蘇氨酸醛縮酶的結(jié)構(gòu)與功能及其在藥物合成中的應(yīng)用*

何遠(yuǎn)志 馮 雁

（上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，微生物代謝國家重點實驗室，上海 200240）

β-羥基-α-氨基酸（β-hydroxy-α-amnio acids，HAAs）是構(gòu)筑多種高活性天然產(chǎn)物和藥物分子的重要手性砌塊，在抗菌、抗腫瘤和免疫抑制等方面具有廣泛應(yīng)用［1-3］（圖1）。例如：L-蘇式-4-甲砜基苯絲氨酸（L-threo-4-methylsulfonylphenylserine，L-threo-4-MTPS）是合成抗感染藥物甲砜霉素和氟苯尼考的重要手性前體［4-5］；屈西多巴（L-threo-3,4-dihydroxyphenylserine，L-threo-3,4-DOPS）是臨床治療帕金森病的藥物［6-7］；L-蘇式-4-硝基苯絲氨酸（L-threo-4-nitrophenylserine， L-threo-4-NOPS）可作為中間體合成氯霉素［8］；L-蘇式-4-硝基苯乙基絲氨酸（L-threo-4-phenylethylserine）是新型抗生素obafluorin 合成的重要中間體［9］。由于絕大部分的HAAs藥物分子及其前體具有雙手性中心，在藥物合成工業(yè)中如何精準(zhǔn)控制雙手性中心的立體選擇性是目前研究的重點和難點。

目前合成HAAs主要有化學(xué)法和生物法。手性拆分和不對稱有機合成是目前合成HAAs主要的化學(xué)方法，但都存在立體選擇性控制困難和官能團(tuán)的相容性較差等問題［10-12］。相對于化學(xué)法，生物法具有反應(yīng)條件溫和、綠色高效和專一性強等特點，在HAAs合成中具有很大的優(yōu)勢［13-15］。酶分子作為一種高效的生物催化劑，擁有不同于一般催化劑的顯著特點：酶對底物具有高度特異性、高催化效率和高度可調(diào)節(jié)性［16-19］。隨著酶分子的挖掘和蛋白質(zhì)工程的發(fā)展，多種酶分子已經(jīng)成為合成HAAs等非天然氨基酸的生物催化劑［3，20-24］。蘇氨酸醛縮酶（threonine aldolase，TA）是一類磷酸吡哆醛（pyridoxal 5'-phosphate，PLP）依賴的折疊酶，能一步可逆催化α-氨基酸和醛縮合形成C—C鍵并產(chǎn)生具有兩個相鄰手性中心的HAAs化合物，同時其底物譜寬泛，可催化不同類型的醛和氨基酸縮合構(gòu)筑HAAs產(chǎn)物庫，在手性氨基酸藥物合成工業(yè)中具有很大的潛力［25-29］。TA 還可偶聯(lián)其他酶建立多酶體系用于藥物分子的合成，例如TA 偶聯(lián)脫水酶進(jìn)一步可將HAAs 轉(zhuǎn)化為芳香乙醇胺等高活性化合物［30］。

目前報道的絕大多數(shù)野生型TA 普遍存在活性較低、立體選擇性不嚴(yán)格以及熱穩(wěn)定性較差等問題，這些因素限制了其在HAAs 合成中的應(yīng)用［31-34］。近年來，通過新酶挖掘、晶體結(jié)構(gòu)解析以及酶分子改造策略獲得了一系列催化性能改善的TA，這些酶分子在高效合成HAAs 及其藥物分子前體中也表現(xiàn)出了更好的催化性能和潛在的工業(yè)應(yīng)用價值［4，20，35-38］。但由于缺乏非天然底物和產(chǎn)物與酶分子的共晶結(jié)構(gòu)，調(diào)控其立體選擇性的關(guān)鍵位點和機制還尚未清楚；同時提升其多種催化性能也是目前研究所面臨的挑戰(zhàn)。本文綜述了目前TA 在新酶挖掘、結(jié)構(gòu)解析、催化機制、高通量篩選方法、分子改造以及合成應(yīng)用等方面的最新研究進(jìn)展，也對TA 工業(yè)應(yīng)用所面臨的問題和未來的研究思路進(jìn)行了討論和分析，為更多的TA 的分子改造和工業(yè)合成應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)和新的視角。

Fig. 1 The application of threonine aldolase for synthesis of β-hydroxy-α-amino acid and its derivatives圖1 蘇氨酸醛縮酶在β-羥基-α-氨基酸及其衍生物合成中的應(yīng)用

1 蘇氨酸醛縮酶的分類與來源

TA 分布廣泛并在進(jìn)化過程中形成了不同的類型［25］（圖2a）。根據(jù)對天然底物的特異性，TA 可以分為L-TA（L-threonine aldolase，L-TA）和D-TA（D-threonine aldolase，D-TA），它們分別可逆催化L-蘇氨酸和D-蘇氨酸生成甘氨酸和乙醛［27，30，39-40］（圖2b）。L-TA 屬于天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶超家族，為PLP依賴的I型折疊酶；D-TA屬于丙氨酸消旋酶超家族，為PLP依賴的II型折疊酶［41-42］。根據(jù)對天然底物立體化學(xué)偏好性可進(jìn)一步將TA 分為L-TA （EC 4.1.2.5）、 L-allo-TA （EC 4.1.2.49）、low-specificity L-TA （EC 4.1.2.48） 和 D-TA（EC 4.1.2.42）［31，41，43-45］，其中L-TA 偏好L-蘇氨酸底物， L-allo-TA 偏好L-allo- 蘇氨酸底物，low-specificity L-TA無明顯的底物偏好性［46］（圖2a）。值得注意的是，雖然low-specificity L-TA被認(rèn)為是“低特異性”酶，實際上它們在羥醛縮合反應(yīng)中對Cα也同樣具有嚴(yán)格的立體選擇性。進(jìn)一步通過序列相似性網(wǎng)絡(luò)和系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn)，L-TA和D-TA屬于同簇上的不同進(jìn)化分支［47］。有趣的是，L-TA 可細(xì)分為兩個不同進(jìn)化分支上的亞家族，cluster A 和cluster B，其中cluster A 包括原核和真核來源的L-TA，而cluster B 僅包含原核來源的L-TA［46-47］。雖然兩個不同簇的L-TA 在進(jìn)化分支上存在不同，但它們均具有相同的保守氨基酸功能位點，并具有相似的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，這也進(jìn)一步證明了它們是從同一個家族趨同進(jìn)化而來［47］。在催化機制方面，L-TA 和D-TA 均以保守的賴氨酸殘基，通過席夫堿交換機制進(jìn)行催化；活性中心的多種相互作用（氫鍵、鹽橋和共軛等）共同穩(wěn)定輔因子PLP 的空間構(gòu)象。其中D-TA 催化過程需要二價金屬離子（如Mn2+、Co2+、Ni2+和Mg2+等）參與，而L-TA不需要金屬離子參與反應(yīng)［48-49］。

TA廣泛存在于各種生物體中，在動物、植物、細(xì)菌以及真菌均有報道［20，25-26，50］。目前，已表征的L-TA 來源于小鼠肝臟、大腸桿菌［51］、利什曼蟲［52］、假 單 胞 菌［53］、海 棲 熱 袍菌［54］、釀酒 酵母［55］、天藍(lán)色鏈霉菌［7］和簡氏氣單胞菌［43］等。D-TA的報道相對較少，已鑒定的D-TA來源于絲狀微菌屬［39］、木糖氧化無色桿菌［45］、綠藻［56-57］、木糖氧化產(chǎn)堿菌［49］和節(jié)桿菌屬［58］等。

Fig. 2 Classification and natural reactions of threonine aldolases圖2 蘇氨酸醛縮酶的分類與天然反應(yīng)

2 蘇氨酸醛縮酶的結(jié)構(gòu)及催化機理

L-TA 和D-TA 屬于不同酶家族，它們在結(jié)構(gòu)和催化機理上也存在明顯不同。目前已解析了多種來源TA 的晶體結(jié)構(gòu)（表1），比如大腸桿菌［48，59］、假單胞菌［60］、海棲熱袍菌［61］、簡氏氣單胞菌［43］和利士曼原蟲［35］等。除了apo 形式以外，也報道了多個氨基酸與蛋白質(zhì)的共晶結(jié)構(gòu)，例如甘氨酸、蘇氨酸和絲氨酸等。通過對它們的結(jié)構(gòu)特征、輔因子和底物結(jié)合位點進(jìn)行分析，確定了蛋白質(zhì)與輔因子PLP結(jié)合以及底物識別的關(guān)鍵位點。同時基于計算機輔助工具等技術(shù)手段對它們的催化過程進(jìn)行了研究并提出了催化機理［36，39，62］。

Table 1 Crystal structure of resolved threonine aldolases表1 已解析的蘇氨酸醛縮酶的晶體結(jié)構(gòu)

續(xù)表1

2.1 L-TA的結(jié)構(gòu)與催化機理

2001年，Kielkopf等［65］解析了第一個TA的晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID：1JG8），該酶是來源于海棲熱袍菌（Thermatoga maritima）的低特異性的L-TA。隨后，Kielkopf 等［65］也解析了該菌種來源的L-TA（PDB ID：1M6S）以及與L-allo-蘇氨酸（PDB ID：1LW4）和甘氨酸（PDB ID：1LW5）的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)。此外，Di Salvo 等［48］也陸續(xù)報道了來源于大腸桿菌的低特異性L-TA 的晶體結(jié)構(gòu)，包括與甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的共晶結(jié)構(gòu)（PDB ID：4LMJ、4LMN 和4LNL）。對來源于大腸桿菌的L-TA 結(jié)構(gòu)分析表明，其整體結(jié)構(gòu)呈同源四聚體，每條單鏈由一個大結(jié)構(gòu)域和小結(jié)構(gòu)域組成，每3個單體形成1 個活性中心，輔因子PLP 結(jié)合在3 個單體形成的界面上，并與B 鏈上的Lys197 形成內(nèi)席夫堿形式（內(nèi)部醛亞胺），此時處于非催化狀態(tài)（圖3a，b）。輔因子PLP 與蛋白質(zhì)相互作用分析表明：A 鏈上的His83 的咪唑基平行于PLP 的吡啶環(huán)的re面并形成π-π共軛相互作用穩(wěn)定著PLP的空間構(gòu)象；位于B鏈上的Ala168與PLP在si面產(chǎn)生疏水相互作用；同時Asp166的羧基和Asp169的胍基分別與PLP 吡啶環(huán)上亞胺基和羥基形成氫鍵相互作用［48］；為了穩(wěn)定PLP的磷酸基團(tuán)，B鏈上的Gly58和Thr59氨基酸側(cè)鏈與磷酸基團(tuán)分別形成氫鍵相互作用；同時B 鏈上的Ser196 和Gly204 以及C 鏈上的Lys222 通過水分子介導(dǎo)的氫鍵相互作用共同穩(wěn)定著PLP磷酸基團(tuán)［48］（圖3c）。該酶與甘氨酸的共晶結(jié)構(gòu)表明，當(dāng)甘氨酸進(jìn)入活性中后，通過置換活性中心的賴氨酸Lys197 形成醌類中間體（外部醛亞胺）［48］，其中B 鏈上帶正電的氨基酸Arg169/Ar308和電中性Ser6分別與甘氨酸的羧基形成鹽橋和氫鍵相互作用保持構(gòu)象的穩(wěn)定。該酶與蘇氨酸的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)中，活性中心的兩個水分子結(jié)合在底物羧基和PLP磷酸基團(tuán)之間，它們形成氫鍵網(wǎng)絡(luò)共同穩(wěn)定底物和輔因子PLP的空間構(gòu)象［65］。此外，在底物識別和立體特異性方面，氨基酸His83 和His126通過與活性中心水分子產(chǎn)生相互作用并靠近L-allo-蘇氨酸，表明它們可能在底物識別方面具有重要的作用，同時氨基酸Tyr87的側(cè)鏈大小可能影響酶分子的底物立體特異性識別［65］。

進(jìn)一步的，在L-TA 與PLP-Gly 復(fù)合物結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，當(dāng)醛底物進(jìn)入活性中心后，中間體PLPGly上的Cα質(zhì)子轉(zhuǎn)移至酶活性中心的廣義堿并產(chǎn)生共振陰離子，Cα通過親核進(jìn)攻醛基生成C—C 鍵，產(chǎn)物通過席夫堿交換機制被釋放出酶活性中心，PLP則從產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到活性中心保守的賴氨酸并重新形成內(nèi)部醛亞胺，完成了羥醛縮合反應(yīng)的完整循環(huán)［2，20，51］（圖4a）。此外，Rocha等［2］通過過渡態(tài)能量計算表明，醛底物質(zhì)子化可能是通過水分子介導(dǎo)的堿性基團(tuán)完成的，活性中心的多個水分子在底物構(gòu)象穩(wěn)定和催化中也有著重要的作用。由于L-TA 活性中心口袋較大，小分子醛底物在活性口袋存在多種構(gòu)象，導(dǎo)致產(chǎn)物立體選擇性較差，這也為分子改造提升L-TA立體選擇性帶來了挑戰(zhàn)。

Fig. 3 The crystal structure of threonine aldolases圖3 TA的晶體結(jié)構(gòu)

Fig. 4 The proposed catalytic mechanism of threonine aldolase圖4 蘇氨酸醛縮酶的催化機制

L-TA 對Cα具有嚴(yán)格的立體選擇性，但對Cβ的立體選擇性則不嚴(yán)格。探究調(diào)控Cβ立體選擇性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基序和調(diào)控機制將為其分子改造提升立體選擇性提供理論基礎(chǔ)和指導(dǎo)。Zheng 等［35-36，38，62］提出了“雙通道路徑假說”，醛底物分別從兩個不同的路徑（順式通道和反式通道）進(jìn)入活性中心，Cα從si和re面進(jìn)攻醛基，從而產(chǎn)生對應(yīng)的立體構(gòu)型產(chǎn)物（圖5）?；诖思僬f，通過“增強和減弱”不同通道的醛底物結(jié)合來調(diào)控L-TA 對Cβ的立體選擇性。此外，有研究表明在丙酮酸依賴的醛縮酶和磷酸果糖醛縮酶中，由于底物受到活性中心微環(huán)境和相互作用力的影響，可以反轉(zhuǎn)形成不同的構(gòu)象進(jìn)而產(chǎn)生不同構(gòu)型產(chǎn)物［68-69］。因此對于L-TA，當(dāng)?shù)孜飶耐煌ǖ肋M(jìn)入活性中心時，底物在活性口袋中可能會翻轉(zhuǎn)形成不同的構(gòu)象進(jìn)而表現(xiàn)出對Cβ不同的立體選擇性。為了進(jìn)一步探究L-TA 對Cβ的立體選擇性調(diào)控機制，未來還需要結(jié)合L-TA 與非天然底物或產(chǎn)物的復(fù)合物共晶結(jié)構(gòu)以及借助計算機輔助工具繼續(xù)探究其催化奧秘。

Fig. 5 Schematics of path hypothesis for diastereoselectivity control in L-threonine aldolase［36，62］圖5 L-蘇氨酸醛縮酶非對映立體選擇性調(diào)控的路徑假說［36，62］

2.2 D-TA的結(jié)構(gòu)與催化機理

D-TA晶體結(jié)構(gòu)的報道較少。目前僅解析了3個不同來源的D-TA的晶體結(jié)構(gòu)（表1），它們分別來源于木糖氧化無色桿菌 （Achromobacter xylosoxidans）（PDB ID：4V15）［49］、海洋線狀球菌屬（Filomicrobium marinum）（PDB ID：7DIB）［39］和萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）（PDB ID：7YQA）［57，70］。2015 年，Uhl 等［49］報道了第一個D-TA 的晶體結(jié)構(gòu)，該酶來源于木糖氧化無色桿菌（PDB ID：4V15），并對其催化機制進(jìn)行研究。該酶整體呈同源二聚體結(jié)構(gòu)，每個單體由8 個α/β 折疊形成的丙氨酸消旋酶結(jié)構(gòu)域、1個N端和C端殘基組成的β 結(jié)構(gòu)域組成（圖3d）。輔因子PLP 結(jié)合在兩個單體之間并與Lys59 形成內(nèi)部醛亞胺。其中，二價金屬離子Mn2+結(jié)合在PLP 附近并與活性中心的水分子、3 個天冬氨酸（Asp59、Asp321、Asp349）和His347 形成氫鍵相互作用網(wǎng)絡(luò)［49］（圖3e）。在催化機制方面，D-TA 依賴二價金屬離子Mn2+，通過Lewis酸形式與供體底物配位，并通過水分子介導(dǎo)的堿性殘基對底物質(zhì)子化而獲得烯醇化的烯二醇親核體，進(jìn)而催化形成C—C鍵［39，71］（圖4b）。由于目前尚未獲得D-TA與底物的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)，因此對其催化機理和選擇性機理還需進(jìn)一步研究。

3 蘇氨酸醛縮酶分子改造和在β-羥基-α-氨基酸合成中的應(yīng)用

HAAs是一類重要的非天然氨基酸，它具有相鄰的兩個手性中心，是一系列天然產(chǎn)物和活性分子的重要中間體。通過對R基團(tuán)、氨基、羧基以及羥基進(jìn)一步修飾能合成多種手性藥物，比如氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和屈西多巴等。TA 可在溫和的條件下一步催化醛和氨基酸縮合合成HAAs；同時該酶具有廣泛的醛底物譜，能催化多種類型的醛分子（如芳香醛、雜環(huán)醛和脂肪醛等）和氨基酸發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)物豐富多樣，展現(xiàn)了潛在的工業(yè)應(yīng)用價值（圖6）。由于天然的TA存在對非天然底物的活性較低、立體選擇性不嚴(yán)格以及熱穩(wěn)定性差等問題，限制了其在非天然氨基酸藥物中的應(yīng)用。近年來，隨著蛋白質(zhì)工程、高通量篩選方法以及結(jié)構(gòu)生物學(xué)的發(fā)展，為TA 的分子改造提升其催化性能奠定了一定的基礎(chǔ)。鑒于芳香基團(tuán)在藥物分子中的普遍存在以及TA 對芳香醛底物的良好兼容性，絕大部分分子改造工作都圍繞非天然芳香醛底物和氨基酸縮合反應(yīng)（表2）。

3.1 高通量篩選方法

Fig. 6 A part of substrate scope of characterized threonine aldolases圖6 已報道蘇氨酸醛縮酶的部分醛底物譜

針對TA 的定向進(jìn)化，目前已建立了多種針對活性和立體選擇性改造的高通量篩選方法，包括醛底物顯色法、菌體生長偶聯(lián)和多酶偶聯(lián)法等。醛分子在室溫下能與多種試劑發(fā)生反應(yīng)并在特定的波長下具有最大吸收值，比如3-甲基-2-苯并噻唑烷（MBTH）、2,4-二硝基苯肼（DNPH）、4-氨基-5-肼基-1,2,4-三 唑-3-硫醇（Purpald） 和乙 酰丙 酮（Nash）等，可通過顯色法檢測醛底物的消耗速率來快速篩選突變體［72-76］。同時，研究人員還設(shè)計了基于多酶偶聯(lián)對TA 突變體進(jìn)行篩選。TA 催化HAAs發(fā)生羥醛裂解反應(yīng)生產(chǎn)甘氨酸和醛，醇脫氫酶（ADH）可將醛分子轉(zhuǎn)化為醇，此過程消耗還原型輔酶I NADH （nicotinamide adenine dinucleotide）產(chǎn)生煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+，同時NADH 在340 nm 下具有最大吸光度值，可通過測定340 nm下吸光度值變化來篩選TA突變體的活性［26，77-78］（圖7a）。此外，還建立了基于宿主菌生長偶聯(lián)的高通量篩選方法。通過失活或敲除宿主大腸桿菌體內(nèi)甘氨酸合成途徑上的蘇氨酸醛縮酶（TA）、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶（GLYA）、蘇氨酸脫氫酶（TDH）和2-氨基-3-丁酮酸裂解酶（KBL）基因構(gòu)建營養(yǎng)缺陷型宿主菌，使該缺陷型大腸桿菌在沒有外源添加甘氨酸的情況下，不能在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上生長［79］，通過營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基來測試異源TA 降解HAAs 合成甘氨酸的活力來對突變體進(jìn)行篩選（圖7b）。

雖然這些方法可用于TA 突變體的活性篩選，但它們無法對突變體立體選擇性進(jìn)行分析。針對這個缺陷，Chen等［46，80］通過巧妙的設(shè)計，將來源于伯克霍爾德菌（Paraburkholderia xenovorans）的苯絲氨酸脫水酶（Phenylserine dehydratase，PSDH）與TA 進(jìn)行偶聯(lián)，建立了基于TA 活性和立體選擇性高通量篩選方法（圖7c）。其中，L-PSDH能特異性地降解L-蘇式-苯絲氨酸合成苯基酮酸，而對L-赤式-苯絲氨酸無活性；同理，D-PSDH能特異性地降解D-蘇式-苯絲氨酸合成苯基酮酸，而對D-赤式-苯絲氨酸無活性，生成的苯基酮酸可與Fe3+在酸性條件下形成穩(wěn)定的螯合物，并在640 nm 的波長下具有最大吸收值?；赥A 的催化特性，它們的產(chǎn)物僅為一對非對映體，通過兩步催化即可對反應(yīng)中醛底物和酮酸進(jìn)行定量，進(jìn)而計算突變體的活性和立體選擇性，這為高通量篩選TA 突變體提供了一種新的普適性方法［80］。

Fig. 7 Screening methods for directed evolution of threonine aldolases圖 7 蘇氨酸醛縮酶定向進(jìn)化的篩選方法

3.2 L-TA的分子改造與合成應(yīng)用

野生型L-TA 往往存在活性低、立體選擇性差等問題，限制了其在HAAs合成中的應(yīng)用。為了改善L-TA 的催化性能，目前也開發(fā)了一系列突變策略對L-TA進(jìn)行定向進(jìn)化以提升其催化性能。

在活性改造方面，Lee 等［34］根據(jù)乙醛等醛分子對大腸桿菌的抑制作用，設(shè)計了基于大腸桿菌生長的L-TA 篩選體系，獲得了更高催化活性的突變體。在合成反應(yīng)方向，L-TA 通過消耗醛底物，促進(jìn)了大腸桿菌的生長，從而篩選到具有高活性的突變體。作者選擇來自于銅綠假單細(xì)胞（P. aeruginosa）的L-TA，通過易錯PCR 策略獲得了約20 000 個突變體庫，在含有20 mmol/L的乙醛下進(jìn)行篩選，獲得了對乙醛耐受性提升的突變體。與野生型相比，最佳突變體LTA-S2的活性提升了2.1倍。

在熱穩(wěn)定性改造方面，Baik 等［7］以來源于天藍(lán)色鏈霉菌（Streptomyces coelicolor）A3 的L-TA為研究對象，為了提升該酶的熱穩(wěn)定性，他們采用了易錯PCR 策略構(gòu)建了含有大約15 000 個突變體的文庫，在65℃下處理這些突變體并測定其裂解L-蘇氨酸合成乙醛和甘氨酸的活力。通過篩選，他們獲得了8個相比野生型具有更好熱穩(wěn)定性的單點突變體。其中最佳突變體H177Y 在60℃下加熱20 min后仍保持了初始活性的86%，而在相同條件下，野生型僅保留了11%的殘留活性。更重要的是，在提升熱穩(wěn)定性的同時，蛋白質(zhì)的活性并沒有受到影響。作者采用全細(xì)胞催化策略，使用最佳突變體H177Y在水相中進(jìn)行了20個連續(xù)循環(huán)的反應(yīng)，成功合成了4 g/L屈西多巴。

為了改善L-TA 對Cβ的立體選擇性，研究人員通過蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、計算機模擬以及定點突變等技術(shù)手段對其進(jìn)行設(shè)計，以提升其在HAAs合成中的立體選擇性［35-36，62，81］。酶的活性口袋對于酶分子的催化性能有著重要的影響?；诖耍琇in團(tuán)隊［4］對來源于草張狀珊瑚狀放線菌Actinocorallia herbida的L-TA 的活性口袋進(jìn)行改造，來提升其對重要手性藥物中間體L-蘇式-4-MTPS 合成的立體選擇性，成功將該酶的de值（diasteromeric excess，非對映體過量百分率）從58%提升至81%［5］。在此基礎(chǔ)上，該團(tuán)隊通過分子動力學(xué)模擬和結(jié)合自由能計算等手段對獲得的突變體進(jìn)行理性設(shè)計，進(jìn)一步將該酶的de值提升至93.7%（表2）。Zheng 等［36，62］基于“雙底物通道假設(shè)理論”并結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)對不同來源的L-TA 進(jìn)行半理性設(shè)計，以催化4-甲砜基苯甲醛和甘氨酸縮合合成重要藥物前體L-蘇式-4-MTPS為模式反應(yīng)，成功獲得了多個突變體實現(xiàn)了該化合物的嚴(yán)格立體選擇性合成（de>99%）。

L-蘇式-4-NOPS 是合成抗生素氯霉素的重要前體化合物，Cai 等［8］通過計算機輔助的定向進(jìn)化，對來源于惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）的L-TA進(jìn)行分子改造，大幅度提升了L-蘇式-4-NOPS合成的立體選擇性，其中最佳突變體的de值從32%提升至85%（表2）。屈西多巴是2014 年FDA批準(zhǔn)的一種治療帕金森病的強效藥物［6-7］。然而，含有富電子鄰苯二酚基團(tuán)的底物3,4-二羥基苯甲醛在羥醛縮合反應(yīng)中不活躍，導(dǎo)致L-TA 在催化中的活性和對Cβ非對映選擇性較差，酶促合成收率低。Zhao等［63］從黑熊的腸道微生物菌群中克隆了一種新型L-TA（命名為Sz-1-2），并對該酶Arg318 位點進(jìn)行定點飽和突變，其中最佳突變體R318L 催化合成L-蘇式-3,4-DOPS 的de值達(dá)到了84.9%，與野生型相比顯著提升。此外，Zha 等［82］通過氨基酸虛擬突變發(fā)現(xiàn)了L-TA 中的調(diào)控催化性能的關(guān)鍵位點His128，通過飽和突變獲得了一個對屈西多巴合成具有良好非對映體立體選擇性的突變體H128N，其de值達(dá)92.9%。隨后作者以該突變體的全細(xì)胞為生物催化劑，在1 h內(nèi)合成了1.6 g/L的產(chǎn)物，其de值達(dá)到了95.4%，是目前報道合成該化合立體選擇性最好的L-TA。作者隨后通過計算機模擬表明，增加His128 位點殘基的體積對氫供體的活化是不利的，適當(dāng)增加氫受體可以增強底物結(jié)合，從而提高轉(zhuǎn)化率［82］（表2）。

雖然目前在L-TA 立體選擇性改造方面取得了一定的進(jìn)展，但絕大部分突變體在提升立體選擇性的同時，活性都出現(xiàn)了較大程度的下降，同時提升活性和立體選擇性仍是目前所面臨的挑戰(zhàn)。因此，挖掘更高活性的天然L-TA 和開發(fā)更高效的突變策略是解決這些缺陷的重要手段。筆者基于進(jìn)化關(guān)系分析和微生物生長特性分析，成功挖掘到了一個來源于海洋嗜油微生物海神單胞菌（Neptunomonas marina）的新型L-TA，它在催化合成重要藥物分子前體L-蘇式-4-MTPS 中同時表現(xiàn)出良好的活性（64.8 U/mg） 和非對映體立體選擇性（89.5%de）［83］。進(jìn)一步通過晶體學(xué)和計算機模擬等研究，精確定位了該酶負(fù)責(zé)調(diào)控立體選擇性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基序，建立了以結(jié)構(gòu)指導(dǎo)的底物構(gòu)象調(diào)控適配新策略，同時結(jié)合氨基酸定點飽和突變和迭代組合突變技術(shù)，成功獲得了對L-蘇式-4-MTPS合成活性和非對映體立體選擇性雙提升的三點突變體N18S/Q39R/Y319L，其de>99%，催化活性達(dá)到95.7 U/mg，是目前報道催化合成L-蘇式-4-MTPS 活性最高的L-TA。該突變體在克級別制備L-蘇式-4-MTPS反應(yīng)中的時空產(chǎn)率高達(dá)216 g?L-1?d-1，表明了其作為生物催化劑在合成HAAs 具有重要的工業(yè)應(yīng)用潛力。同時，筆者基于結(jié)構(gòu)分析、定點突變以及計算機模擬等研究，發(fā)現(xiàn)了該酶的“雙構(gòu)象”非對映體立體選擇性調(diào)控機制，并錨定了調(diào)控該酶立體選擇性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基序，這為更多L-TA 改造提供了理論指導(dǎo)，也為加快L-TA 在生物技術(shù)等工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)［83］。

3.3 D-TA的分子改造與合成應(yīng)用

D-TA 催化醛和氨基酸合成的產(chǎn)物為D-蘇式和D-赤式構(gòu)型［84］。針對D-TA的分子改造和應(yīng)用，目前也開展了一系列的研究。與L-TA相比，D-TA在HAAs合成中對Cβ?lián)碛懈訃?yán)格的立體選擇性，這是因為D-TA 在熱力學(xué)和動力學(xué)控制中達(dá)到平衡的時間較長導(dǎo)致。因此，可通過調(diào)節(jié)反應(yīng)條件（溫度、酶量和有機溶劑等）來降低產(chǎn)物的合成速率，從而獲得更好的立體選擇性［46］。基于此，Chen等［85］以來源于戴爾福特菌RIT313 （Delftiasp.RIT313）的D-TA 為研究對象，通過調(diào)控反應(yīng)溫度、有機溶劑、酶量和反應(yīng)時間使該酶催化處于動力學(xué)控制下，成功實現(xiàn)了D-蘇式-2-氟苯絲氨酸和D-蘇式-2-硝基苯絲氨酸的高活性和立體選擇性合成，其轉(zhuǎn)化率和de值均大于90%。此外，作者以該酶全細(xì)胞為催化劑，在手性拆分D/L-蘇式-苯絲氨酸和D/L-蘇式-4-MTPS中也表現(xiàn)出了嚴(yán)格立體選擇性（e.e.>99%）［85］。Park 等［39］挖掘到了一個來源于海洋線狀微球菌（Filomicrobium marinum）的在合成D-蘇氨酸中具有高活性和高立體選擇性的D-TA。作者解析了該酶的晶體結(jié)構(gòu)并對其催化機理進(jìn)行了全面的分析。作者利用以結(jié)構(gòu)和機制為指導(dǎo)的蛋白質(zhì)工程對該酶進(jìn)行理性設(shè)計，成功獲得了對D-蘇氨酸嚴(yán)格立體選擇性的突變體G179A/S312A，其de值高達(dá)99.5%，同時該突變體對非天然底物也表現(xiàn)出良好的活性和立體選擇性，可應(yīng)用于β-羥基α-D-氨基酸的生物合成。

D-赤式-2-氨基-3-羥基-3-（4 吡啶基）-丙酸是合成β-羥氨基酰胺酒石酸鹽的關(guān)鍵中間體［84］。Goldberg 等［84］分別測試了來源于木糖氧化產(chǎn)堿菌（Alcaligenes xylosoxidans）和節(jié)桿菌（Arthrobactersp.）的兩個D-TA 催化吡啶4-吡咯甲醛和甘氨酸縮合合成D-赤式-2-氨基-3-羥基-3-（4吡啶基）-丙酸的活性和立體選擇性，獲得了催化活性較好的D-TA。隨后作者通過發(fā)酵工藝和實驗條件優(yōu)化，顯著改善了該酶的穩(wěn)定性和催化活性，實現(xiàn)了對目標(biāo)化合物的嚴(yán)格立體選擇性合成（de>99%）（表2）。同時，在此基礎(chǔ)上，作者設(shè)計了多步反應(yīng)用于合成β-羥氨基酰胺酒石酸。巧妙的是，該化合物的等電點由于接近反應(yīng)體系的pH，在反應(yīng)過程中能從混合物中結(jié)晶出來且具有良好的純度，這極大地降低了后續(xù)分離純化的成本。最后，作者對溫度、pH、底物濃度和酶量進(jìn)行了優(yōu)化，顯著地提升了合成效率，在100 L制備級反應(yīng)中成功高效綠色地合成了該目標(biāo)化合物［17］。

D-TA不僅可以催化醛氨縮合合成HAAs，還可催化羥醛裂解反應(yīng)，這也為D-TA 在動力學(xué)拆分上獲得單一構(gòu)型化合物提供了一種巧妙和經(jīng)濟(jì)的策略。D-TA 催化β-羥基-α-D-氨基酸裂解合成甘氨酸和醛，可以作為合成β-羥基-α-L-氨基酸的原料。目前幾種D-TA 已經(jīng)被用于手性拆分合成臨床藥物中間體，比如屈西多巴和L-蘇式-4-MTPS 等［46］。雖然D-TA 已可應(yīng)用于HAAs 的手性拆分，但其工業(yè)應(yīng)用仍面臨瓶頸，例如醛底物在水相中的溶解度較差限制了反應(yīng)物的濃度以及存在底物回收困難等問題。Liu等［86］開發(fā)了基于D-蘇式-4-MTPS良好溶解性的兩相離子溶劑［BMIM］［BF4］，以來源于Alcaligenes xylosoxidansIFO 12669 的D-TA 為 研 究對象，使用該酶拆分D/L-蘇式-4-MTPS獲得了高純度的L-蘇式-4-MTPS，其e.e.>99%，產(chǎn)率為41.7%，由于該體系適用于水溶性較差的醛底物，成功避免了拆分后的底物通過羥醛縮合反應(yīng)可逆合成D-赤式-4-MTPS。

Table 2 Applications of threonine aldolases for the synthesis of β-hydroxy-α-amino acids表2 蘇氨酸醛縮酶在β-羥基-α-氨基酸合成中的應(yīng)用

續(xù)表2

4 總結(jié)與展望

HAAs是一類重要的藥物分子合成的手性中間體，可用于抗感染藥物甲砜霉素、氟苯尼考和氯霉素等的合成，還可直接作為藥物分子屈西多巴治療帕金森病，在抗菌、抗腫瘤和免疫活性抑制等方面都具有重要應(yīng)用，是藥物工業(yè)合成中一類重要目標(biāo)化合物。由于HAAs含有相鄰的雙手性碳原子，探索其嚴(yán)格立體選擇性合成是研究的重點和難點。TA是一類PLP依賴的I型折疊酶，能在溫和的條件下一步可逆催化羥醛縮合反應(yīng)合成HAAs，在手性氨基酸藥物工業(yè)合成中具有重大應(yīng)用潛力。本文綜述了TA在新酶挖掘、結(jié)構(gòu)-催化機理解析、分子改造以及在HAAs 中的合成應(yīng)用等方面的研究進(jìn)展。雖然目前在TA的研究方面取得了較大的進(jìn)展，但仍存在一定的不足和缺陷。例如：目前絕大多數(shù)突變體在改善某一方面催化性能時會大幅度影響其他酶催化特性，如何平衡各種催化特性和多維度提升TA 催化性能仍具挑戰(zhàn)性；TA 尚無法實現(xiàn)對多種HAAs的高效和嚴(yán)格立體選擇性合成?；谌斯ぶ悄茌o助和機器學(xué)習(xí)指導(dǎo)的定向進(jìn)化，探索序列和結(jié)構(gòu)特征與底物偏好性之間的關(guān)系，有利于開發(fā)更高效進(jìn)化策略進(jìn)一步提升TA 在手性藥物合成中的應(yīng)用。此外，可通過酶固定化技術(shù)開發(fā)納米酶等穩(wěn)定性好的工業(yè)生物催化劑，并結(jié)合多酶級聯(lián)反應(yīng)一鍋法合成更多高價值手性氨基酸藥物，以保證工業(yè)合成的綠色、高效和經(jīng)濟(jì)性。