馬鬃蛇石油醚提取物通過調(diào)控Caspase-1對動脈性勃起功能障礙大鼠勃起功能、生育功能的影響

王永軍,代曉微,嚴(yán)福軍

(1紹興第二醫(yī)院·浙江 紹興 312000;2吉林大學(xué)第二醫(yī)院·吉林 長春 130041;3江西瑞昌市婦幼保健院· 江西 九江 332200)

馬鬃蛇中含有多種氨基酸和微量元素,其在滋補(bǔ)強(qiáng)壯和祛風(fēng)活血中有顯著療效,在民間常用于治療血虛體弱和腎虛腰痛等病癥[1]。現(xiàn)代研究表明,馬鬃蛇對雙相激素樣小鼠的療效顯著[2]。馬鬃蛇石油醚提取物(CVPEE)對ED大鼠的作用機(jī)制目前尚未見研究報道。有研究顯示,細(xì)胞凋亡在維持陰莖海綿體細(xì)胞數(shù)量及功能方面發(fā)揮重要作用,貫穿動脈性勃起功能障礙發(fā)病的始末[3]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),動脈性勃起功能障礙大鼠勃起功能差,陰莖細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯高于正常大鼠[4]。Caspase家族與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切,其中位于凋亡通路下游的效應(yīng)蛋白caspase-1起著關(guān)鍵作用,被認(rèn)為是凋亡最可靠的指標(biāo)[5]。本研究旨探究CVPEE通過調(diào)控Caspase-1對動脈性ED大鼠勃起功能及生育功能影響。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 成年雄性健康SD大鼠50只,體質(zhì)量為220～240 g,均購自廣州因明生物醫(yī)藥科技有限公司,許可證號SYXK(粵)2022-2027,經(jīng)交配實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證所有大鼠均有正常的勃起功能。

1.2 藥物 馬鬃蛇購自南京市郊;馬鬃蛇石油醚提取物(CVPEE):本院研制,先將馬鬃蛇的內(nèi)臟取出并烘干,碾碎組織用乙醇醇滲漉提取石油醚萃取,將得到的干膏于冰箱保存。萬艾可:輝瑞制藥有限公司,國藥準(zhǔn)字H20020528。

1.3 試劑與儀器 阿樸嗎啡(Apomorphine, APO)、Caspase-1、Bax、Bcl-2抗體:武漢博士德生物工程有限公司;熒光定量PCR試劑盒:Invitrogen公司;TUNEL檢測試劑盒:上海碧云天生物技術(shù)有限公司;裂解緩沖液:美國Rockford公司。NE910顯微鏡:上海光密公司;PVDF 膜:美國Millipore公司。

2 方法

2.1 動物分組和模型制備 50 只大鼠適應(yīng)飼養(yǎng)3 d,隨機(jī)分為假手術(shù)組10只和造模組40只。1%戊巴比妥鈉(25 mg/kg)麻醉大鼠并沿大鼠腹部正中切開,充分暴露髂內(nèi)動脈,用絲線結(jié)扎髂內(nèi)動脈,縫合皮膚。假手術(shù)組大鼠只暴露髂內(nèi)動脈,不結(jié)扎。在造模過程中造模組有2只大鼠造模失敗,予以補(bǔ)充后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將成模大鼠隨機(jī)分為模型組(灌胃等量生理鹽水)、CVPEE低劑量組(2 g/kg)、高劑量組(4 g/kg)和陽性對照組(萬艾可,12 mg/kg),每組10只;各組大鼠均灌胃給藥,1次/天,連續(xù)給藥21 d。

2.2 觀察指標(biāo)

2.2.1 勃起功能檢測 1)APO實(shí)驗(yàn):末次給藥后24 h,參照文獻(xiàn)[6]中對大鼠的勃起功能進(jìn)行檢測。將大鼠置于安靜的籠中適應(yīng)新環(huán)境10 min,取100 μg/kgAPO溶液于大鼠頸部皮下松弛皮膚注射,記錄大鼠30 min內(nèi)陰莖勃起次數(shù)。2)陰莖海綿體壓力(ICP)測定:APO實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,麻醉大鼠并處死,電針插入陰莖海綿體后計算其ICP值,電刺激穿刺針,每次刺激時間為60 s,20 min后進(jìn)行下一次電刺激,觀察ICP變化并記錄。

2.2.2 生育功能檢測 1)睪丸質(zhì)量和睪丸指數(shù):摘取大鼠左側(cè)睪丸和附睪,吸取表面血跡,稱取其質(zhì)量,計算臟器指數(shù)。2)附睪精子數(shù)量及存活率:取大鼠右側(cè)附睪浸泡于生理鹽水中,用生理鹽水稀釋,計數(shù)精子數(shù)量;根據(jù)精子的活動情況,用顯微鏡計算活動百分比。

2.2.3 TUNEL檢測陰莖海綿體組織細(xì)胞凋亡 取大鼠陰莖海綿體,一半置于多聚甲醛中固定,石蠟包埋,切片,烘干,沖洗干凈后加入終濃度為20 mg/L Proteinase K溶液,室溫孵育切片20 min;再次洗滌,加入1×Equilibration Buffer,孵育20 min后棄掉溶液,加入TdT溶液,孵育1 h(避光)。洗滌組織用DAPI染色,時長為5 min。顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡數(shù)量。凋亡率=(凋亡細(xì)胞數(shù)量/總細(xì)胞數(shù)量)×100%。

2.2.4 Western Blot檢測陰莖海綿體組織Bax、Bcl-2和caspase-1蛋白表達(dá) 取-80℃冰箱保存的另一半陰莖海綿體,研磨勻漿,離心,收集并檢測上清液中蛋白總濃度。配置濃縮和分離膠,將蛋白上樣加入到膠孔中,電泳10 min后轉(zhuǎn)膜。孵育PVDF膜2 h,在蛋白樣本中加入封閉液,封閉PVDF膜1 h。加入一抗Bax、Bcl-2和caspase-1孵育過夜,繼續(xù)加入HRP標(biāo)記的二抗,繼續(xù)孵育2 h。將ECL發(fā)光劑加入到細(xì)胞中曝光,用顯影液顯影,用Image Lab軟件檢測目的蛋白表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1 CVPEE對大鼠勃起功能的影響 見表1。

表1 各組大鼠勃起次數(shù)和ICP值比較

3.2 CVPEE對大鼠睪丸指數(shù)和附睪指數(shù)的影響 見表2。

表2 各組大鼠睪丸和附睪重量和指數(shù)比較

3.3 CVPEE對大鼠精子密度和精子存活率的影響 見表3。

表3 各組大鼠精子密度和精子存活率比較

3.4 CVPEE對陰莖海綿體細(xì)胞凋亡率的影響 各組大鼠陰莖海綿體細(xì)胞凋亡率相比:模型組[(35.12±2.34)%]明顯高于假手術(shù)組[(3.48±0.78)%](P<0.05),提取物低劑量組[(27.63±2.01)%]和提取物高劑量組[(12.54±1.25)%]、陽性組[(12.63±1.27)%]均低于模型組,提取物高劑量組低于提取物低劑量組(P<0.05),陽性組較提取物高劑量組無明顯差異(P>0.05)。

3.5 CVPEE對各組大鼠陰莖海綿體組織Bax、Bcl-2和caspase-1蛋白表達(dá)影響 與假手術(shù)組相比,模型組Bcl-2蛋白表達(dá)降低,Bax和caspase-1蛋白表達(dá)升高(P<0.05);和模型組相比,低劑量組和高劑量組Bcl-2表達(dá)升高,Bax和caspase-1蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。見圖1。

注:與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與低劑量組比較,△P<0.05

4 討論

研究發(fā)現(xiàn)ED發(fā)病率在10%～52%,尤以40～70歲男性居多。西方國家每年每1 000例男性人口中有25～30例新增勃起功能障礙病例。近年來調(diào)查顯示,我國超過90%的60歲男性患者有勃起功能障礙性疾病[7]。近些年隨著中醫(yī)的發(fā)展,馬鬃蛇治療勃起功能障礙疾病受到學(xué)者們的廣泛關(guān)注。動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,馬鬃蛇醇提取物在對去勢小鼠的治療上,有一定的雄激素樣作用[8];毒性研究結(jié)果顯示,馬鬃蛇醇提取物在臨床的使用劑量上具有一定安全性[9]。以上研究結(jié)果為馬鬃蛇的開發(fā)提供了科學(xué)依據(jù),因此本研究建立動脈性ED大鼠模型,觀察馬鬃蛇石油醚提取物對大鼠的勃起功能和生育功能的影響。

目前動物實(shí)驗(yàn)研究中,檢測陰莖勃起功能的方法常用APO實(shí)驗(yàn)和ICP實(shí)驗(yàn)[10]。本研究結(jié)果顯示,模型組大鼠陰莖勃起次數(shù)和ICP值均降低,經(jīng)過不同劑量CVPEE干預(yù)后大鼠陰莖勃起次數(shù)和ICP值明顯增加,提示CVPEE可改善勃起功能。睪丸精曲小管上皮可產(chǎn)生大量精子,且其質(zhì)量好壞嚴(yán)重影響著睪丸質(zhì)量[11]。附睪可對精子進(jìn)行暫時性的儲存,可分泌大量的附睪液,進(jìn)而對精子成熟有促進(jìn)作用。因此,臨床常用睪丸、附睪的重量反應(yīng)生精功能,檢測精液質(zhì)量能直接反應(yīng)大鼠的生育能力[12]。本研究結(jié)果顯示,馬鬃蛇石油醚提取物能改善大鼠的生育能力。劉雪梅等[13]研究證實(shí),馬鬃蛇可通過增加睪丸質(zhì)量改善動脈性比起功能大鼠性功能障礙。

陰莖海綿體是勃起的重要組織結(jié)構(gòu),陰莖海綿體細(xì)胞凋亡和勃起功能障礙密切相關(guān)[14]。研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞凋亡可維持生物體的正常發(fā)育,調(diào)控機(jī)體的內(nèi)在平衡,且能有效去除機(jī)體內(nèi)的癌細(xì)胞和受損細(xì)胞等[15]。生物的凋亡過程涉及多種相關(guān)基因共同作用。Bcl-2和Bax是最早被認(rèn)識的凋亡調(diào)控基因,二者所編碼的Bcl-2和Bax蛋白分別有抑制和促進(jìn)凋亡作用,二者的平衡介導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。Bcl-2家族是調(diào)控凋亡的核心因子,在不同的刺激下可調(diào)控抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax等。Wang等[16]研究證實(shí),糖尿病性勃起功能障礙大鼠陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞大量凋亡,通過抑制細(xì)胞中Bax和Caspase-1表達(dá)減少細(xì)胞凋亡。Caspase家族中位于凋亡通路下游的效應(yīng)酶Caspas-1蛋白起著關(guān)鍵作用,被認(rèn)為是凋亡最可靠的指標(biāo)。薛艷艷等[17]人研究證實(shí),ED大鼠中caspase-1表達(dá)增加,其介導(dǎo)ED的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果顯示,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,馬鬃蛇石油醚提取物能減少陰莖海綿體細(xì)胞凋亡,調(diào)控Bax和Bcl-2蛋白平衡,抑制Caspase-1蛋白。

綜上所述,馬鬃蛇石油醚提取物可改善動脈性勃起功能障礙大鼠勃起功能和生育功能,可能和抑制陰莖海綿體細(xì)胞凋亡和Caspase-1蛋白表達(dá)有關(guān)。