跑臺運(yùn)動對T2DM小鼠海馬Aβ及PI3K/AKT/IDE通路的影響

李忠堂 張憲亮 崔莉莉

跑臺運(yùn)動對T2DM小鼠海馬Aβ及PI3K/AKT/IDE通路的影響

李忠堂1張憲亮2崔莉莉1

(1.江蘇第二師范學(xué)院 體育學(xué)院, 江蘇 南京 211200；2.山東大學(xué)體育學(xué)院, 山東 濟(jì)南 250061）

【目的】探討跑臺運(yùn)動對T2DM小鼠海馬Aβ含量及PI3K/AKT/IDE通路的影響?！痉椒ā?周高脂膳食聯(lián)合STZ注射造T2DM小鼠模型，造模成功后隨機(jī)分為對照組（C）、T2DM對照組（TC）和T2DM運(yùn)動組（TE），TE進(jìn)行8周跑臺運(yùn)動。第1周進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練，第2～8周進(jìn)行正式運(yùn)動（速度為0.8 km/h，每天50 min，每周6天）。運(yùn)動后取海馬，用RT-PCR和Westernblotting檢測小鼠海馬內(nèi)PI3K、AKT、IDE的mRNA和蛋白表達(dá)水平，用Elisa檢測小鼠海馬內(nèi)Aβ42含量?！窘Y(jié)果】與C組比較，TC組小鼠Aβ42含量極顯著增多（＜0.01），PI3K、IDE的mRNA（＜0.05），PI3K、AKT、IDE的蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05）；與TC組比較，TE組小鼠海馬內(nèi)Aβ42含量顯著降低（＜0.05），PI3K的mRNA顯著增多（＜0.05），PI3K、AKT、IDE的蛋白表達(dá)水平顯著增多（＜0.05）?！窘Y(jié)論】跑臺運(yùn)動激活了PI3K/AKT通路，增加了IDE蛋白表達(dá)，抑制了T2DM小鼠海馬內(nèi)Aβ沉積。

跑臺運(yùn)動；2型糖尿?。籔I3K/AKT通路；胰島素降解酶；β-淀粉樣蛋白

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是一種漸進(jìn)性神經(jīng)退行性疾病，以Aβ沉積、神經(jīng)纖維纏結(jié)、神經(jīng)元丟失和突觸障礙為主要病理特征。越來越多的證據(jù)表明，肥胖、糖尿病等是AD的主要危險(xiǎn)因素。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病晚期患者患AD的風(fēng)險(xiǎn)是未患糖尿病老年人的2倍[1]。雖然說AD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，但是胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是其最常見的診斷因素[2]。另外，有研究發(fā)現(xiàn)，外周的IR可導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、損害認(rèn)知功能[3]。

研究證實(shí)，長期暴露于高胰島素血癥環(huán)境可導(dǎo)致神經(jīng)退行性變化，認(rèn)知功能降低[4]。此外，外周組織長期的IR可能導(dǎo)致腦IR，抑制腦胰島素?cái)z入，加劇腦內(nèi)Aβ42集聚[5]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，胰島素與胰島素受體結(jié)合，可啟動一系列級聯(lián)反應(yīng)，如啟動PI3K/AKT通路[6]。特異性敲除胰島素受體基因可抑制神經(jīng)元胰島素信號誘導(dǎo)AD，其機(jī)制可能與AKT與GSK3磷酸化異常有關(guān)[7]。此外，IDE是PI3K/AKT下游靶基因，其與Aβ結(jié)合可促進(jìn)Aβ降解，減少腦內(nèi) Aβ含量[8]。

運(yùn)動作為一種積極有效的干預(yù)方式，可以有效緩解AD認(rèn)知功能下降，抑制Aβ沉積。人體實(shí)驗(yàn)也證實(shí)運(yùn)動可以增強(qiáng)糖尿病和AD患者認(rèn)知功能，提高其胰島素敏感性，同時(shí)減少血液內(nèi)Aβ含量[9]。但是，目前大多數(shù)有關(guān)運(yùn)動對糖尿病的研究均為人體研究，部分動物實(shí)驗(yàn)僅研究了運(yùn)動對糖尿病大鼠認(rèn)知功能的積極效應(yīng)，其具體的分子機(jī)制還不清楚[10, 11]。

因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過高脂膳食結(jié)合STZ注射建立2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）小鼠模型，隨后進(jìn)行8周跑臺運(yùn)動干預(yù)，以PI3K/AKT/IDE作為作用靶點(diǎn)，探討運(yùn)動對T2DM小鼠腦內(nèi)Aβ的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與造模

30只6周齡雄性C57BL/6小鼠（上海西普爾-必凱公司），體重19 g左右，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分為正常對照組（10只，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)）和T2DM組（20只，高脂飼料喂養(yǎng)。每100 g飼料含14 g蔗糖，16.9 g豬油，10.2 g酪蛋白，2.2 g麥芽糊精， 2.1 g預(yù)混料，54.6 g繁殖鼠料），自由飲水，自然光照。實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格遵守《實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會章程》和《實(shí)驗(yàn)動物管理委員會章程》。

按照先前研究[12]描述進(jìn)行T2DM造模。6周高脂膳食喂養(yǎng)后，T2DM組按80 mg/kg體重注射1%STZ；正常對照組按80 mg/kg體重等劑量注射檸檬酸-檸檬酸鈉溶液。注射2周后，空腹12 h，血糖儀檢測小鼠空腹血糖水平，血糖濃度高于8 mmol/L時(shí)，造模成功，即為T2DM小鼠，造模成功率為93.1%。

1.2 動物分組與運(yùn)動方案

將T2DM小鼠隨機(jī)分為T2DM對照組（TC，=6）和T2DM運(yùn)動組（TE，=6），同時(shí)選取6只正常對照組小鼠作為對照組（C，=6）。TE組進(jìn)行有氧跑臺運(yùn)動，C組和TC組小鼠安靜飼養(yǎng)。具體運(yùn)動方案為：第1周：第1-2天每天運(yùn)動30 min，第3-4天每天運(yùn)動 40min，第5-6天每天運(yùn)動50 min，第2周-第8周每天固定運(yùn)動50 min；每周運(yùn)動6天，周日休息，運(yùn)動速度為0.8 km/h。運(yùn)動干預(yù)期間C組繼續(xù)用普通飼料飼養(yǎng)，TC組和TE組繼續(xù)用高脂飼料喂養(yǎng)。

1.3 取材

8周運(yùn)動結(jié)束后24 h，斷頸椎處死，打開顱頂，分離雙側(cè)海馬，-80℃冰箱保存，用于RT-PCR、Western blotting、Elisa等相關(guān)指標(biāo)檢測。

1.4 RT-PCR

Trizol法提取適量海馬組織總RNA，檢測OD260/OD280，介于1.80-2.00之間者進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。37 ℃，15 min，98 ℃，5 min逆轉(zhuǎn)錄得到穩(wěn)定的cDNA（20μl體系）。據(jù)RT-PCR試劑盒（TOYOBO）：加入SYBR green PCR MasterMix，10μL；cDNA， 2μL；ROX，0.4μL；上、下游引物各0.04μL；補(bǔ)充dH2O至20 μL。PI3K：上游引物：5’-CAT TGA CCT ACA CCT GGGGG -3’，下游引物：5’- TCC TGG AAA GTC TCC CCTCT -3’；AKT：上游引物：5’-TCC GAG GAT GCC AAG GAGAT -3’，下游引物：5’-TAG GAG AAC TTG ATC AGG CGG -3’；IDE：上游引物：5’-CAA TAC ATT CAG AAG CTA CGTG -3’，下游引物：5’-CAG GGT ATG GTG TTG CAT CTT -3’； GAPDH上游引物：5’-ATG GTG AAG GTC GGT GTG-3’，下游引物：5’- AAC TTG CCG TGG GTA GAG -3’。預(yù)變性95 ℃，60 s；以95 ℃，15 s；60 ℃，30 s；72 ℃，45 s為一循環(huán)，擴(kuò)增45個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min。60 ℃-95 ℃，每升高1 ℃收集一次熒光，制作溶解曲線。記錄Ct值，據(jù)2-△△Ct法計(jì)算相對表達(dá)量。

1.5 Western blotting

取適量海馬組織，RIPA裂解液（加入蛋白酶-磷酸酶抑制劑）裂解，勻漿儀勻漿3次，靜置20 min后4 ℃12000 g離心20 min，取上清液即為總蛋白。BCA法檢測蛋白濃度（碧云天），并加入相同體積 2×溴酚藍(lán)Loading buffer，95 ℃，10 min，蛋白變性。計(jì)算蛋白上樣量，上樣，80 V恒壓電泳將蛋白壓縮至1條線，120 V恒壓跑膠。100 V恒壓轉(zhuǎn)膜90 min，牛奶封閉2 h。一抗（PI3K，兔抗，1:1000，cst3811；Akt，兔抗，1:1000，cst9272；IDE，兔抗， 1:1000，ab133561；GAPDH，兔抗，1:5000，Goodhere）4 ℃孵育過夜，二抗（HRP標(biāo)記的山羊抗兔，Jackson 111-035-003）室溫孵育2 h，ECL顯影，Alpha凝膠成像，F(xiàn)luorChem FC2數(shù)據(jù)分析。

1.6 Elisa

根據(jù)Aβ42試劑盒，取適量海馬組織，加入PBS，勻漿儀勻漿，4 ℃3000 g離心20 min，取上清液。酶標(biāo)板分別設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和樣品孔，標(biāo)準(zhǔn)孔依次加入7.5μg/L、15μg/L、30μg/L、60μg/L、120μg/L標(biāo)準(zhǔn)品50μL；樣品孔加入樣品50μL（稀釋液4:1比例稀釋）。封膜，37 ℃水浴鍋孵育30 min，洗滌液洗滌5次。加入顯色劑，37 ℃水浴鍋孵育 10 min，加入終止液終止顯色。450 nm波長檢測OD值，據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度和OD值計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品濃度。

1.7 數(shù)據(jù)處理

Excel錄入數(shù)據(jù)，SPSS17.0處理數(shù)據(jù)，GraphPad5.0作圖。數(shù)據(jù)使用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)使用單因素方差分析，＜0.05表示顯著性差異，＜0.01表示極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠海馬Aβ42含量

Aβ42在腦內(nèi)集聚可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞凋亡等，引起細(xì)胞毒性，誘發(fā)AD。本實(shí)驗(yàn)通過Elisa檢測了各組小鼠海馬Aβ42含量，結(jié)果如圖1所示。與C組比較，TC組小鼠海馬Aβ42含量極顯著增加（＜0.01）；與TC組比較，TE組小鼠海馬Aβ42顯著下降（＜0.05）。

2.2 各組小鼠海馬IDE基因表達(dá)水平

Aβ異常沉積是由Aβ生成增多或清除減少所致。而在散發(fā)性AD中，Aβ含量的增加多是由Aβ清除減少所致。IDE可通過與Aβ結(jié)合，促進(jìn)其降解來清除Aβ。因此本實(shí)驗(yàn)通過RT-PCR和Westernblotting檢測海馬內(nèi)IDE的mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平，結(jié)果如圖2所示。與C組比較，TC組IDE的mRNA水平和蛋白表達(dá)水平均顯著下降（＜0.05）；與TC組比較，TE組海馬內(nèi)IDE的蛋白表達(dá)水平顯著增加（＜0.05）。

注：A：IDE mRNA表達(dá)水平；B：IDE蛋白表達(dá)水平；C：IDE蛋白條帶圖。與C組比較，*表示P＜0.05；與TC組比較，&表示P＜0.05。

2.3 各組小鼠海馬PI3K、AKT基因表達(dá)水平

IDE是PI3K/AKT信號通路的下游靶蛋白，T2DM中PI3K/AKT通路異?？赡苁荌DE減少的機(jī)制之一。因此，本實(shí)驗(yàn)通過RT-PCR和Westernblotting檢測了小鼠海馬內(nèi)PI3K和AKT的mRNA水平和蛋白表達(dá)水平，結(jié)果如圖3所示。與C組比較，TC組小鼠海馬內(nèi)PI3K的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.05），AKT的蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05）；與TC組比較，TE組小鼠海馬內(nèi)PI3K的mRNA水平極顯著增加（＜0.01），PI3K的蛋白表達(dá)水平和AKT的蛋白表達(dá)水平顯著增加（＜0.05）。

注：A：PI3K mRNA表達(dá)水平；B：PI3K蛋白表達(dá)水平；C：AktmRNA表達(dá)水平；D：Akt蛋白表達(dá)水平。與C組比較，*表示P＜0.05；與TC組比較，&表示P＜0.05，&&表示P＜0.01

3 分析討論

先前研究證實(shí)，長期高脂膳食聯(lián)合STZ造T2DM小鼠模型認(rèn)知功能顯著下降，而且運(yùn)動可以緩解T2DM小鼠認(rèn)知功能的下降，但是其分子機(jī)制還不清楚[13]。近來有研究發(fā)現(xiàn)，T2DM小鼠認(rèn)知功能的下降與腦內(nèi)Aβ含量增加有關(guān)[14]，且 T2DM小鼠腦內(nèi)Aβ含量增加伴隨有 PI3K、AKT、IDE等蛋白表達(dá)的降低[15, 16]。但是目前并無運(yùn)動對T2DM小鼠海馬內(nèi)Aβ及PI3K/AKT/IDE通路影響的研究。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)跑臺運(yùn)動通過激活PI3K/AKT通路，增加IDE蛋白表達(dá)，減少Aβ42含量。

3.1 跑臺運(yùn)動對T2DM小鼠海馬Aβ42含量的影響

臨床前期和臨床證據(jù)表明糖尿病是AD的主要風(fēng)險(xiǎn)因素。代謝障礙、炎癥和IR可能是兩種疾病的共病機(jī)制[17]。IR可以加劇Aβ42/40以及tau蛋白表達(dá)增加，同時(shí)AD模型中也表現(xiàn)出IR[18]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在8周高脂膳食聯(lián)合STZ注射誘導(dǎo)的T2DM小鼠模型海馬內(nèi)Aβ42含量增加。Tang等[14]發(fā)現(xiàn)T2DM大鼠海馬內(nèi)Aβ水平顯著增多，另外，Busquests等[19]也發(fā)現(xiàn)高脂膳食可以增加C57BL/6小鼠Aβ沉積。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)一致，提示T2DM小鼠海馬內(nèi)Aβ增多。但是有研究將db/db糖尿病小鼠與APP/PS1轉(zhuǎn)基因AD小鼠雜交得到患糖尿病的AD小鼠，令人驚奇的是，與AD小鼠比較，糖尿病AD小鼠認(rèn)知功能下降，但皮層內(nèi)Aβ并沒有顯著增多，提示糖尿病增加了AD認(rèn)知功能的下降，但這似乎并不依賴于Aβ沉積的增多[20]。結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致，原因可能是Niedowicz等選用的糖尿病小鼠模型與本實(shí)驗(yàn)小鼠模型不同。

另外，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)跑臺運(yùn)動可以抑制T2DM小鼠海馬內(nèi)Aβ42含量的增加。目前研究證實(shí)，運(yùn)動可以抑制糖尿病認(rèn)知功能下降，其機(jī)制與細(xì)胞增殖[21]、炎癥反應(yīng)[22]、以及wnt3/GSK-3β通路[23]有關(guān)，但是目前并無運(yùn)動對T2DM小鼠海馬Aβ沉積影響的研究。因此，本實(shí)驗(yàn)通過Elisa檢測了小鼠海馬內(nèi) Aβ42的含量，提示運(yùn)動可以抑制T2DM小鼠海馬內(nèi) Aβ42含量，推測其可能是運(yùn)動緩解T2DM小鼠認(rèn)知能力的原因，但是本研究并沒有檢測小鼠空間記憶能力。另外，有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，游泳運(yùn)動并沒有減少四氧嘧啶（Alloxan，ALX）誘導(dǎo)的糖尿病大鼠海馬內(nèi)Aβ蛋白表達(dá)水平[24]。該結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)不一致，對比分析發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)在動物模型、運(yùn)動模式、以及檢測方法的選擇上均不一致，這可能是導(dǎo)致結(jié)果不同的原因之一。

3.2 跑臺運(yùn)動對T2DM小鼠海馬IDE的影響

IDE是一種高度保守的Zn2+-依賴的內(nèi)肽酶，可以降解胰島素并調(diào)節(jié)周圍的胰島素水平，是腦內(nèi) Aβ降解的關(guān)鍵酶之一[25]。基因敲除IDE可增加血漿Aβ42水平，增加AD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[26]。研究發(fā)現(xiàn)在T2DM大鼠腦內(nèi)IDE低表達(dá)，Aβ42含量增多[18]。此外，STZ誘導(dǎo)的T2DM動物海馬和皮層內(nèi)IDE水平下降，Aβ水平增多[27]。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，T2DM海馬內(nèi)IDE蛋白表達(dá)水平和mRNA表達(dá)水平均出現(xiàn)顯著性下降，提示T2DM海馬IDE蛋白表達(dá)降低的原因可能與基因轉(zhuǎn)錄降低有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中，跑臺運(yùn)動增加了IDE的蛋白表達(dá)，降低了Aβ42含量，提示跑臺運(yùn)動抑制Aβ42增加的機(jī)制與IDE蛋白表達(dá)增多有關(guān)。目前多數(shù)研究僅探討了高脂膳食、STZ等誘導(dǎo)的糖尿病模型腦內(nèi)IDE蛋白及Aβ含量的變化，有關(guān)運(yùn)動對糖尿病海馬內(nèi)IDE影響的研究并不多見，僅有Kim等[28]發(fā)現(xiàn)運(yùn)動可以增加GK糖尿病大鼠肝臟內(nèi)IDE表達(dá)。但是該實(shí)驗(yàn)并沒有檢測糖尿病大鼠腦內(nèi)IDE的表達(dá)水平，因此本實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)跑臺運(yùn)動可能通過增加IDE蛋白表達(dá)，降低T2DM小鼠海馬內(nèi)Aβ42含量。

3.3 跑臺運(yùn)動對T2DM小鼠海馬PI3K/AKT信號通路的影響

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)跑臺運(yùn)動可以通過增加IDE蛋白表達(dá)，減少T2DM小鼠海馬內(nèi)Aβ42含量，但是IDE上游通路并不清楚。T2DM主要表現(xiàn)是胰島素抵抗，外周胰島素主要通過PI3K/AKT信號通路介導(dǎo)糖代謝，該通路異常導(dǎo)致胰島素抵抗，誘導(dǎo)T2DM。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，胰島素也可以通過PI3K/AKT通路調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞功能。正常情況下，胰島素可通過PI3K/AKT通路抑制GSK-3α活性，從而減少Aβ沉積。因此本實(shí)驗(yàn)同時(shí)檢測了PI3K/AKT信號通路的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)T2DM小鼠海馬內(nèi)PI3K和AKT的蛋白表達(dá)水平顯著降低，而跑臺運(yùn)動可以增加PI3K和AKT的蛋白表達(dá)水平。先前研究證實(shí)，T2DM腦內(nèi)PI3K和Akt的蛋白水平和磷酸化水平被抑制，提示T2DM可以抑制PI3K/Akt通路的激活[29]。Xu等[30]研究也發(fā)現(xiàn)STZ誘導(dǎo)的T2DM小鼠腦內(nèi)PI3K、Akt活性被抑制。以上研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)基本一致。而有關(guān)運(yùn)動對T2DM動物PI3K/Akt通路的影響主要集中于肌肉等其他組織中，如Cheng等[31]發(fā)現(xiàn)運(yùn)動可以激活T2DM心肌內(nèi)PI3K/AKT通路。Cao等[32]發(fā)現(xiàn)運(yùn)動激活了T2DM骨骼肌內(nèi)的PI3K/AKT通路。而僅有Kim等[28]通過STZ造模T2DM大鼠，并采用跑臺運(yùn)動進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)跑臺運(yùn)動可以增加T2DM大鼠腦內(nèi)p-PI3K/PI3K的比率以及p-AKT/AKT的比率，提示跑臺運(yùn)動激活了T2DM大鼠腦內(nèi)PI3K/AKT通路。IDE是PI3K/AKT通路下游靶基因，因此推測運(yùn)動可以通過激活PI3K/AKT通路增加海馬內(nèi)的IDE表達(dá)水平。

4 結(jié)論

T2DM小鼠海馬內(nèi)PI3K/AKT通路被抑制，IDE蛋白表達(dá)下降，Aβ含量增加；而8周有氧跑臺運(yùn)動可以激活PI3K/AKT通路，增加IDE蛋白表達(dá)，抑制T2DM小鼠Aβ含量增加。

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Effects of Treadmill Exercise on Aβ and PI3K/AKT/IDE Signaling Pathway on the Hippocampus of T2DM Mice

LI Zhongtang, etal.

(Jiangsu Second Normal Uinversity，Nanjing 211200, Jiangsu, China)

李忠堂(1973—)，博士，教授，研究方向：體育教育訓(xùn)練理論與實(shí)踐、運(yùn)動人體科學(xué)。