正交試驗(yàn)優(yōu)選十棗湯的提取工藝*

洪 博，劉 軍，林 宇，劉哲丞，劉榮宏，李文靜

（齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161000）

肝硬化腹腔積液俗稱肝腹水，是由于肝細(xì)胞變性、壞死、再生，促使纖維組織增生和瘢痕收縮，致使肝臟質(zhì)地變硬形成肝硬化，引起門(mén)靜脈高壓、肝功能損害，導(dǎo)致腹水生成。約67.3%的住院肝硬化患者伴有肝腹水，其5年病死率高達(dá)44%［1-2］。目前，肝腹水的治療主要為利尿、低鈉、補(bǔ)充白蛋白等，但存在電解質(zhì)紊亂、誘發(fā)肝性腦病、頑固性腹水等問(wèn)題［3］。中醫(yī)中藥治療肝腹水具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，多從肝脾腎論治，注重調(diào)節(jié)與恢復(fù)氣血水的功能［4-5］。十棗湯始載于東漢張仲景的《傷寒雜病論》，為瀉下劑，具有攻逐水飲之功效［6-7］，主治懸飲，咳唾胸脅引痛，臨床常用于治療滲出性腦膜炎、結(jié)核性胸膜炎、肝硬化、慢性腎炎所致的胸腔積液、腹水或全身水腫，以及晚期血吸蟲(chóng)病所致腹水等屬水飲內(nèi)停里實(shí)證者［8］。由芫花、甘遂、大戟、大棗組方，為峻下逐水之藥，以大戟二烯醇為代表的四環(huán)三萜類化合物為其主要特征性活性成分，具有抗肝腹水、抗炎、降血壓等作用［9］。方中芫花辛溫有毒、善消胸脅之水［10-11］，甘遂苦寒有毒、善行經(jīng)隧水濕［12-13］，大戟苦寒有毒、善瀉六府之水［14-15］，共為君藥；大棗補(bǔ)中益氣、扶正，養(yǎng)心安神，能緩和多種猛烈中藥的毒性［16］，為佐使藥。本研究中以大戟二烯醇含量和干膏得率的綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)對(duì)十棗湯提取工藝中的加水量、提取時(shí)間、提取次數(shù)進(jìn)行考察，優(yōu)選十棗湯的提取工藝?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

SHIMADZU LC-30AD 型超高效液相色譜儀（日本島津公司）；ME155DU 型精密天平（瑞士梅特勒-托利多公司，精度為0.01 mg）；SCT型數(shù)顯攪拌電熱套（菏澤市精科儀器有限公司）。

1.2 試藥

大戟（批號(hào)為20210324），芫花（批號(hào)為20210427），甘遂（批號(hào)為20210612），大棗（批號(hào)為20210728），均購(gòu)自齊齊哈爾市鑫金龍中藥房（景新街店），經(jīng)齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院郭麗娜教授鑒定分別為大戟的干燥根、芫花的干燥花蕾、甘遂的干燥塊根和大棗的成熟果實(shí)，均符合2020年版《中國(guó)藥典（一部）》中相關(guān)規(guī)定；大戟二烯醇對(duì)照品（信陽(yáng)市中檢計(jì)量生物科技有限公司，批號(hào)為D06711809002，含量為99.0%）；十棗湯（實(shí)驗(yàn)室自制，批 號(hào) 分 別 為20220101，20220102，20220103，20220104，20220105，20220106，20220107，20220108，20220109，20220110）；甲醇、乙腈（色譜純，美國(guó)天地有限公司）；蒸餾水（屈臣氏集團(tuán)）；甲酸（色譜純，北京迪馬科技有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 大戟二烯醇含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Waters T3 C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%甲酸水溶液（90∶10，V/V）；流速：0.3 mL/ min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。供試品溶液色譜中，大戟二烯醇色譜峰與最近組分的分離度大于1.5，理論板數(shù)按大戟二烯醇峰計(jì)應(yīng)不低于4 500，拖尾因子0.95～1.05。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.EuphadienolA.Reference solution B.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

2.1.2 溶液制備

取大戟二烯醇對(duì)照品8.02 mg，精密稱定，加甲醇溶解，定容于10 mL 容量瓶中，即得對(duì)照品溶液。取芫花、甘遂、大戟、大棗各3.00 g，精密稱定，加100 mL 蒸餾水冷凝回流煎煮30 min，去渣，0.22 μm 微孔濾膜濾過(guò)，即得十棗湯水提液，作為供試品溶液。

2.1.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密量取對(duì)照品溶液適量，加甲醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為6.25，12.5，25，50，100，200，400 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，吸取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液各10 μL，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以大戟二烯醇質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=4 102.2X-7 636.5（r=0.999 6，n= 7）。結(jié)果表明，大戟二烯醇質(zhì)量濃度在6.25～400 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

檢測(cè)限與定量限確定：選擇線性關(guān)系考察項(xiàng)下最小質(zhì)量濃度的樣品稀釋10 倍為方法的定量限，結(jié)果為0.625 μg/ mL；稀釋3 倍為方法的檢測(cè)限，結(jié)果為0.208 μg/mL。

精密度試驗(yàn)：分別精密吸取質(zhì)量濃度為6.25，25，100 μg/mL 的對(duì)照品溶液各10 μL，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄峰面積。結(jié)果低、中、高質(zhì)量濃度大戟二烯醇色譜峰面積的RSD分別為1.12%，0.70%，1.33%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為20220110）樣品適量，共6 份，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果大戟二烯醇含量的RSD為1.29%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：分別取芫花、甘遂、大戟、大棗各3.00 g，精密稱定，按2.1.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，12，24 h 時(shí)按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果峰面積的RSD為1.46%（n= 7），表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的供試品溶液9 份，分為低、中、高3 組，各3 份，分別加入相當(dāng)于樣品中大戟二烯醇含量50%，100%，150%的對(duì)照品溶液，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果平均加樣回收率為100.11%，RSD為1.84%（n=9）。

2.1.4 含量測(cè)定

分別取芫花、甘遂、大戟、大棗各3.00 g，精密稱定，平行3 份，按2.1.2 項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液和對(duì)照品溶液，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算含量。結(jié)果3批樣品中大戟二烯醇的含量分別為0.95，0.98，1.04 mg/g。

2.2 干膏得率測(cè)定

精密量取供試品溶液10 mL，置已干燥至恒重的潔凈蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105 ℃烘箱中干燥4 h 后取出，放入干燥器冷卻，稱定質(zhì)量，計(jì)算干膏得率。干膏得率（%）=干膏質(zhì)量/藥材質(zhì)量×100%。

2.3 單因素試驗(yàn)

查閱文獻(xiàn)［17-18］并結(jié)合預(yù)試驗(yàn)，以提取時(shí)間（因素A）、加水量（因素B）和提取次數(shù)（因素C）為影響因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，分別考察上述3種因素對(duì)大戟二烯醇含量和干膏得率綜合評(píng)分的影響。綜合評(píng)分=（Xi/Xmax×0.8+Yi/Ymax×0.2）×100［17］。其中，Xi為當(dāng)次大戟二烯醇含量，Xmax為大戟二烯醇含量最大值，Yi為當(dāng)次干膏得率，Ymax為干膏得率最大值。詳見(jiàn)表1。

表1 單因素變化條件Tab.1 Conditions of the single factor test

提取時(shí)間［17］：當(dāng)提取時(shí)間從0.5 h升至1.5 h時(shí)，綜合評(píng)分逐漸升高；超過(guò)1.5 h后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，綜合評(píng)分逐漸下降（圖2 A）。故選擇1.0，1.5，2.0 h進(jìn)行考察。

加水量：當(dāng)加水量從8 倍升至12 倍時(shí)，綜合評(píng)分逐漸升高；升至16 倍時(shí)，綜合評(píng)分下降（圖2 B）。故選擇10，12，14倍進(jìn)行考察。

圖2 單因素試驗(yàn)結(jié)果A.Extraction time B.Water addition C.Extraction timesFig.2 Results of the single factor test

提取次數(shù)：提取2次時(shí)綜合評(píng)分最高（圖2 C），但考慮提取時(shí)間和溶劑用量，選擇1，2，3次進(jìn)行考察。

2.4 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用L9（34）正交試驗(yàn)進(jìn)行考察，因素與水平見(jiàn)表2。以大戟二烯醇含量及干膏得率的綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)十棗湯的提取工藝進(jìn)行分析。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表3。由表4可知，3個(gè)因素對(duì)提取工藝的影響大小依次為C ＞A ＞B；由表3 可知，最佳提取工藝為C2A2B1。方差分析結(jié)果表明，因素A 和因素C 對(duì)結(jié)果均有顯著影響（P＜0.05），因素B 對(duì)結(jié)果無(wú)顯著影響（P＞0.05），故優(yōu)選的最佳提取工藝為提取2 次，提取時(shí)間為1.5 h，加入10倍量水。

表2 因素與水平Tab.2 Factors and levels

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.3 Design and results of the orthogonal test

表4 方差分析結(jié)果Tab.4 Results of the ANOVA

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

按處方量稱取芫花、甘遂、大戟、大棗，平行制備5份樣品，按最佳提取工藝提取，測(cè)得大戟二烯醇的平均含量為0.99 mg/ g，RSD為1.24%（n= 5）；平均干膏得率為44.01%，RSD為1.64%（n= 5）。結(jié)果表明，該優(yōu)選工藝合理，提取方法可行。

3 討論

中藥湯劑的質(zhì)量直接影響其臨床療效，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)是目前應(yīng)用廣泛的優(yōu)選提取工藝的方法，尤其是在進(jìn)行工業(yè)大生產(chǎn)前，優(yōu)良的提取工藝可節(jié)省大量的財(cái)力和人力。我國(guó)從20世紀(jì)90年代就引入了煎藥機(jī)，這種大批量生產(chǎn)湯劑的方式不僅節(jié)約時(shí)間，還能保證在最佳提取工藝條件下提取較高含量的有效成分。本研究中優(yōu)選了提取次數(shù)、提取時(shí)間及加水量3個(gè)因素，并對(duì)其結(jié)論進(jìn)行了驗(yàn)證，為十棗湯提取工藝參數(shù)的選擇提供了科學(xué)依據(jù)。本研究中的待測(cè)成分為大戟二烯醇，來(lái)源于本方中的甘遂和大戟，是十棗湯治療水腫脹滿、胸腔積液、腹水、二便不利的主要活性成分。在實(shí)際測(cè)定中，由于大戟二烯醇的極性較小，采用高效液相色譜法測(cè)定時(shí)，出峰時(shí)間較長(zhǎng)，流動(dòng)相稍調(diào)整會(huì)導(dǎo)致出峰時(shí)間的大幅變動(dòng)，同時(shí)考慮樣品中其他成分的干擾，最終確定以乙腈-0.1%甲酸水溶液（90∶10，V/V）為流動(dòng)相進(jìn)行分離。

綜上所述，本研究中優(yōu)選的十棗湯的最佳提取工藝為提取2 次，提取時(shí)間為1.5 h，加入10 倍量水，經(jīng)驗(yàn)證工藝合理、可行。