葡萄枝堆肥腐殖化的微生物養(yǎng)分限制機(jī)理探討

齊熙平，黃懿梅，賈鵬輝，劉一帆，謝健宇，傅彬欣，李建波

（西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西北植物營(yíng)養(yǎng)與農(nóng)業(yè)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100）

我國(guó)的葡萄種植面積已達(dá)8.7 億hm2，每年冬季修剪下的枝條可達(dá)604 萬(wàn)t[1]，這些枝條含有豐富的生物質(zhì)能源、常量元素和微量元素[2]，其經(jīng)過堆肥化處理可轉(zhuǎn)化為含腐殖質(zhì)的有機(jī)肥料或土壤調(diào)理劑，用于提高土壤肥力[3]。但葡萄枝含有大量難以降解的木質(zhì)素和纖維素，致使堆肥時(shí)間長(zhǎng)、質(zhì)量低[4]。高溫預(yù)處理可以破壞物料中木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)，增加堆肥中揮發(fā)性脂肪酸、氨基酸、多糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量[5-6]，促進(jìn)放線菌富集以及醌類再生和縮合，增強(qiáng)胡敏酸聚合[7]；菇渣具有相對(duì)較高的比表面積、發(fā)達(dá)的微孔結(jié)構(gòu)，含有豐富的腐殖質(zhì)前體物質(zhì)和胞外酶，添加至堆肥中有利于有機(jī)物的降解和腐殖質(zhì)的形成[8]，Meng等[9]的研究表明，添加15%菇渣處理使污泥堆肥中胡敏酸含量增幅顯著高于未添加菇渣處理。

好氧堆肥實(shí)質(zhì)上是一個(gè)由微生物主導(dǎo)的有機(jī)物分解并生成穩(wěn)定腐殖物質(zhì)的過程[10]，微生物分泌的多種胞外酶可以分解復(fù)雜底物中最具限制性的養(yǎng)分，將高分子量有機(jī)化合物降解成可同化的分子從而促進(jìn)系統(tǒng)中微生物養(yǎng)分循環(huán)和能量流動(dòng)[11]。最常見的參與C、N、P循環(huán)的相關(guān)胞外酶包括β-1，4-葡萄糖苷酶（BG）、β-1，4-N-乙?；被咸烟擒彰福∟AG）、亮氨酸氨基多肽酶（LAP）和堿性磷酸酶（AP）[12]。胞外酶化學(xué)計(jì)量比，即與C、N、P 等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)獲取相關(guān)的胞外酶比率，可以反映微生物的營(yíng)養(yǎng)需求和對(duì)有限資源的可用性[11]。Wang 等[12]發(fā)現(xiàn)添加沼渣和生物炭的稻草堆肥中參與C、N 和P 轉(zhuǎn)化的4 種胞外酶的活性都顯著提高，有機(jī)質(zhì)分解加快，BG∶AP和（NAG+LAP）∶AP 比值相比對(duì)照顯著降低，微生物對(duì)P 的需求增加，受到P 的限制，微生物會(huì)分泌更多的堿性磷酸酶來(lái)維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)。然而，從胞外酶活性及其化學(xué)計(jì)量變化的微生物養(yǎng)分限制的角度探討堆肥過程中影響腐植酸形成的機(jī)理研究還較少，葡萄枝中添加菇渣和使用高溫預(yù)處理之后的堆肥腐殖化效果及其微生物養(yǎng)分限制機(jī)理尚不清楚。

因此，本研究以葡萄冬剪枝條為試材，雞糞為調(diào)理劑，探討添加菇渣以及高溫預(yù)處理對(duì)堆肥過程中理化參數(shù)、腐植酸含量、胞外酶活性及其化學(xué)計(jì)量變化的影響，揭示堆肥過程中微生物胞外酶活性及其化學(xué)計(jì)量與腐植酸形成之間的關(guān)系，為豐富堆肥腐殖化機(jī)理和促進(jìn)葡萄枝的高效肥料化利用提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 堆肥材料及其基本性質(zhì)

新鮮雞糞取自楊凌永順養(yǎng)雞場(chǎng)；葡萄枝和香菇菇渣分別來(lái)自西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院葡萄教學(xué)標(biāo)本圃和陜西省楊凌知君菌業(yè)科技公司，使用前將其粉碎至2～3 cm。物料基本理化性質(zhì)見表1。

表1 堆肥原料的理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of compost raw materials

1.2 堆肥方法及樣品采集

試驗(yàn)共設(shè)3 個(gè)處理：對(duì)照組（CK），葡萄枝與新鮮雞糞按鮮質(zhì)量比約1∶1 混合后添加適量水，調(diào)節(jié)堆肥初始含水率為50%～60%，C/N 為30∶1～35∶1，總質(zhì)量18 kg；添加菇渣組（M），在CK 基礎(chǔ)上添加15%（濕質(zhì)量）的菇渣；高溫預(yù)處理組（H），按照CK 的比例，將原料混合加熱至90 ℃且持續(xù)4 h 后，轉(zhuǎn)入堆肥反應(yīng)器堆肥。3組物料混合均勻后置于3個(gè)60 L密閉強(qiáng)制通風(fēng)好氧發(fā)酵裝置中堆肥45 d，裝置外使用保溫棉進(jìn)行保溫以減少熱量損失。采用機(jī)械強(qiáng)制間歇曝氣，每1 h曝氣5 min，曝氣速率為73 L·min-1。堆制期間不補(bǔ)充水分。每日9：00 和17：00 用電子溫度計(jì)于堆體上、中、下部測(cè)定溫度（T），取其平均值作為當(dāng)日的堆溫，同時(shí)測(cè)定環(huán)境溫度。根據(jù)溫度變化分別在第0、7、14、21、28、35、44 天取樣，取樣后手動(dòng)翻堆，分別于堆肥物料上、中、下部采集樣品，每份樣品約200 g，樣品混勻之后分為兩份：一份于-20 ℃儲(chǔ)存用于測(cè)定含水率、pH、電導(dǎo)率（EC）、種子發(fā)芽指數(shù)、溶解性有機(jī)碳（DOC）、-N、-N 以及胞外酶活性；另一份風(fēng)干后用球磨儀研磨，過1 mm 篩，用于測(cè)定總有機(jī)碳（TOC）、總氮（TN）、總磷（TP）、腐植酸碳及其組分。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及其方法

稱取新鮮樣品2 g，將樣品含水率折算后，按照干物質(zhì)質(zhì)量與液體體積比1∶10 加入相應(yīng)體積的去離子水，180 r·min-1振蕩1 h，過濾得浸提液。使用配有pH Intelli CAL 電極和EC Intelli CAL 電極的HQ11d電位儀測(cè)定浸提液的pH 和EC。將10 顆蘿卜種子均勻散布在墊有濾紙的9 cm 培養(yǎng)皿中，吸取5 mL 浸提液浸潤(rùn)，在25 ℃避光條件下培養(yǎng)72 h 后測(cè)定發(fā)芽率和根長(zhǎng)，計(jì)算種子發(fā)芽指數(shù)，種子發(fā)芽指數(shù)=（試驗(yàn)樣種子發(fā)芽數(shù)×試驗(yàn)樣種子平均根長(zhǎng)）/（對(duì)照樣種子發(fā)芽數(shù)×對(duì)照樣種子平均根長(zhǎng)）×100%。

含水率采用烘干法測(cè)定；TN 采用凱氏定氮法測(cè)定；TP采用釩鉬黃比色法測(cè)定。DOC用TOC 儀（日本島津TOC-L）測(cè)定。樣品經(jīng)KCl（2 mol·L-1）浸提稀釋后采用流動(dòng)分析儀測(cè)定-N 與-N[13]。有機(jī)質(zhì)采用馬弗爐灼燒減重法測(cè)定（550 ℃，6 h），測(cè)定值除以系數(shù)1.724 得TOC 含量[14]。腐植酸碳、胡敏酸碳（HA-C）及富里酸碳（FA-C）采用科諾諾娃法測(cè)定[15]。腐殖化率=腐植酸碳含量/總有機(jī)碳含量×100；腐殖化指數(shù)=胡敏酸碳含量/總有機(jī)碳含量×100。

胞外酶活性使用多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan Infinite M200 PRO 型）通過96 微孔板熒光法測(cè)定[16]。測(cè)定指標(biāo)包括1種參與C 循環(huán)的酶：β-1，4-葡萄糖苷酶（BG），通過4-MUB-β-D-葡萄糖苷的釋放量來(lái)表示；2種參與N循環(huán)的酶：β-1，4-N-乙酰基氨基葡萄糖苷酶（NAG）和亮氨酸氨基多肽酶（LAP），分別通過4-MUB-N-乙酰基-β-D-葡萄糖苷和L-亮氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素鹽酸鹽的釋放量來(lái)表示；1種參與P循環(huán)的酶：堿性磷酸酶（AP），通過4-MUB-磷酸的釋放量來(lái)表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2019 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析；采用SPSS 22.0中的單因素方差分析（One-way ANOVA）進(jìn)行組間的顯著性檢驗(yàn)；采用OriginPro 2021 制圖。冗余分析采用Canoco 5 完成；采用Amos 24.0 構(gòu)建結(jié)構(gòu)方程模型，并使用Powerpoint 2019繪制轉(zhuǎn)化關(guān)系圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 堆肥溫度、含水率、EC、pH、種子發(fā)芽指數(shù)的變化

堆肥過程中高溫期維持時(shí)間長(zhǎng)有助于殺滅寄生蟲和病原體[17]，提高堆肥效率。如圖1 所示，CK、M、H分別于第3、8、4天達(dá)到高溫期（＞50 ℃），且高溫期分別保持了19、15、19 d，符合《糞便無(wú)害化衛(wèi)生要求》（GB 7959—2012）。添加菇渣推遲了堆體進(jìn)入高溫期的時(shí)間，其原因可能是菇渣中存留的菌絲以及某些致病菌或污染物影響了堆體土著微生物的生長(zhǎng)[18]。

圖1 堆肥過程中溫度的變化Figure 1 Changes of temperature during composting

含水率變化如圖2a 所示，H 的含水率降低，略低于其他兩組。各組進(jìn)入高溫期后由于有機(jī)物降解產(chǎn)水，含水率稍有提升，隨后逐漸下降。如圖2b 所示，第7～14 天，M 和H 的EC 值顯著高于CK（P＜0.05），可能是相比CK，M 和H 中有機(jī)物分解產(chǎn)生的、揮發(fā)性脂肪酸-N和-N較多所致。14 d之后，3組的EC 值逐漸升高，可能是由于堆體水分降低引發(fā)了鹽離子的富集濃縮[19]。堆肥結(jié)束時(shí)，CK、M、H 的EC值分別為3.46、3.12、3.42 mS·cm-1，差異不顯著。如圖2c所示，堆肥過程中3組pH呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，這主要是由于微生物在分解有機(jī)氮過程中產(chǎn)生了堿性氨，14 d之后，-N 以氣體的形式揮發(fā)導(dǎo)致pH 下降，堆肥結(jié)束時(shí)，CK、M、H 的pH 分別為8.53、8.45、8.59，差異不顯著。CK、M、H 的種子發(fā)芽指數(shù)分別為103.15%、100.02%和91.00%（圖2d），差異不顯著，均達(dá)到70%以上，符合《有機(jī)肥料》（NY/T 525—2021）的要求。

圖2 堆肥過程中含水率、pH、EC、種子發(fā)芽指數(shù)的變化Figure 2 Changes of moisture content，pH，EC and seed germination index during composting

2.2 堆肥中腐植酸碳、HA-C、FA-C含量的變化

如圖3a所示，第0天，H 的腐植酸碳含量較CK 高7.99%。第0～14 天，有機(jī)物降解劇烈，各組腐植酸碳含量迅速下降，之后逐漸上升。第14天和第28天，M和H 的腐植酸碳含量顯著高于CK（P＜0.05）。最終CK、M、H 的腐植酸碳含量分別為93.03、100.81、100.90 g·kg-1，M 和H 顯著高于CK（P＜0.05）。如圖3b所示，第14 天，M 和H 的HA-C 含量開始同時(shí)高于CK，直至堆肥結(jié)束?？傮w來(lái)說(shuō)，M 和H 在第14～44 天分別較CK 提高了7.64%～37.62%和9.26%～36.96%的HA-C 含量。其中M 和H 在第21～28 天的HA-C 含量較CK 增加了7.64%～37.62%和9.47%～36.96%，增速較快，這反映了M 和H 在降溫階段促進(jìn)了HA-C 的形成。最終CK、M、H的HA-C含量分別為42.71、51.70、49.29 g·kg-1，M 和H 顯著高于CK（P＜0.05）。FA-C 的變化趨勢(shì)與腐植酸碳的相似，至堆肥結(jié)束，CK、M、H的FA-C 含量分別為50.32、49.11、51.61 g·kg-1，差異不顯著，與初期相比分別降低了35.77%、34.81%和40.74%。當(dāng)腐殖化率≥7.0、腐殖化指數(shù)≥3.5 時(shí)堆體達(dá)到腐熟[17]。堆肥過程中腐殖化指標(biāo)變化情況如表2所示，最終CK、M、H的腐殖化率和腐殖化指數(shù)分別為21.87、23.91、23.96 和10.04、12.26、11.71，均達(dá)到腐熟。相比CK，H 的腐殖化率提升了9.56%，M 的腐殖化指數(shù)提高了22.11%。

表2 堆肥過程中腐殖化指標(biāo)變化情況Table 2 Changes of humification indicators during composting

圖3 堆肥過程中腐植酸碳及其組分的變化Figure 3 Changes of humus acid carbon and its components during composting

2.3 堆肥中養(yǎng)分及化學(xué)計(jì)量的變化

如圖4a 至圖4c所示，3組的TOC 含量呈下降趨勢(shì)，TN 和TP含量呈上升趨勢(shì)。堆肥第14～21天，H 的TOC 含量下降速率最快，為4.35%，而CK 和M 只有1.39%和1.14%。堆肥結(jié)束時(shí)，CK、M、H 的TOC 含量分別較初始下降了8.06%、10.00%、9.19%，M 和H 的TOC降解率相比CK分別提高了1.94個(gè)和1.13個(gè)百分點(diǎn)。CK、M、H 初始TN 含量分別為15.31、13.50、13.21 g·kg-1，M 和H 顯著低于CK（P＜0.05），7 d后，M 和H 的TN 含量開始高于CK。堆肥結(jié)束時(shí)，CK、M、H 的TN含量較初始分別提升了66.44%、107.28%、116.85%，M 和H 的TN 提升率比CK 分別高出40.84 個(gè)和50.41個(gè)百分點(diǎn)，TN 含量較CK 分別提高了9.81% 和12.44%。CK、M、H 的TP 含量較初始分別提升了54.09%、95.47%、125.49%，M 和H 的提升速率明顯高于CK（P＜0.05），分別高出41.38 個(gè)和70.40 個(gè)百分點(diǎn)，最終TP含量較CK分別提高了9.84%和9.04%。

DOC 是堆肥中微生物合成自身生命體最直接的碳源，因此容易發(fā)生微生物降解[3]。各組DOC 含量在0～14 d 內(nèi)快速下降（圖4d），其原因是微生物對(duì)易利用碳的快速分解利用，第14～28 天，M 和H 的DOC 含量顯著高于CK（P＜0.05），可能與M 和H 中難降解有機(jī)物被降解為小分子可溶性有機(jī)物有關(guān)。堆肥結(jié)束時(shí)，各組DOC 穩(wěn)定在11 g·kg-1左右，差異不顯著。由于有機(jī)氮的降解，各組-N 在第7 天稍有提升，之后隨著堆肥的進(jìn)行逐漸降低，最終穩(wěn)定在0.15 g·kg-1左右（圖4e），且各組間差異不顯著。各組的-N含量呈降低趨勢(shì)（圖4f），主要是堆肥中反硝化作用使-N 轉(zhuǎn)化為N2O 揮發(fā)所致，35 d 之后硝化作用增強(qiáng)，M 和H 的-N 含量上升，且顯著高于CK（P＜0.05）。

圖4 堆肥過程中TOC、TN、TP、DOC、-N、-N的變化Figure 4 Changes of TOC，TN，TP，DOC，-N，-N during composting

如圖5a 所示，第0 天，CK、M、H 的C∶N 分別為30.22、34.71、35.10，M 和H 顯著高于CK（P＜0.05），原因是菇渣本身C∶N 較高以及高溫預(yù)處理期間會(huì)使一部分氮素以氣體形式損失。隨著堆肥進(jìn)行，有機(jī)碳的降解速率高于有機(jī)氮的降解速率，C∶N逐漸降低。第14 天，CK、M、H 的C∶N 分別是29.33、27.63、25.25，H下降最快，較第0天下降了28.06%。堆肥結(jié)束時(shí)各組C∶N 穩(wěn)定在15 左右，M 和H 顯著低于CK（P＜0.05）。如圖5b 所示，第0 天，M 和H 的C∶P 顯著高于CK（P＜0.05），第21～35 天，M 的C∶P 高于其他兩組。最終3組的C∶P 穩(wěn)定在50 左右，且差異不顯著。如圖5c 所示，3 組的N∶P 比值從堆肥開始到結(jié)束變化較小，都在3左右，M和H的N∶P在整個(gè)堆肥期間都高于CK。

圖5 堆肥過程中化學(xué)計(jì)量的變化Figure 5 Changes of stoichiometry during composting

2.4 堆肥中胞外酶活性及其化學(xué)計(jì)量的變化

BG 可將寡糖水解成單糖，為微生物提供可利用的底物和能源[20]；NAG可以催化細(xì)胞壁主要成分幾丁質(zhì)和肽聚糖的水解[21]，主要用于獲取微生物容易利用的N[22]。LAP 能切割蛋白質(zhì)中的肽鍵，在蛋白水解中起重要作用[12]。AP 是堆肥過程中參與P 循環(huán)的主要磷酸酶，可將有機(jī)磷水解成可被植物吸收和代謝的不同形式的磷酸鹽[23]。

從圖6可以看出，第0～7天，高溫預(yù)處理導(dǎo)致H的各種酶活性較CK 顯著降低（P＜0.05），而添加菇渣可顯著提升各種酶的活性（P＜0.05）。第14 天，CK 和M中的AP 活性受高溫影響較前期略微下降，而H 中的不降反升，并從此時(shí)到堆肥結(jié)束H 的AP 活性一直高于CK。第14天直至堆肥結(jié)束，H的BG活性顯著高于其他兩組（P＜0.05），且在高溫期時(shí)也有較大的活性（1 540.15 nmol·h-1·g-1），比CK 和M 分別高8.97%～13.07% 和9.82%～44.87%。第14天溫度達(dá)到56～58℃，各組的NAG活性急劇下降，而LAP活性同時(shí)升高，CK、M、H的LAP活性較第0天分別提升了176.33%、128.48%、368.76%，M 和H 的LAP 活性顯著高于CK（P＜0.05）。第21 天直至堆肥結(jié)束，3 組的NAG活性都較高，除第28天外，其他時(shí)間下H的NAG活性顯著高于CK（P＜0.05）。第28～44 天，M 的LAP活性高于另外兩組。

圖6 堆肥過程中酶活性的變化Figure 6 Changes of enzyme activity during composting

如圖7所示，堆肥第0天，CK、M、H的BG∶（NAG＋LAP）比率分別為1.00、0.74、0.55，BG∶AP 比率分別為8.63、6.83、4.40，（NAG＋LAP）∶AP比率分別為8.69、9.15、7.96，相比CK，M 和H中的微生物受到N和P 養(yǎng)分的限制。第14 天，M 的BG∶（NAG+LAP）顯著低于CK，（NAG＋LAP）∶AP顯著高于CK，與CK相比M中的微生物受到N的限制；H的BG∶AP 和（NAG+LAP）∶AP 顯著低于CK，與CK 相比H 中的微生物受到P 的限制。從第21 天開始到堆肥結(jié)束，3 組的BG∶（NAG＋LAP）、BG∶AP、（NAG＋LAP）∶AP 比值變化無(wú)較大起伏，第44 天，CK、M、H 的酶促C∶N∶P活性比為1.00∶3.22∶0.45、1.00∶3.22∶0.47、1.00∶2.78∶0.40，各組間無(wú)顯著差異。

圖7 酶化學(xué)計(jì)量在不同時(shí)期的變化Figure 7 Enzyme stoichiometry in different periods

2.5 腐植酸組分與理化性質(zhì)、胞外酶活性之間的關(guān)系

堆肥理化性質(zhì)、化學(xué)計(jì)量、胞外酶活性（藍(lán)色箭頭）和腐植酸組分（紅色箭頭）的冗余分析（RDA）結(jié)果如圖8所示：HA-C與AP、NAG、LAP呈正相關(guān)，與TN、TP、N∶P、pH呈正相關(guān)，與FA-C、BG、DOC、TOC、C∶N、C∶P、T、EC、-N、-N呈負(fù)相關(guān)。

圖8 堆肥過程中基本理化性質(zhì)與腐植酸碳組分的冗余分析Figure 8 Redundancy analysis of basic physicochemical properties and carbon components of humic acid in composting process

根據(jù)RDA 相關(guān)性分析結(jié)果構(gòu)建的結(jié)構(gòu)方程模型（SEMs）如圖9 所示，可以看出3 組化學(xué)計(jì)量影響相關(guān)胞外酶活性進(jìn)而影響HA-C 的形成，3 個(gè)模型的擬合指數(shù)已經(jīng)滿足完美擬合指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)（X2/df＜2，P＞0.05，GFI＞0.950，CFI＞0.900 以及RMSEA＜0.05）[24]。3 組影響HA-C 形成的關(guān)鍵胞外酶不同：在CK 中，C∶N 調(diào)節(jié)BG 和AP的活性，從而影響HA-C 的生成，C∶N、BG 和AP 都與HA-C 的生成呈負(fù)相關(guān)；在M 中，隨著堆肥的進(jìn)行，C∶N 逐漸降低，LAP 活性增強(qiáng)，促進(jìn)HA-C 的生成；同理，在H 中，隨C∶N 的降低，AP 活性增強(qiáng)，進(jìn)而促進(jìn)了HA-C的生成。

圖9 化學(xué)計(jì)量和胞外酶對(duì)HA-C形成的影響Figure 9 Effects of stoichiometry and extracellular enzymes on the formation of HA-C

3 討論

3.1 添加菇渣和高溫預(yù)處理對(duì)葡萄枝堆肥腐殖化的影響

本研究3 個(gè)處理的堆肥在堆制45 d 后都達(dá)到了無(wú)害化衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求，且添加菇渣和高溫預(yù)處理促進(jìn)了葡萄枝堆肥胡敏酸的生成。在堆肥過程中，糖類和氨基酸等腐殖質(zhì)前體可被微生物降解和轉(zhuǎn)化成腐植酸，當(dāng)可利用的有機(jī)物不足時(shí)，不穩(wěn)定的腐植酸會(huì)被微生物降解，以提供微生物所需的能量[25]。本研究堆肥化的第7～14 天，溫度較高，CK 的腐植酸碳含量陡降，下降速率為35.26%，而M和H只下降了14.89%和11.57%，且腐植酸中較穩(wěn)定的組分胡敏酸開始升高，上升速率較CK 快，說(shuō)明在M 和H 中一些有機(jī)碳更多地是轉(zhuǎn)化為胡敏酸而不是被降解，從而提高了堆肥的腐植酸含量。高溫預(yù)處理可促進(jìn)堆體中多糖與類蛋白反應(yīng)產(chǎn)生類腐殖質(zhì)物質(zhì)，羧基、羥基和芳核等腐殖質(zhì)物質(zhì)也會(huì)增多[26]，因此，高溫預(yù)處理初始和最終的腐植酸含量都較高。菇渣為芳構(gòu)化和氧化反應(yīng)提供了豐富的底物，底物中含有大量的纖維結(jié)構(gòu)成分，而且菇渣本身含有較多的腐植酸[27]，因此添加菇渣的堆肥中最終HA-C 含量最多。堆肥化第7 天，M 和H 的TN 就已經(jīng)高于CK，說(shuō)明添加菇渣和高溫預(yù)處理可以減少堆肥中的N 損失，加速TN 的濃縮效應(yīng)。菇渣中的易降解有機(jī)物較多，其快速分解導(dǎo)致較多短鏈脂肪酸累積[28]，從而可中和一部分NH+4-N，減少N 素?fù)p失，這與Meng 等[9]在污泥堆肥中添加菇渣的研究結(jié)果一致。高溫預(yù)處理會(huì)抑制反硝化細(xì)菌生長(zhǎng)以及產(chǎn)生有機(jī)酸降低物料pH 而起到保N 作用[29]。研究表明，部分腐植酸的形成是通過含N 和含P 化合物與其他腐殖質(zhì)前體的縮合實(shí)現(xiàn)的[30-31]。本試驗(yàn)中，TN、TP 與HA-C 的含量都是隨著堆肥的進(jìn)行逐漸增加，三者之間存在正相關(guān)關(guān)系（圖8），說(shuō)明一些有機(jī)物分解產(chǎn)生的N、P離子以與其他前體螯合的形式被回收，并存在于HA-C 中。TN、TP 和HA-C 的含量同時(shí)有效提升，與Jia 等[25]在菇渣堆肥中添加園林廢棄物的研究結(jié)果一致。這也是添加菇渣和高溫預(yù)處理可促進(jìn)胡敏酸生成的原因之一。

3.2 添加菇渣和高溫預(yù)處理對(duì)胞外酶活性的影響

胞外酶是微生物釋放的可以降解復(fù)雜大分子的蛋白質(zhì)，參與養(yǎng)分循環(huán)并具有重要作用，其活性強(qiáng)弱可以表示養(yǎng)分轉(zhuǎn)化能力的大小[32]。添加菇渣在堆肥初期可顯著提升4 種胞外酶的活性。香菇菇渣富含降解纖維素及木質(zhì)素的真菌[4]，可增加堆肥中有機(jī)物的含量，為真菌、細(xì)菌等微生物的生長(zhǎng)提供了更多更易利用的碳源和氮源，從而使堆肥初期酶活性較高。M 的NAG 酶活性在堆肥初始達(dá)到峰值，可能是由于菇渣中富含真菌菌絲，微生物殘余積累的肽聚糖豐富，死亡的真菌菌絲體通過微生物演替而分解[33]。由于90 ℃的高溫預(yù)處理，H 的AP、BG、LAP 活性在堆肥初期顯著低于其他兩組（P＜0.05），可能是因?yàn)槌邷囟逊恃苌龅姆紵N比例較高，且酚基碳的強(qiáng)度更高[34]，而酚類物質(zhì)的濃度增加會(huì)導(dǎo)致和養(yǎng)分循環(huán)相關(guān)的微生物活性的降低[12]。有機(jī)物的分解速率可以用胞外酶活力來(lái)表征[32]，各組高溫時(shí)期只有BG 和LAP的活性沒有因?yàn)楦邷囟黠@下降，可能由于此時(shí)微生物大量繁殖，纖維素、蛋白質(zhì)等碳源、氮源快速分解，微生物的同化吸收更需要這兩種酶參與，H 的4 種胞外酶活性在高溫期和腐熟期都顯著高于CK（P＜0.05），表明高溫預(yù)處理有助于大分子有機(jī)物的降解。各組4 種酶的活性都是在第28 天開始下降并逐漸穩(wěn)定，原因是在升溫和高溫階段，易代謝底物較多，微生物大量繁殖，大分子有機(jī)物迅速分解；而在后期，大部分容易利用的有機(jī)物已被降解完全，堆體穩(wěn)定，微生物活性減弱，酶活性降低。此外，酶和腐殖質(zhì)之間形成的復(fù)合物也破壞了酶與底物的相互作用，導(dǎo)致在堆肥后期胞外酶活性降低[12]。

3.3 堆肥養(yǎng)分和胞外酶活性的化學(xué)計(jì)量與HA-C 生成的關(guān)系

化學(xué)計(jì)量能夠有效說(shuō)明養(yǎng)分限制類型，是反映C、N、P 循環(huán)以及養(yǎng)分平衡的重要參數(shù)[35]。堆肥C∶N是體現(xiàn)堆肥有機(jī)物分解速率的指標(biāo)，比值越高表明有機(jī)物的礦化分解速率越慢[16]。本研究中，從第7 天開始到堆肥結(jié)束，H 的C∶N 比其他兩組都低，尤其在高溫期迅速下降，下降速率相比CK 高247.41%，也是在同一時(shí)期，H 的HA-C 含量較CK 顯著上升，表明高溫預(yù)處理有利于有機(jī)物降解礦化和胡敏酸的快速形成。C∶P 也能在一定程度上反映有機(jī)質(zhì)的礦化速率，通常C∶P 越低，越利于微生物對(duì)有機(jī)物的分解，同時(shí)提高堆肥全P 的含量[36]。與C∶N 相同，H 的C∶P 下降速率快，也顯示出高溫預(yù)處理有利于有機(jī)物礦化。第14天之前，M 和H 的C∶P 高于CK，第14 天之后，H 的C∶P開始低于CK，第44天，M和H的C∶P都低于CK。整個(gè)堆肥期間，M 和H 的N∶P 一直高于CK，M 在第7 天到第14 天的C∶P 顯著高于其他兩組（P＜0.05），結(jié)合相應(yīng)時(shí)期M 的BG∶AP 較小以及N∶P 較大，說(shuō)明M 組微生物受環(huán)境影響需要分泌更多的AP來(lái)滿足生長(zhǎng)需求，在此期間M 中的微生物受到P養(yǎng)分的限制。研究證明，微生物會(huì)最大限度地優(yōu)化自己的儲(chǔ)備資源，易利用的底物是提升微生物生物量和分泌胞外酶的基礎(chǔ)[37]。堆肥過程中，當(dāng)可用的能量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)變得有限時(shí)，微生物就會(huì)釋放該元素的獲取酶，以應(yīng)對(duì)養(yǎng)分供應(yīng)的變化，從而改變生態(tài)酶的化學(xué)計(jì)量特征[37]。SEMs 顯示（圖9），在整個(gè)過程中，各組的HA-C 含量受不同胞外酶的影響：CK 的HA-C 含量與BG 和AP都呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。當(dāng)BG 酶分泌較多時(shí)，纖維素和木質(zhì)素逐漸被分解，而它們的類衍生物是構(gòu)成腐植酸的核心骨架和主要成分[17]，因此不利于胡敏酸聚合。M 的HA-C 含量與LAP 呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），在H 中HA-C 含量和AP 呈顯著正相關(guān)（P＜0.01）。即在M 和H 中產(chǎn)生的微生物N 和P 限制會(huì)提高蛋白質(zhì)、有機(jī)磷降解酶的活性，導(dǎo)致N 和P 礦化增加，以應(yīng)對(duì)N、P 限制，礦化后的物質(zhì)有利于合成胡敏酸：如NH+4-N 可通過非生物途徑作為前體直接參與胡敏酸的形成[38]；P 和腐植酸、胡敏酸之間可以螯合，螯合產(chǎn)物還能促進(jìn)P 的溶解度和生物利用率[31]。從圖7 可以看出，BG∶（NAG＋LAP）、BG∶AP、（NAG＋LAP）∶AP的值都是在第21天之前變化較大，與CK相比此時(shí)M 和H 中的微生物受到的養(yǎng)分限制較大，第21 天之后比值減小并穩(wěn)定，也是因?yàn)榍捌谟袡C(jī)質(zhì)降解，組分變化快，難以降解的大分子有機(jī)物需要微生物分泌相應(yīng)的胞外酶來(lái)降解。

4 結(jié)論

（1）葡萄枝雞糞好氧堆肥高溫期（＞50 ℃）持續(xù)10 d 以上，種子發(fā)芽指數(shù)均達(dá)到70%以上，滿足堆肥無(wú)害化和腐熟標(biāo)準(zhǔn)。添加菇渣（M）和高溫預(yù)處理（H）改變了堆肥基質(zhì)的特性，加速了有機(jī)質(zhì)降解，提升了養(yǎng)分含量，促進(jìn)了腐殖化。堆肥第44 天，M 和H 的TN提升率相比CK 提高了40.84 個(gè)和50.41 個(gè)百分點(diǎn)，TP含量提升率相比CK 提高了41.38 個(gè)和71.40 個(gè)百分點(diǎn)、TOC 含量的降解率分別比CK 提高了1.94 個(gè)和1.13個(gè)百分點(diǎn)；相比CK，H 的腐殖化率提升了9.56%，M的腐殖化指數(shù)提升了22.11%。

（2）添加菇渣和高溫預(yù)處理影響了參與C、N、P循環(huán)功能的酶的活性和化學(xué)計(jì)量，顯著提升了4 種胞外酶的活性：M 組在第0～7 天胞外酶活性較高，H 組在第14～44 天胞外酶活性較高，以應(yīng)對(duì)N 和P 養(yǎng)分的限制，降解更多的大分子有機(jī)物，提升N 和P 的含量，有利于胡敏酸的生成，進(jìn)而提升了胡敏酸的含量。