參芪地黃湯含藥血清對脂多糖誘導(dǎo)人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究

徐晨希,嚴(yán)浩軍,劉芙蓉,張樹明

(黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院·黑龍江 哈爾濱 150036)

參芪地黃湯由六味地黃丸化裁(去澤瀉加人參、黃芪、姜棗)而來,出自《雜病源流犀燭》,具有益氣養(yǎng)陰、健脾補腎功效,為脾腎雙補代表方。在慢性腎臟疾病的治療中有廣泛應(yīng)用并取得較好的臨床療效[1-2]。研究表明,參芪地黃湯方藥可有效降低慢性腎臟疾病患者的血肌酐、尿素氮、尿白蛋白水平,增加腎小球濾過率[1,3];能夠抑制DKD患者的炎癥反應(yīng),保護(hù)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞[3-4];抗氧化應(yīng)激及防止腎臟纖維化[5];改善糖代謝紊亂[6]。

脂多糖(LPS)是一種內(nèi)毒素,由脂質(zhì)和多糖構(gòu)成,與TLR4炎癥小體結(jié)合后可刺激與炎癥相關(guān)的NF-κB(Nuclear Factor Kappa-B)通路活化,進(jìn)而導(dǎo)致一系列炎癥反應(yīng)。GS-5829是一種新型的BET抑制劑,可抑制NF-κB通路的信號傳導(dǎo),減輕機(jī)體炎癥反應(yīng)[7]。本實驗旨在研究參芪地黃湯含藥血清對LPS誘導(dǎo)的人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及動物 人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞(HRGEC):購于上海艾睿生物科技有限公司。實驗動物:健康SPF級5周齡雄性Wistar大鼠,體質(zhì)量(200±20)g,購于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)部,合格證號:SCXK(黑)2019-001。大鼠于25℃、濕度60% GLP實驗室飼養(yǎng)。

1.2 藥品與試劑 參芪地黃湯(黨參、黃芪、熟地黃、茯苓、丹皮、山茱萸、山藥、生姜、大棗)中藥飲片購于北京同仁堂哈爾濱香坊店;GS-5829:美國Selleck公司,貨號S896101。LPS:北京博奧拓達(dá)科技有限公司,貨號L-2880;CCK-8試劑:上海碧云天生物技術(shù)有限公司,貨號C0039;ANNEXIN V-FITC/PI凋亡試劑盒:北京索萊寶科技有限公司,貨號CA1020;NO檢測試劑盒:上海碧云天生物技術(shù)有限公司,貨號S0021;Human TNF-α ELISA試劑盒:武漢博士德生物工程有限公司,貨號EK0525;DMEM培養(yǎng)基:美國Gibco公司,貨號C11995500BT;胰酶:美國Gibco公司,貨號25200-056;胎牛血清:浙江天杭生物科技股份有限公司,貨號11012-8611。

1.3 主要實驗儀器 M200多功能酶標(biāo)儀:奧地利TECAN公司;FACSCalibur流式細(xì)胞儀:美國BD公司;MYSPIN-12迷你離心機(jī):美國Thermo Fisher Scientific公司;ST-16R型低溫高速離心機(jī):美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.4 大鼠血清制備 參芪地黃湯方藥組成:黨參6 g、黃芪15 g、熟地黃15 g、茯苓9 g、丹皮9 g、山茱萸9 g、山藥15 g、生姜3片、大棗2枚,按照人臨床劑量的5倍量換算為大鼠給藥劑量。方藥提前浸泡半小時,用1 000 mL水煎煮40 min后再加入1 000 mL水煎煮20 min,合并煎煮液并濃縮至含生藥濃度2.34 g/mL。按每次5 mL/kg大鼠灌胃給予參芪地黃湯方濃縮液,3次/日,連續(xù)灌胃7 d?？瞻捉M連續(xù)7 d灌胃等劑量生理鹽水。腹主動脈采血,收集血液至真空采血管內(nèi),處理后取上清,-20 ℃保存。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將HRGEC培養(yǎng)于25 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi),置于含有5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞鋪滿80%～90%時傳代。每10 mL完全培養(yǎng)基包含:1 mL胎牛血清,9 mL DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基,外加1%青霉素-鏈霉素溶液。將細(xì)胞分為5 組:①正常組:用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞;②模型組:用含10 mg/L LPS濃度的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞;③含藥血清組:用含10%參芪地黃湯含藥血清及10 mg/L LPS濃度的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞;④空白血清組:用含10%大鼠空白血清及10 mg/L LPS濃度的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞;⑤陽性對照組:用含10 μmol/L GS-5829及10 mg/L LPS濃度的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。

1.6 觀察指標(biāo)及測定

1.6.1 細(xì)胞增殖測定 選擇處于對數(shù)生長期的HRGEC,在96孔板中接種細(xì)胞懸液,每孔100 μL,3 000個/孔。將96孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h,貼壁后棄去培養(yǎng)基,加入LPS及其與藥物的混合溶液,該混合溶液中LPS的終濃度為10 mg/L;陽對藥GS-5829終濃度為10 μmol/L?？瞻捉M加入等量DMEM培養(yǎng)基,分別培養(yǎng)12、24、48 h。每孔加入CCK-8溶液10 μL,3 h后測定OD值,計算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率=(待測組OD值-調(diào)零孔OD值)/(空白組OD值-調(diào)零孔OD值)×100%

1.6.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 將已經(jīng)培養(yǎng)24 h的各組HRGEC用胰酶處理分別收集,1 000 r/min離心5 min,將各組細(xì)胞制作成1×106個/mL的單細(xì)胞懸液1 mL備用。每管中加入100 μL細(xì)胞懸液,5 μLAnnexinⅤ-FITC,室溫避光,輕輕混勻,10 min后加入5 μL PI,室溫避光孵育5 min,加PBS溶液至500 μL,1 h內(nèi)使用流式儀檢測。

1.6.3 NO含量測定 將細(xì)胞培養(yǎng)于24孔板中,待細(xì)胞貼壁后棄去上清,使用PBS潤洗3遍,加入LPS與藥物的混合溶液培養(yǎng)24 h后取細(xì)胞上清液離心,硝酸還原酶法檢測NO含量,操作均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.6.4 ELISA法測定TNF-α含量 細(xì)胞培養(yǎng)方法同1.6.3,ELISA檢測TNF-α含量,操作均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 不同時間參芪地黃湯含藥血清對HRGEC細(xì)胞增殖的影響 見表1。

表1 不同時間各組HRGEC增殖率比較

2.2 參芪地黃湯含藥血清對HRGEC細(xì)胞凋亡的影響 見圖1,表2。

圖1 各組HRGEC凋亡的流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果

表2 各組HRGEC凋亡率的比較

2.3 參芪地黃湯含藥血清對HRGEC NO、TNF-α含量的影響 見表3。

表3 各組HRGEC NO、TNF-α含量比較

3 討論

在進(jìn)行細(xì)胞增殖及凋亡實驗時,不同的細(xì)胞大小、生長速度不同,因此需考察HRGEC貼壁時間、倍增時間、不同接種數(shù)下的細(xì)胞生長曲線,以此選擇最佳時間及細(xì)胞接種數(shù)。當(dāng)HRGEC培養(yǎng)至12 h時,狀態(tài)良好,但此時處于細(xì)胞生長停滯期內(nèi)(細(xì)胞傳代后有一個16 h左右的停滯期),細(xì)胞密度較小;培養(yǎng)至24 h時,細(xì)胞狀態(tài)良好,此時細(xì)胞處于對數(shù)生長期早中期內(nèi),細(xì)胞密度適中,生長力旺盛,適合此時進(jìn)行實驗;細(xì)胞培養(yǎng)至48 h時,顯微鏡下可見細(xì)胞密度較大,此時進(jìn)行實驗會導(dǎo)致本底值較高,且細(xì)胞易漂浮,重懸后易成團(tuán),提示此時細(xì)胞狀態(tài)變差。從細(xì)胞增殖率結(jié)果來看,隨時間延長,LPS對細(xì)胞的損傷加劇,細(xì)胞增殖率不斷下降,各時間段與空白組均有顯著差異,在24 h時細(xì)胞凋亡率適中,因此選擇24 h即細(xì)胞處于對數(shù)生長早中期時進(jìn)行實驗。

細(xì)胞凋亡在生物體的進(jìn)化、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定以及多個系統(tǒng)的發(fā)育中起著重要的作用。已有研究表明,參芪地黃湯的主要成分黃芪多糖可修復(fù)LPS誘導(dǎo)的內(nèi)皮祖細(xì)胞損傷,減輕LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[8];黨參多糖可以通過抑制線粒體凋亡進(jìn)而抑制體外糖尿病血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[9];山茱萸環(huán)烯醚萜苷可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性,抑制因高糖引起的細(xì)胞萎縮和凋亡[10]。以上研究均提示參芪地黃湯含藥血清可能發(fā)揮藥效的主要化學(xué)成分,同時也印證了本實驗的結(jié)果:參芪地黃湯可以減輕細(xì)胞凋亡。

NO是人體關(guān)鍵信號分子,是以精氨酸為原料通過一氧化氮合酶催化而生成,分為內(nèi)皮細(xì)胞型一氧化氮合酶(eNOS)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)和神經(jīng)元型一氧化氮合酶(nNOS)[11]。有研究表明,LPS可以使人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中NO水平升高[12],該結(jié)果與本實驗LPS可使HRGEC NO釋放量增加的結(jié)果一致;參芪地黃湯含藥血清可降低NO含量。

TNF-α是炎癥反應(yīng)過程中出現(xiàn)最早、最重要的炎性介質(zhì),能激活中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞,使血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加。黃芪甲苷可通過NF-κB/NLRP3信號通路降低人肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞TNF-α含量[13];黨參多糖具可以通過抑制NF-κB信號通路減少炎癥因子TNF-α的釋放[14];山藥蛋白可以減少內(nèi)皮細(xì)胞TNF-α的釋放,改善高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能障礙[15]。本實驗結(jié)果顯示,參芪地黃湯具有減少炎癥因子TNF-α釋放作用。

綜上,參芪地黃湯可減少LPS誘導(dǎo)的HRGEC凋亡,其作用機(jī)制可能與通過維持NO含量穩(wěn)定保護(hù)血管內(nèi)皮及減少TNF-α釋放減輕炎癥反應(yīng)相關(guān)。