基因系統(tǒng)學(xué)鑒定

分別對(duì)LK3、LK19、YC3 菌株的ITS 和EF-1、Alt基因片段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增（圖7）和產(chǎn)物序列測(cè)定，測(cè)序后在NCBI 進(jìn)行BLAST 比對(duì)分析，結(jié)果表明，3 個(gè)菌株均屬于Alternaria屬。從GenBank 中選 取A. alternata、A. tenuissima、A. rosae、A.infectoria、A. gaisen對(duì)應(yīng)基因序列采用鄰接法（neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果（圖8）表明，菌株LK3 與侵染鏈格孢（A. infectoria）聚在一個(gè)進(jìn)化分支，同源性為99%；菌株LK19 與玫瑰鏈格孢（A. rosae）聚在一個(gè)進(jìn)化分支，同源性為100%；菌株YC3 與交鏈鏈格孢（A. alternata）聚在一個(gè)進(jìn)化分支，同源性為100%。由此表明，菌株LK3 為侵染鏈格孢（A. infectoria）；菌株LK19 為玫瑰鏈格孢（A. rosae）；菌株YC3 為交鏈鏈格孢（A.alternata）。

圖7 3種引物分別對(duì)3個(gè)菌株特異性擴(kuò)增Fig. 7 Three kinds of primers of three strains specific amplification

圖8 基于EF-1、ITS和Alt基因構(gòu)建的多基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 8 Polygenic system development tree based on the EF-1， ITS and Alt genes

3 討論

在小麥葉枯病的發(fā)生初期，多以形態(tài)學(xué)觀察來(lái)完成病原菌的鑒定。隨著小麥葉枯病在國(guó)內(nèi)發(fā)生逐漸加重，鏈格孢屬中多種種間分生孢子形態(tài)差異較小，利用形態(tài)學(xué)精確鑒定區(qū)分鏈格孢屬不同種級(jí)存在一定困難。為了提高病原菌鑒定的準(zhǔn)確性，目前，在植物病原真菌的鑒定中PCR 技術(shù)的應(yīng)用越來(lái)越廣泛[22-23]，其中應(yīng)用最為廣泛的是ITS 片段的序列分析。真菌ITS 序列介于5.8S rDNA、18S rDNA 及28S rDNA 之間，在間隔區(qū)上差異性較小，因此，在種間鑒定中ITS 的區(qū)分度不是很理想[24-25]。Vu 等[26]在河南省黑胚小麥種子上分離到7 種鏈格孢菌株的ITS 區(qū)序列，與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果顯示，鏈格孢屬在ITS 區(qū)高度保守；A. alternata、A. tenissima、A. tenuis的ITS區(qū)序列相同（100%）。為此，本研究采用了多基因片段鑒定法，以求得到更準(zhǔn)確的種級(jí)鑒定。

王春江等[10]分別在小麥病株和小麥種子中鑒定出小麥鏈格孢葉枯?。ㄓ址Q小麥葉疫病，病原：Alternaria triticinaPrasada and Prabhu）。由小麥鏈格孢（A. triticina）引起的小麥葉疫病是小麥葉枯類病害中潛在威脅性最大的一種檢疫性病害[10]。本研究初期曾以小麥葉疫病為假想目標(biāo)，但始終未鑒定出小麥葉疫病的病原菌小麥鏈格孢（A.triticina），經(jīng)一系列的鑒定與驗(yàn)證明確了新疆塔城地區(qū)導(dǎo)致小麥葉枯現(xiàn)象的主要致病菌為交鏈鏈格孢（A. alternata）、侵染鏈格孢（A. infectoria）和玫瑰鏈格孢（A. rosae）；其中交鏈鏈格孢的分離頻率最高，是最主要的致病菌。

劉鑫燕等[11]鑒定出小麥交鏈鏈格孢（A.alternata）為小麥葉枯病的致病菌，在研究中交鏈鏈格孢也是主要致病菌。由此表明，交鏈鏈格孢是小麥葉枯病較為常見的病原菌種。葉娜[1]認(rèn)為小麥葉枯病癥狀類型主要有2種，分別由鏈格孢葉枯菌和根腐離蠕孢葉枯菌侵染所致，2種病原菌常相互混合發(fā)生侵染。本研究也表明小麥葉枯病癥狀存在Alternata屬內(nèi)致病種混合侵染的情況。

到目前為止，在國(guó)內(nèi)尚未見到玫瑰鏈格孢（A. rosae）造成小麥葉枯病的報(bào)道。本研究首次鑒定出玫瑰鏈格孢可侵染小麥導(dǎo)致葉枯病癥。這說(shuō)明玫瑰鏈格孢對(duì)小麥生產(chǎn)存在危害，今后應(yīng)針對(duì)該菌種對(duì)小麥的危害情況及其對(duì)其他作物的潛在風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估，并對(duì)小麥葉枯病害的控制方法開展進(jìn)一步研究。