低聚原花青素通過抑制TLR 4/NF-κB通路對(duì)糖尿病腎病大鼠的腎臟保護(hù)和炎癥抑制作用

呂曉楠,宗春輝,宋光明

糖尿病腎病(diabetic kidney disease,DKD)是糖尿病患者嚴(yán)重并發(fā)癥之一,更是導(dǎo)致患者終末期腎病的重要原因,DKD的發(fā)生可直接影響糖尿病患者預(yù)后[1]。目前表明氧化應(yīng)激、炎癥和纖維化在DKD的進(jìn)展中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。其中,炎癥不僅直接導(dǎo)致了DKD的發(fā)生和進(jìn)展,還可加速這一過程[2]。包括腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素(interleukin, IL)-1β和IL-6等促炎細(xì)胞因子和趨化因子在DKD的發(fā)生發(fā)展過程中均顯著增加[2]。盡管對(duì)DKD的發(fā)病機(jī)制已經(jīng)有較多研究,但探索新的有效治療策略仍具有挑戰(zhàn)性[3]。低聚原花青素(oligomeric proanthocyanidi, OPC)是一種存在于有色植物花果中的水溶性物質(zhì),其具有抗氧化應(yīng)激、抗炎、抗纖維化等多種藥理活性,具有重要的臨床和研究?jī)r(jià)值[4,5]。既往已經(jīng)有多個(gè)研究證實(shí)OPC在DKD進(jìn)展中發(fā)揮腎臟保護(hù)作用[6-8]。本課題組前期研究表明了OPC對(duì)DKD大鼠足細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化的抑制作用[9]。但OPC對(duì)DKD腎臟保護(hù)作用的機(jī)制和對(duì)腎臟炎癥的抑制作用仍待進(jìn)一步探索。

Toll樣受體(toll-like receptors, TLRs)是非特異性免疫系統(tǒng)中的一個(gè)跨膜非催化性蛋白,可激活下游炎癥信號(hào)通路,以應(yīng)對(duì)外源性刺激。已經(jīng)證實(shí),TLRs信號(hào)、核因子κ B(NF-κB)的激活與細(xì)胞內(nèi)的促炎細(xì)胞因子和趨化因子[如IL-6、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1, MCP-1)和IL-1β]釋放增加相關(guān)。TLR4/NF-κB信號(hào)通路激活是導(dǎo)致局部炎癥和白細(xì)胞蓄積的重要機(jī)制之一[10]。大量的研究表明TLR4、NF-κB激活在多種急慢性腎臟疾病、DKD炎癥、纖維化中發(fā)揮關(guān)鍵作用[10,11]?；诖?本研究探討了OPC對(duì)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的DKD大鼠的腎臟損傷和炎癥反應(yīng)的作用,以期為OPC的臨床應(yīng)用提供更多理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 OPC提取物(天津尖峰藥業(yè)有限公司);鏈脲佐菌素(美國(guó)Sigma公司);細(xì)胞裂解緩沖液(P0013B)、蛋白酶抑制劑混合物(P1005)(上海碧云天公司);一抗抗體TLR 4、p-p65、p65、p-IκB α、IκB α和β-actin蛋白(美國(guó)Biotechnology公司);二抗(美國(guó)Invitrogen公司);葡萄糖、血尿素氮和肌酐酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(美國(guó)Abcam公司);尿微量白蛋白ELISA檢測(cè)試劑盒 (美國(guó)Bethyl公司)。

代謝籠(韓國(guó)JeungdoBio&Plant公司);光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯公司);超薄切片機(jī)(德國(guó)萊卡),透射電子顯微鏡(日本日立,H-7700)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇5～6周齡雄性SD大鼠50只,體重(250±20)g,均購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。全部大鼠在具有恒定12 h光照/黑暗循環(huán)的受控溫度動(dòng)物間中自由進(jìn)食和飲水。進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始本研究。本研究開始前經(jīng)天津市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn),按照《中國(guó)衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》進(jìn)行。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 DKD造模和干預(yù) SD大鼠隨機(jī)分為5組:對(duì)照組,模型組,OPC低、中、高劑量組,每組10只。

對(duì)照組給予正常飲食,其他組給予高脂高糖飲食。4周后,除對(duì)照組外給予腹腔注射50 mg/kg鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病產(chǎn)生,對(duì)照組給予腹腔注射等量生理鹽水。注射3 d后,大鼠尾靜脈的空腹血糖高于16.7 mmol/L為糖尿病大鼠造模成功。

1周后,OPC低、中、高劑量組分別給予125、250或500 mg/kg的OPC灌胃處理,對(duì)照組、模型組大鼠灌胃等體積的生理鹽水。在OPC治療8周后測(cè)定各組大鼠的空腹血糖和體重。OPC治療8周后處死大鼠。采集靜脈血樣,離心分離血清并儲(chǔ)存于-80 ℃。快速切除右腎樣本,稱重后并儲(chǔ)存于-80 ℃。計(jì)算大鼠腎重/體重比值作為腎臟指數(shù)。

1.3.2 生化指標(biāo)檢測(cè)分析 使用代謝籠飼養(yǎng)各組大鼠24 h,并收集大鼠尿液。使用ELISA試劑盒檢測(cè)大鼠血清中血糖、血尿素氮、血清肌酐和24 h尿微量白蛋白水平。

取大鼠左腎皮質(zhì)勻漿后,在4℃下以9000×g離心30 min。使用ELISA試劑盒分別檢測(cè)大鼠血清、腎臟皮質(zhì)勻漿液中的IL-1β、IL-6和MCP-1水平。

1.4 組織病理學(xué)檢查 將大鼠右腎制作成2 mm的切片,并用4%多聚甲醛固定。石蠟包埋后,使用HE和Masson染色分析后顯微鏡觀察和拍照大鼠腎小球的病理情況。

1.5 Western blot分析 取大鼠腎勻漿,并在含有蛋白酶抑制劑混合物和磷酸酶抑制劑的細(xì)胞裂解緩沖液中裂解,提取蛋白質(zhì)。通過10%血清十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠分離等量蛋白裂解物(30 μg),并電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。用含5%脫脂奶粉的PBS溶液封閉1 h后,加入稀釋好的TLR 4、p-p65、p65、p-IκB α、IκB α和β-actin一抗在4 ℃下孵育過夜,然后用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗室溫下震蕩孵育2 h,加入Millipore化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑,然后放入顯影儀,使顯影液曝光蛋白顯影。對(duì)目標(biāo)蛋白拍照后,使用Image-Pro Plus 6.0軟件定量蛋白條帶灰度值水平。

2 結(jié) 果

2.1 OPC對(duì)DKD大鼠腎病理影響 對(duì)照組大鼠HE染色顯示腎小球結(jié)構(gòu)完整,基底膜完整,間質(zhì)無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn);模型組腎小球硬化、萎縮顯著,間質(zhì)可見炎性細(xì)胞廣泛浸潤(rùn);OPC低、中、高劑量組大鼠腎小球病理狀態(tài)較模型組改善顯著,尤其OPC中、高劑量組的腎小球毛細(xì)血管腔均勻一致,無(wú)明顯萎縮,間質(zhì)炎癥細(xì)胞較模型組浸潤(rùn)減輕。Masson染色顯示,對(duì)照組腎間質(zhì)偶有少量藍(lán)色纖維著色,模型組腎臟內(nèi)出現(xiàn)大量藍(lán)色著色纖維,而OPC中、高劑量組的大鼠腎臟中藍(lán)色著色纖維組織減少,腎小球、間質(zhì)中僅少部分為藍(lán)色著色區(qū)(圖1)。

圖1 OPC對(duì)DKD大鼠腎組織病理的影響(HE和Masson染色,×100)OPC.低聚原花青素;DKD.糖尿病腎病。

2.2 OPC對(duì)DKD大鼠腎損傷的保護(hù)作用 在8周時(shí),模型組,OPC低、中、高劑量組大鼠的空腹血糖水平、腎臟指數(shù)、24 h尿微量蛋白、血清肌酐和血尿素氮水平均高于對(duì)照組(P均<0.05)。OPC中、高劑量組大鼠的空腹血糖、腎臟指數(shù)、微量白蛋白、血清肌酐和血尿素氮水平均低于模型組(P均<0.05),而OPC低劑量組大鼠上述參數(shù)與模型組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

表1 不同組DKD大鼠8周時(shí)血糖、腎功能對(duì)比

2.3 OPC干預(yù)對(duì)DKD大鼠血清、腎皮質(zhì)炎癥因子作用 8周時(shí)模型組,OPC低、中、高劑量組大鼠血清和腎皮質(zhì)中的IL-1β、IL-6和MCP-1水平均高于對(duì)照組(P均<0.05), OPC中、高劑量組大鼠的血清、腎臟中IL-1β、IL-6和MCP-1水平均低于模型組(P均<0.05),而OPC低劑量組大鼠上述參數(shù)與模型組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

表2 不同組DKD大鼠8周時(shí)血清和腎皮質(zhì)中炎癥因子比較

2.4 OPC抑制DKD大鼠TLR 4/NF-κB通路的活化 使用Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示,模型組的TLR 4蛋白水平、p-IκBα/IκBα比值、p-p65/p65比值較對(duì)照組顯著升高;而與模型組相比,OPC中、高劑量組大鼠的TLR 4蛋白水平、p-IκBα/IκBα比值、p-p65/p65比值顯著降低(P均<0.05,圖2,表3)。

圖2 Western blot檢測(cè)的OPC干預(yù)對(duì)DKD大鼠腎組織中TLR4、p65、lκBα蛋白表達(dá)影響OPC.低聚原花青素;DKD.糖尿病腎病;TLR. Toll樣受體。

表3 不同組DKD大鼠TLR4、p65、lκBα蛋白相對(duì)表達(dá)量

3 討 論

DKD是糖尿病患者常見且又嚴(yán)重的并發(fā)癥之一,中醫(yī)藥治療DKD近年來(lái)取得較多的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展[12]。OPC具有廣泛的藥理學(xué)活性,并已被證明可通過改善各種病理變化延緩DKD進(jìn)展。研究表明OPC具有緩解DKD大鼠腎功能不全和腎臟炎癥、改善糖脂代謝紊亂、降低空腹血糖的趨勢(shì)[8,13]。此外,OPC可抑制腎纖維化,并抑制DKD的腎小管上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化[9]。本研究以STZ誘導(dǎo)的DKD大鼠模型為研究對(duì)象,探討OPC對(duì)DKD大鼠腎臟的保護(hù)作用及其分子機(jī)制。本研究證明,OPC不僅能減輕STZ誘導(dǎo)的DKD大鼠的腎功能損害和炎癥反應(yīng),而且能抑制STZ誘導(dǎo)的DKD大鼠TLR 4/NF-κB通路,提示OPC可能通過抑制TLR 4/NF-κB通路而減輕DKD。

本研究證明250、500 mg/kg OPC治療可明顯減輕DKD大鼠模型的腎損傷,8周時(shí)大鼠腎臟病理情況得到改善,Masson染色顯示OPC中、高劑量治療組腎臟纖維化顯著改善。表現(xiàn)為空腹血糖、腎臟指數(shù)、24 h尿微量蛋白、血清肌酐和血尿素氮的降低,而500 mg/kg的OPC可顯著減輕DKD大鼠模型的腎損傷、抑制炎癥因子IL-1β、IL-6和MCP-1水平。IL-1β和IL-6均具有廣泛生物活性,IL-1β有較強(qiáng)的促炎活性,而IL-6則是較強(qiáng)的繼發(fā)性炎癥介質(zhì)。而MCP-1也是一種對(duì)單核細(xì)胞具有激活和趨化作用的趨化因子,在DKD炎癥過程中發(fā)揮著重要作用。越來(lái)越多的證據(jù)支持IL-1β、IL-6、MCP-1等炎癥因子和炎癥反應(yīng)在DKD的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[14,15]。在糖尿病患者中也證實(shí)了IL-1β、IL-6、MCP-1水平較高[16]。

TLR4/NF-κB通路已證實(shí)在多種炎癥相關(guān)疾病的發(fā)生機(jī)制中發(fā)揮作用,其通路激活與IL-1β、IL-6、MCP-1表達(dá)存在關(guān)系。關(guān)于TLR4/NF-κB通路發(fā)揮促炎作用參與到糖尿病、糖尿病并發(fā)癥的研究也有報(bào)道,TLR4通路激活后觸發(fā)的NF-κB依賴性炎癥反應(yīng),可加重急、慢性腎臟疾病[10,17,18]。足細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞的TLR4可在高糖環(huán)境下被激活,進(jìn)而活化NF-κB以及下游炎癥和纖維化反應(yīng)的相關(guān)分子。使用小干擾RNA沉默近曲小管上皮細(xì)胞中TLR4,可減弱高糖誘導(dǎo)的IκB/NF-κB活化,并抑制下游炎癥細(xì)胞因子IL-6和趨化因子配體2(即MCP-1)[19]。在DKD患者的腎小管中也發(fā)現(xiàn)了TLR 4表達(dá)增加,且腎小管TLR4表達(dá)與間質(zhì)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān),與估計(jì)腎小球?yàn)V過率呈負(fù)相關(guān),而TLR 4介導(dǎo)的途徑可能促進(jìn)DKD的腎小管間質(zhì)炎癥[20]。本研究同樣證明,OPC治療可抑制DKD大鼠腎臟中TLR 4/NF-κB通路的激活。既往類似研究表明,OPC通過抑制db/db小鼠糖尿病NF-κB活化而實(shí)現(xiàn)腎小球基底膜增厚、系膜擴(kuò)張和腎小球面積,抑制氧化應(yīng)激,改善腎臟纖維化[7]。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)OPC可通過減輕腎臟損傷、炎癥反應(yīng)凋亡而減輕DKD。OPC對(duì)DKD的腎臟保護(hù)作用可能與抑制TLR 4/NF-κB通路有關(guān)。本研究有助于更好地理解OPC參與DKD的機(jī)制,并為OPC在DKD治療中的潛在應(yīng)用提供新的證據(jù)。