健脾寧神顆粒對(duì)抽動(dòng)障礙小鼠腦內(nèi)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的影響

尤士軍,梁 雪,李會(huì)影,劉建璇,莊玲伶,仇志鍇,于映霞

(吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院·吉林 長(zhǎng)春 130021)

抽動(dòng)障礙(tic disorders,TD)是兒童常見(jiàn)疾病,有學(xué)者認(rèn)為單胺類遞質(zhì)失衡可導(dǎo)致抽動(dòng)障礙的發(fā)生,也有學(xué)者認(rèn)為腦內(nèi)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)異常與抽動(dòng)障礙的發(fā)生有關(guān)[1]。隨著中藥在抽動(dòng)障礙治療上的不斷創(chuàng)新,本院基于“以靜制動(dòng)”法研發(fā)的治療兒童抽動(dòng)障礙的醫(yī)院制劑“健脾寧神顆?！迸R床應(yīng)用于TD的治療有效率達(dá)80%以上[2]。本研究旨在探討健脾寧神顆粒對(duì)抽動(dòng)障礙小鼠腦內(nèi)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的影響,旨在為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ICR 小鼠,雄性,SPF級(jí),體質(zhì)量 (18±2)g,由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司提供,許可證號(hào):SCXK(遼)2020-0001。動(dòng)物飼養(yǎng)于吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院動(dòng)物室(SPF級(jí)),實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(吉)2022-0004。

1.2 藥物與試劑 健脾寧神顆粒,處方包含:石決明、石菖蒲、郁金、白芍、甘草、半夏、伸筋草、太子參、茯苓等藥材,由吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院制劑室提供,3.43 g生藥/g。鹽酸硫必利:江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn),國(guó)藥準(zhǔn)字 H32025477。亞氨基二丙腈(IDPN)及谷氨酸、天門冬氨酸、γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品:均購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司。

1.3 主要儀器 T1600 電子天平:美國(guó)雙杰兄弟集團(tuán)有限公司;HC-3618R高速冷凍離心機(jī):安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;LC-2010A-HT高效液相色譜儀:日本島津。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物造模 取健康ICR小鼠60只,適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后,開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。正常對(duì)照組(10只) 小鼠腹腔注射生理鹽水,其余各組小鼠均腹腔注射亞氨基二丙腈(IDPN)造模[3]。將IDPN溶于生理鹽水配制成為濃度為 22 g/L的溶液,每只小鼠每天按 350 mg/kg的劑量腹腔注射 IDPN溶液,連續(xù)注射7 d。造模后,將小鼠單獨(dú)放置于觀察籠內(nèi),室內(nèi)環(huán)境保持安靜,避光,并排除其他干擾,適應(yīng)環(huán)境 5 min 后,開(kāi)始記錄小鼠的行為學(xué)變化。小鼠出現(xiàn)不同程度的刻板行為和運(yùn)動(dòng)行為,尤其是在安靜狀態(tài)下,行為學(xué)改變明顯,安靜時(shí)間明顯縮短,提示抽動(dòng)障礙小鼠復(fù)制成功。

2.2 動(dòng)物分組及給藥 將50只造模成功小鼠,隨機(jī)分為5組,即模型對(duì)照組,健脾寧神顆粒高、中、低劑量組和鹽酸硫必利組,每組10只。正常對(duì)照組和模型對(duì)照組給予等體積生理鹽水,健脾寧神顆粒高、中、低劑量組給藥劑量分別為45.56、22.78、11.39 g/kg,鹽酸硫必利組給藥劑量為25 mg/kg,各組小鼠均為口服灌胃給藥,每日給藥1次,連續(xù)給藥4周。

2.3 觀察指標(biāo)及測(cè)定 給藥結(jié)束后24 h,快速脫臼處死小鼠,取腦,-80 ℃冰箱凍存腦組織。檢測(cè)指標(biāo)前,取腦組織置于離心管中,加入 0.4 mmol/L高氯酸3 mL,勻漿 7 min,置于離心機(jī)離心(10 000 r/min),離心10 min,取上清備用。衍生化反應(yīng):取250 μL上清液置于10 mL離心管中,加入曲唑酮40 μL,KHCO3100 μL,丹酰氯200 μL, 80 ℃水浴反應(yīng) 30 min．取出后再加入醋酸丙酮100 μL,冷卻后過(guò) 0.23 μm的濾膜裝樣,進(jìn)樣量為20 μL,高效液相色譜儀測(cè)定腦組織 GLU、ASP、GABA 含量。

3 結(jié)果 見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠腦組織 GLU、ASP、GABA 含量比較

4 討論

近年來(lái),抽動(dòng)障礙(TD)在我國(guó)青少年中的發(fā)病率日益上升,因此,充分認(rèn)識(shí) TD 的發(fā)病機(jī)制及探討中藥治療抽動(dòng)障礙的作用機(jī)制對(duì)于控制抽動(dòng)障礙的發(fā)生意義重大[3]。TD的發(fā)病與多種因素有關(guān),有學(xué)者認(rèn)為單胺類遞質(zhì)失衡可導(dǎo)致抽動(dòng)障礙的發(fā)生,也有學(xué)者認(rèn)為,氨基酸是影響兒童生長(zhǎng)、發(fā)育、成熟的重要物質(zhì),其腦內(nèi)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)異常與抽動(dòng)障礙的發(fā)生有關(guān)。氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)異常包括興奮性神經(jīng)遞質(zhì)及抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。其中,GLU和 ASP是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì),GABA是主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。有研究顯示腦組織中興奮性氨基酸和抑制性氨基酸含量的失衡可能是引起抽動(dòng)障礙的原因之一[4-5]。

傳統(tǒng)中醫(yī)將TD歸屬于“筋惕”“驚風(fēng)”“肉瞤”等范疇,認(rèn)為該病的發(fā)生與心火、肝木、脾土、腎水、肺金等臟腑五行失衡有關(guān)[6-7]。本院兒科根據(jù)治療(脾虛肝亢型)抽動(dòng)障礙患兒的臨床經(jīng)驗(yàn),總結(jié)出健脾寧神湯經(jīng)驗(yàn)方,主要包括石決明、石菖蒲、郁金、白芍等藥味,具有以靜制動(dòng)、健脾息風(fēng)之功效。

本研究通過(guò)腹腔注射 IDPN溶液,復(fù)制小鼠的抽動(dòng)障礙模型,7 d后,模型小鼠出現(xiàn)不同程度的刻板行為和運(yùn)動(dòng)行為,尤其是在安靜狀態(tài)下,行為學(xué)改變明顯,安靜時(shí)間明顯縮短,提示抽動(dòng)障礙小鼠復(fù)制成功。連續(xù)給藥4周發(fā)現(xiàn),健脾寧神顆粒高、中、低劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組小鼠腦組織中 GLU、ASP含量與模型對(duì)照組比較明顯降低,GABA 含量明顯升高,差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。提示:健脾寧神顆粒治療抽動(dòng)障礙可能的機(jī)制之一是維持興奮性氨基酸類神經(jīng)介質(zhì)和抑制性氨基酸類神經(jīng)介質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡。