冬凌草甲素對(duì)膿毒癥大鼠腦損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究

姜亞威,樓 屹,徐 英,陳霽虹

(浙江省寧波市中醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科·浙江 寧波 315010)

膿毒癥是感染引起的宿主對(duì)炎癥反應(yīng)失控導(dǎo)致的全身多器官功能損傷性疾病,為ICU常見危重癥。腦是膿毒癥較易受累的器官,70%的膿毒癥患者可表現(xiàn)為從譫妄到昏迷不同癥狀的腦功能損傷稱為膿毒癥相關(guān)性腦病(Sepsis-associated encephalopathy,SAE),合并SAE可使膿毒癥病死率升高20%,且幸存者多遺留長(zhǎng)期的認(rèn)知功能障礙[1-2]。目前SAE缺乏特效療法,現(xiàn)多以抗感染治療為主,但對(duì)腦損傷效果較差,這是造成膿毒癥患者預(yù)后不佳的重要原因。腦內(nèi)炎癥反應(yīng)是SAE發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié),Toll樣受體4(Toll-like receptor-4,TLR-4)/核因子-κB(Nuclear factor-κB,NF-κB)信號(hào)通路參與調(diào)控炎癥反應(yīng),在膿毒癥腦損傷病理機(jī)制中起著重要作用[3]。

冬凌草甲素(oridonin, Ori)是提取自藥用植物冬凌草的二萜類化合物,具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤和神經(jīng)調(diào)節(jié)等多種藥理學(xué)特性[4],是近年來國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究熱點(diǎn)中的中藥單體。Ori可抑制膿毒癥炎癥反應(yīng),減輕肺等重要靶器官的炎癥損傷[5]。TLR-4/NF-κB信號(hào)通路是Ori發(fā)揮抗炎和肺保護(hù)等藥理作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)[6]。然而,Ori及其介導(dǎo)的TLR-4/NF-κB信號(hào)通路能否影響SAE病理過程,對(duì)膿毒癥腦損傷起到保護(hù)作用尚不清楚。本研究建立膿毒癥大鼠模型,觀察Ori在膿毒癥腦損傷病理過程中的作用并探討其可能的分子機(jī)制,為SAE治療提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 SPF級(jí)健康雄性SD大鼠,鼠齡7～8周,90只,體質(zhì)量(200±20)g,由寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號(hào)SYXK(浙)2019-0005。飼養(yǎng)環(huán)境:20～25 ℃,50%相對(duì)濕度,12 h明暗周期環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的各種處理均遵照中華人民共和國(guó)科技部2006年頒布的有關(guān)動(dòng)物的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》中相關(guān)規(guī)定。將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組(Sham)、模型組(Model)、Ori低(Ori-L,10 mg/kg)、中(Ori-M,20 mg/kg)、高(Ori-H,40 mg/kg)劑量組及TAK-242組(TLR-4抑制劑),每組15只。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物和試劑 冬凌草甲素(純度≥98%標(biāo)準(zhǔn)品):北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院;TAK-242:美國(guó)MCE公司。Evans藍(lán)試劑:北京索萊寶科技有限公司;HE染色試劑盒、RIPA裂解液、BCA試劑盒:上海碧云天生物技術(shù)有限公司;腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)ELISA試劑盒:上海橋社生物科技有限公司;兔抗鼠Iba-1(小膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物)、TLR-4、MyD88、NF-κB p65、β-actin抗體和HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗:美國(guó)Abcam公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 電子熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡:日本奧林巴斯公司;Thermo離心機(jī)、Thermo切片機(jī):美國(guó)賽默飛世爾公司;Spectra Max190酶標(biāo)儀:MD,美國(guó)。

1.4 大鼠膿毒癥模型建立及給藥處理

采用盲腸結(jié)扎穿孔法(CLP)建立膿毒癥模型[7]。具體操作:大鼠術(shù)前8 h禁食禁水,稱重后經(jīng)2%戊巴比妥鈉(4 mL/kg)腹腔麻醉,腹部皮膚去毛消毒,超凈工作臺(tái)內(nèi)于大鼠腹部前正中線作長(zhǎng)約2 cm切口,游離盲腸和腸系膜,以5號(hào)絲線環(huán)形結(jié)扎盲腸根部,結(jié)扎完畢仔細(xì)檢查,保持腸道通暢,在距盲腸末端約1 cm處用22號(hào)針頭貫通穿刺2次,自穿刺孔擠出少許糞便,拭凈后還納盲腸,逐層縫合關(guān)腹。術(shù)后皮下注射生理鹽水20 mL/kg液體復(fù)蘇。Sham組既不結(jié)扎也不穿孔,余同CLP大鼠。術(shù)畢各組大鼠分籠飼養(yǎng),密切觀察6 h。以CLP術(shù)后6 h內(nèi)出現(xiàn)寒戰(zhàn)豎毛、蜷縮懶動(dòng)、眼角分泌物增多、保護(hù)性反射減弱等為大鼠膿毒癥造模成功標(biāo)準(zhǔn)。若造模失敗,則以備用大鼠補(bǔ)充造模。

按10、20、40 mg/kg稱取Ori并溶解于1 mL生理鹽水中配制成Ori低、中、高3 個(gè)劑量予Ori各劑量組大鼠腹腔注射[6],TAK-242組予TAK-2425 mg/kg腹腔注射[3],均在造模成功后1、24、48 h給藥。Sham組和Model組在相同時(shí)間點(diǎn)予等體積生理鹽水腹腔注射給藥。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法 觀察大鼠一般情況及造模后72 h病死率,存活大鼠評(píng)估神經(jīng)功能;隨后各組取6只存活大鼠斷頭處死,無菌操作下取腦組織,生理鹽水沖洗后用于病理形態(tài)學(xué)、血腦屏障通透性、腦含水量、小膠質(zhì)細(xì)胞活化、腦內(nèi)炎癥因子及Western blot檢測(cè),部分凍存于液氮備用。

1.5.1 神經(jīng)功能評(píng)估 采用耳廓反射(輕觸外耳道誘發(fā)搖頭運(yùn)動(dòng))、角膜反射(棉簽輕觸角膜誘發(fā)眨眼或搖頭運(yùn)動(dòng))、翻正反射(仰臥位放置觀察其是否能翻身成俯臥位)、甩尾反射和逃避反射(短暫刺激尾部引起躲避或轉(zhuǎn)頭逃避傷害刺激的反應(yīng))進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分[7]。無反射(>30 s)為0分,反射減弱(>10 s但<30 s)為1分,正常反射為2分,滿分10分。

1.5.2 腦組織病理學(xué)變化 取部分腦組織,4%多聚甲醛固定,常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片,行蘇木精-伊紅(HE)染色,光鏡下觀察腦組織病理學(xué)改變。

1.5.3 血腦屏障通透性檢測(cè) 取材前1 h經(jīng)尾靜脈注射Evans藍(lán)試劑(2%,5 mL/kg),循環(huán)1 h處死大鼠,經(jīng)PBS灌注后取左側(cè)大腦稱重后浸于甲酰胺中,60 ℃孵育24 h收集浸出液,使用酶標(biāo)儀在620 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(OD)檢測(cè)腦內(nèi)Evans藍(lán)滲出量評(píng)估血腦屏障通透性。

1.5.4 腦含水量檢測(cè) 解剖分離所取大腦稱重得濕重,隨后置于100 ℃烤箱中烘烤24 h直至重量不再變化稱重得干重。腦含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.5.5 小膠質(zhì)細(xì)胞免疫組化染色 取制備的腦組織切片進(jìn)行Iba-1免疫組化染色。切片脫蠟,3%過氧化氫滅活,枸櫞酸鹽熱修復(fù)后加入Iba-1抗體(1∶500稀釋)4 ℃過夜,滴加HRP標(biāo)記的二抗(1∶1 000稀釋)3 ℃孵育,加入DAB顯色液至棕色、蘇木素復(fù)染、梯度酒精脫水、中性樹膠封片,光鏡下觀察活化小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)。

1.5.6 腦組織炎癥因子檢測(cè) 取腦組織約0.1 g制備勻漿,4 ℃下離心后取上清,采用ELISA法檢測(cè)TNF-α、IL-1β和IL-6水平,操作按試劑盒說明書進(jìn)行。酶標(biāo)儀于450 nm處測(cè)定吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算TNF-α、IL-1β和IL-6水平。

1.5.7 Western blot檢測(cè)TLR-4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達(dá) 取腦組織約0.1 g,加入RIPA裂解液冰上裂解,4 ℃離心后取上清液,BCA法進(jìn)行蛋白定量,按30 μg總蛋白進(jìn)行上樣,經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)印到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,5%脫脂奶粉封閉2 h,加入目的蛋白一抗∶TLR-4抗體(1∶500稀釋)、MyD88抗體(1∶500稀釋)、NF-κB p65抗體(1∶500稀釋)4 ℃孵育過夜,TBST洗膜后加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶1 000稀釋)孵育2 h。ECL液發(fā)光顯影,以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)作為內(nèi)參,圖像分析軟件測(cè)定各蛋白條帶灰度值,以目的蛋白與內(nèi)參的灰度值比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠CLP后72 h內(nèi)病死率 Model組死亡7只(46.7%),TAK-242組和Ori-H組各死亡2只(13.3%),較Model組明顯降低(P<0.05),Ori-L組和Ori-M組分別死亡5只(33.3%)和4只(26.7%),也較Model組降低,但差異并不顯著(P>0.05)。

2.2 各組大鼠行為學(xué)變化及神經(jīng)功能評(píng)估結(jié)果 各組大鼠術(shù)后1 h逐漸蘇醒,除Sham組外,其余各組均出現(xiàn)豎毛、懶動(dòng)、眼角分泌物增多、反射減弱等表現(xiàn),并從造模后24 h開始出現(xiàn)死亡,解剖可見腹腔內(nèi)血性滲液,盲腸腫脹粘連,嚴(yán)重者發(fā)生腸壞死,符合膿毒癥模型標(biāo)準(zhǔn)。

與Sham組[(9.62±0.41)]分比較,Model組[(3.72±0.28)分]造模后72 h神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分明顯降低(P<0.05);與Model組比較,Ori-L組[(4.48±0.38)分]、Ori-M組[(6.12±0.71)分]、Ori-H組[(7.72±1.48)分]和TAK-242組[(7.42±1.39)分]均呈不同程度升高,且Ori各組評(píng)分呈劑量遞增效應(yīng),其中Ori-M 組、Ori-H組和TAK-242組升高明顯(P<0.05)。

2.3 各組大鼠腦組織病理學(xué)變化 Sham組腦組織結(jié)構(gòu)清晰,神經(jīng)元形態(tài)正常;Model組可見神經(jīng)元固縮、紊亂,基本結(jié)構(gòu)破壞,間隙擴(kuò)大,出現(xiàn)空泡;不同劑量Ori組和TAK-242組腦組織病理學(xué)有不同程度改善,以O(shè)ri-H組和TAK-242組最明顯。見圖1。

圖1 各組大鼠腦組織病理學(xué)改變(HE,×200)

2.4 各組大鼠血腦屏障通透性和腦含水量比較 見表1。

表1 各組大鼠血腦屏障通透性和腦含水量比較

2.5 各組大鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞活化數(shù)量和形態(tài)比較 造模后72 h,Model組小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量較Sham組明顯增加(P<0.05),呈明顯激活狀態(tài),表現(xiàn)為胞體增大、突起回縮。而Ori-L組、Ori-M組、Ori-H組和TAK-242組則較Model組小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少,且Ori各組呈劑量相關(guān)性,激活狀態(tài)不明顯(P<0.05)。見圖2,表2。

圖2 各組大鼠腦組織Iba-1免疫組化染色(×200)

表2 各組大鼠腦組織Iba-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較個(gè)/mm2)

2.6 各組大鼠腦組織炎性因子水平比較 見表3。

表3 各組大鼠腦組織TNF-α、IL-1β和IL-6水平比較

2.7 各組大鼠腦組織TLR-4/NF-κB信號(hào)通路蛋白表達(dá)的比較 見圖3,表4。

圖3 各組腦組織TLR-4、MyD88和NF-κB p65蛋白表達(dá)的Western blot檢測(cè)結(jié)果

表4 各組大鼠腦組織TLR-4、MyD88和NF-κB p65蛋白表達(dá)的比較

4 討論

膿毒癥相關(guān)性腦病(SAE)發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,目前認(rèn)為,腦內(nèi)炎癥反應(yīng)在膿毒癥腦損傷和SAE發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用。膿毒癥時(shí),組織器官感染部位將病理刺激信號(hào)通過迷走神經(jīng)及位于神經(jīng)內(nèi)分泌和自主神經(jīng)核附近的室周器兩條感知途徑穿過血腦屏障傳遞到大腦,腦內(nèi)炎癥因子大量釋放,引起腦水腫、血腦屏障破壞、神經(jīng)元變性凋亡、神經(jīng)遞質(zhì)傳遞障礙等一系列病理改變,最終出現(xiàn)各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀,成為SAE[1,8-9]。本研究采用CLP法建立膿毒癥模型后,Model組除表現(xiàn)為各種膿毒癥癥狀外,并出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙及腦組織病理學(xué)改變,血腦屏障通透性和腦含水量升高,同時(shí)腦內(nèi)TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥因子水平升高;說明SAE建模成功,腦內(nèi)炎癥反應(yīng)引起嚴(yán)重腦損傷。因此,選擇針對(duì)性治療措施,降低腦內(nèi)炎癥反應(yīng),對(duì)減輕膿毒癥腦損傷,改善膿毒癥預(yù)后具有重要意義。

Ori是一種天然的二萜類化合物,既往對(duì)Ori研究主要聚焦于抗腫瘤方面[10]。近年來隨著對(duì)其藥理學(xué)研究的拓展,Ori的強(qiáng)效抗炎且易透過血腦屏障的特性成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的新熱點(diǎn)。Ori能抑制膿毒癥大鼠的炎癥反應(yīng),減輕肝、肺等重要器官炎癥損傷,降低病死率[5]。因此,理論上來說Ori的藥理學(xué)特性對(duì)治療SAE具有一定潛力。本研究重點(diǎn)觀察了Ori對(duì)膿毒癥腦損傷的影響,結(jié)果顯示Ori各組大鼠腦組織病理學(xué)變化呈現(xiàn)不同程度的改善,血腦屏障破壞和腦水腫亦減輕,更為重要的是,Ori能緩解膿毒癥引起的神經(jīng)功能障礙,降低病死率,且療效呈劑量遞增效應(yīng)。說明Ori對(duì)膿毒癥腦損傷具有保護(hù)作用,可用于SAE治療,進(jìn)而改善預(yù)后。

小膠質(zhì)細(xì)胞作為腦內(nèi)的先天免疫細(xì)胞,能感知各種病理刺激并作出快速免疫應(yīng)答,大量活化的小膠質(zhì)細(xì)胞在清除抗原的同時(shí),釋放大量炎癥因子引起腦損傷[11]。已有多項(xiàng)研究表明,小膠質(zhì)細(xì)胞參與調(diào)控腦內(nèi)炎癥反應(yīng),與膿毒癥腦損傷的病理過程密切相關(guān)[12-13]。而Ori可通過降低小膠質(zhì)細(xì)胞活化介導(dǎo)腦內(nèi)炎癥反應(yīng),減輕β-淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的阿爾茨海默病大鼠腦損傷[14]。本研究中,Model組小膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)明顯的數(shù)量和形態(tài)改變,伴有炎癥因子水平升高,再次證實(shí)膿毒癥時(shí)存在小膠質(zhì)細(xì)胞活化介導(dǎo)的腦內(nèi)炎癥反應(yīng)。而Ori各組小膠質(zhì)細(xì)胞改變不明顯,且炎癥因子水平均有不同程度降低;說明Ori可呈劑量依賴性降低小膠質(zhì)細(xì)胞活化介導(dǎo)的腦內(nèi)炎癥反應(yīng),從而減輕膿毒癥腦損傷。

TLR-4作為一種跨膜信號(hào)分子,在腦內(nèi)主要在小膠質(zhì)細(xì)胞上表達(dá),是小膠質(zhì)細(xì)胞活化并行使免疫炎癥反應(yīng)的重要識(shí)別受體。TLR-4可特異性識(shí)別抗原,通過細(xì)胞內(nèi)接頭蛋白MyD88將抗原刺激信號(hào)轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi),進(jìn)一步使下游NF-κB發(fā)生核轉(zhuǎn)錄,促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞活化和一系列炎癥因子的釋放[15-16]。本研究中,Model組腦組織TLR-4、MyD88和NF-κB p65蛋白表達(dá)量顯著增加,說明TLR-4/NF-κB信號(hào)通路被激活,該信號(hào)通路參與炎癥反應(yīng),膿毒癥腦損傷與TLR-4/NF-κB信號(hào)通路調(diào)控的腦內(nèi)炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[3]。Ori對(duì)TLR-4/NF-kB信號(hào)通路中上游信號(hào)分子有明顯抑制作用,Ori可通過抑制該信號(hào)通路減輕高糖誘導(dǎo)的腎臟炎癥損傷[17],亦可減輕膿毒癥誘導(dǎo)的急性肺損傷炎癥反應(yīng),起到肺保護(hù)作用[6]。本研究中,Ori各組可呈劑量依賴性降低上述蛋白表達(dá)量,說明TLR-4/NF-κB信號(hào)通路被抑制,特別是Ori-H組抑制作用與TAK-242組(TLR-4抑制劑)類似,且兩組腦內(nèi)炎癥因子水平及腦損傷情況亦相似,進(jìn)一步說明Ori主要通過抑制TLR-4/NF-κB信號(hào)通路,減輕腦內(nèi)炎癥反應(yīng),對(duì)膿毒癥腦損傷起到保護(hù)作用,且以O(shè)ri-H組效果最佳。

綜上,Ori可通過抑制TLR-4/NF-κB信號(hào)通路,減輕腦內(nèi)炎癥反應(yīng),對(duì)膿毒癥大鼠腦損傷起到保護(hù)作用,且療效呈劑量遞增效應(yīng),并改善膿毒癥大鼠預(yù)后,為臨床SAE治療提供新的思路,具有一定臨床應(yīng)用價(jià)值。但關(guān)于Ori臨床用藥安全劑量、作用TLR-4/NF-κB信號(hào)通路的直接靶點(diǎn)及是否涉及其他信號(hào)通路參與有待進(jìn)一步研究。