紅花小孢子培養(yǎng)與胚狀體誘導研究

安素妨，董薇，楊紅旗，余永亮，許蘭杰，梁慧珍

摘要：小孢子培養(yǎng)是創(chuàng)造單倍體和雙單倍體的重要途徑，對提高紅花的育種效率具有重要意義。為了研究紅花游離小孢子的高效培養(yǎng)體系，用20份紅花材料研究花藥及小孢子培養(yǎng)中影響愈傷組織生長和胚發(fā)生的關鍵因素。結果表明，小孢子發(fā)育時期、紅花品種、基本培養(yǎng)基和激素濃度是影響紅花誘導愈傷組織的關鍵因素?；ㄋ幣囵B(yǎng)的愈傷及胚誘導率高于游離小孢子，且受基因型影響。單核靠邊期管狀花長度為 0.45～0.50 cm時，誘導成功率達到68.32%。供試的20份紅花材料中，有11份誘導出了愈傷組織，有1份分化出了胚狀愈傷，誘導成功率為15.79%。分化培養(yǎng)最適培養(yǎng)基組合為1/2 MS+B5+ 6-BA 1.0 mg/L + NAA 1.0 mg/L；小孢子懸浮培養(yǎng)最適培養(yǎng)基激素濃度以添加6-BA 4.0 mg/L 和NAA 0.5 mg/L效果最好，誘導愈傷率為22.5%。

關鍵詞：紅花；花藥；小孢子；愈傷組織

中圖分類號：S567.21? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A? ? ? ? ? ? ? 文章編號：2097-2172（2023）04-0377-06

doi：10.3969/j.issn.2097-2172.2023.04.018

Study on the Microspore Culture and Embryoid Induction of

Safflower Lines

AN Sufang， DONG Wei， YANGHongqi，YU Yongliang， XU Lanjie， LIANG Huizhen

（Sesame Research Centre， Henan Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou Henan 450002， China）

Abstract： Microspore culture is an important way to create haploids and diploids， which is of great significance for improving the breeding efficiency of safflower. In order to study the efficient culture system of isolated microspores in safflower， factors affecting callus growth and embryogenesis in anther and microspore culture were studied through 20 genotypes. Results showed that the stage of microspore development， safflower varieties， culture medium， hormones concentrations were the key factors affecting microspore embryoid induction in safflower. The callus and embryo induction rates of anther culture were higher than those of isolated microspores， and were affected by genotypes. When the fruit diameter of late uninucleate microspore was 1.00 to 1.96 cm and the length of tube flower was 0.45 to 0.50 cm， the induction success rate reached 68.32%. Callus tissues were successfully induced in 11 out of 20 genotypes， embryoid callus was developed in one safflower genotype and the induction success rate was 15.79%. The optimal differentiation medium combination was 1/2 MS plus B5 plus 1.0 mg/L 6-BA plus 1.0 mg/L NAA. The optimal medium for microspore suspension culture was 4 mg/L 6-BA plus 0.5 mg/L NAA which had the callus induction rate of 22.5%.

Key words： Safflower; Anther; Microspore; Callus

紅花（Carthamus tinctorius L.），別名刺紅花，菊科紅花屬植物，具有特異香氣，在我國主產地為河南、湖南、四川、新疆、西藏等省區(qū)。紅花幼苗可食用，成熟紅花絲含有豐富的紅色素、黃色素，具有活血化瘀的功效，其中黃色素對于治療老年H型高血壓效果良好，可改善患者的HRV，并抑制左室舒張功能減低，其機制可能與抗炎、抗氧化應激、保護血管內皮功能及抗血液高凝狀態(tài)有關，且聯合二甲雙胍治療早期DN能夠有效改善患者免疫功能和生活質量［1 - 2 ］。此外它還是一種天然的染料［3 ］。紅花種子可用作榨油，食用紅花油可以降低膽固醇，還可以加工成人造奶油、色拉醬等，是一種很好的食用油脂［4 ］。

由于培養(yǎng)一個新品種不僅耗時長，還需大量的人力和物力，嚴重制約了紅花良種育種及其在生產科研上的進一步利用。游離小孢子的培養(yǎng)是紅花獲得單倍體植株的重要途徑之一，通過誘導培養(yǎng)能生成純合的二倍體植株，即可加快紅花遺傳改良，也為紅花的苗木繁育、分子生物學、遺傳學和形態(tài)發(fā)生學等研究提供穩(wěn)定的材料。研究者最初從油菜的小孢子培養(yǎng)中獲得小孢子植株? ? 后［5 ］，小孢子培養(yǎng)技術的研究進展迅速，陸續(xù)在白菜類、辣椒、蘿卜、蕓薹屬蔬菜、大麥等作物中廣泛應用并獲得成功［6 - 10 ］，但花藥和小孢子培養(yǎng)技術在紅花中未見報道。我們借鑒其他植物花藥和小孢子培養(yǎng)技術體系，通過對不同小孢子發(fā)育時期、不同品系的紅花以及培養(yǎng)基條件進行探索，以期獲得紅花胚狀體，為獲得紅花培養(yǎng)單倍體植株提供技術支撐。

1? ?材料與方法

1.1? ?試驗材料

選用不同類型和來源的20份紅花材料（表1），其中C01～C04為河南省衛(wèi)紅花農家種變異株系，C05～C08為云南紅花農家種變異株系，C09～C12為新疆紅花農家種變異株系，C13～C16為四川紅花農家種變異株系，C17～C20為印度紅花種質選系。供試材料種植于河南省現代農業(yè)開發(fā)研究基地，7：00 — 9：00時分批采集現蕾5～7 d的帶莖紅花花苞，插入清水中備用。

1.2? ?試驗方法

1.2.1? ? 預處理? ? 為提高胚狀體的誘導率，需對紅花花苞進行預處理。將取回的紅花花苞置4 ℃冰箱低溫處理24 h。用自來水沖洗干凈，在超凈工作臺環(huán)境下用70%乙醇滅菌1 min，10%次氯酸鈉滅菌5 min，無菌水沖洗5～6次，用吸水紙吸干水分。

1.2.2? ? 篩選紅花小孢子最佳發(fā)育時期? ? 根據許蘭杰等［11 ］的方法，選取不同的紅花小孢子發(fā)育時期，分別為四分體期、單核早中期、單核靠邊期、雙核期。在MS固體培養(yǎng)基中測試愈傷組織誘導率。

1.2.3? ? 小孢子分離純化? ? 選取易產生愈傷組織的材料C02、C09，各選取30個花蕾。經預處理后的花蕾，取出花絲置于玻璃管中，加入MS+蔗糖60 g/L（未加激素和瓊脂）液體培養(yǎng)基1 mL。用玻璃棒研磨使之小孢子散出，導入過濾器過濾，將濾液盛入10 mL離心管，放入1 000 r/min離心機離心3 min，棄上清液，加入懸浮培養(yǎng)液使沉淀的小孢子再次懸浮后，再次放入1 000 r/min離心機離心3 min，重復3次。

1.2.4? ? 小孢子培養(yǎng)? ? 將沉淀的小孢子分別轉移至含有6-BA、IAA不同濃度的懸浮培養(yǎng)液培養(yǎng)皿中，按正交實驗設計，在24 ℃溫度下黑暗培養(yǎng)，形成愈傷組織后轉移至分化培養(yǎng)基上，置于22 ℃、10 000 lx光照16 h、黑暗8 h下繼代培養(yǎng)14 d。每激素處理40個花蕾。

1.2.5? ? 花藥培養(yǎng)? ? 將處理過的紅花花苞用無菌鑷子去掉外層苞片，剝開花絲取出花藥，接種于誘導培養(yǎng)基MS+ NAA 1 mg/L + 6-BA 1.0 mg/L + KT 2 mg/L + Agar（瓊脂粉） 5 g/L內， 3次重復，每個100 mm×20 mm培養(yǎng)皿接種4個花蕾的花藥。接種后，將培養(yǎng)皿置于溫度24 ℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)2 d，再轉入22 ℃、 10 000 lx光照16 h、黑暗8 h下誘導愈傷組織。長出愈傷組織后轉移至10種分化培養(yǎng)基中進行分化培養(yǎng)，統(tǒng)計誘導率。

愈傷組織誘導率=（產生愈傷組織的花藥數/接種花藥數）×100%，

胚狀體誘導率=（胚狀體數/接種花藥總數）×100%。

2? ?結果與分析

2.1? ?不同發(fā)育時期的小孢子誘導效果

不同發(fā)育時期的小孢子，愈傷組織誘導效果不同（表2）。四分體時期（管狀花長度為 0.20～0.40 cm）的誘導率為1.67%，單核早中期（管狀花長度為 0.42～0.45 cm）的誘導率為6.11%，單核靠邊期（管狀花長度為0.45～ 0.50 cm）的誘導率為37.22%，雙核期（管狀花長度為 0.60～0.90 cm）的誘導率為17.78%。由此可見，單核靠邊期是花藥誘導愈傷的最佳時期，這一結果與對多數植物小孢子誘導的研究結果一致［12 - 14 ］。紅花小孢子單核靠邊期長出的愈傷組織堅硬、綠色、長勢較好（圖1），因此，在小孢子懸浮培養(yǎng)中，單核靠邊期均為誘導愈傷最適宜的時期。直接選取管狀花長度為 0.5 cm的花藥進行組織培養(yǎng)，可節(jié)約選材時間。

2.2? ?不同紅花材料花藥培養(yǎng)誘導效果

花藥和小孢子在誘導培養(yǎng)基中約培養(yǎng)7 d，可見透明水珠狀膨大的愈傷組織，繼續(xù)培養(yǎng)至14～20 d，愈傷組織顏色由透明逐漸變成乳白色。轉至分化培養(yǎng)基14 d后愈傷組織變綠，不同品種的花藥和小孢子，其培養(yǎng)效果不同。20份供試紅花材料中，有13份誘導出愈傷組織，分別為C01、C02、C04、C05、C08、C09、C10、C12、C14、C15、C19，其中C02、C09愈傷誘導率較高，分別為63.33%、57.67%。由此可見，在相同的培養(yǎng)條件下，不同材料的花藥愈傷誘導率受基因型的影響較大（表3）。

2.3? ?不同激素配比對紅花小孢子誘導率的影響

由表4可知，供試材料經過不同激素不同濃度配比處理后，愈傷誘導率為2.5%～22.5%，產生的愈傷組織為淡綠色，松散。7號培養(yǎng)基（MS+ 6-BA 4 mg/L + NAA 0.5 mg/L）中，C02、C09等2份材料愈傷誘導率最高，為22.5%，其他處理愈傷誘導率均較低。7號培養(yǎng)基的激素配比為紅花小孢子培養(yǎng)愈傷組織的最佳濃度。

2.4? ?不同材料的胚狀體分化效果

以11份紅花材料誘導出的愈傷組織分別轉移至10種分化培養(yǎng)基中誘導胚狀體，均出現不同顏色的膨大組織（表5），其中在10號分化培養(yǎng)基組合1/2MS+B5+6-BA 1.0 mg/L + NAA 1.0 mg/L中 ，紅花材料C02愈傷組織為深綠色，且長勢較好，能誘導出胚狀愈傷，接種19個愈傷出現3個胚狀體（圖2），誘導率為15.79%（表6）。初步判斷1/2MS培養(yǎng)基較有其他培養(yǎng)基更易誘導出胚狀愈傷，組合10為誘導紅花花藥胚狀體較佳組合。小孢子的液體培養(yǎng)基雖然能誘導出愈傷組織，但在10種分化培養(yǎng)基中并未獲得胚狀體，其誘導率為0。可見紅花小孢子分化培養(yǎng)與花藥分化培養(yǎng)的原理可能不同，這有待進一步探索。

3? ?討論與結論

花藥和小孢子培養(yǎng)技術已經在育種中得到廣泛應用。賈俊香通過白菜小孢子培養(yǎng)獲得了多頭、葉色油亮純和的菜心DH系203份，其植株分蘗力強，產量高，抗病能力增強［15 ］。有學者利用小孢子培養(yǎng)的DH群體獲得了甘藍枯萎病候選基因，并對其進行了驗證，結合分子標記技術，促進了抗枯萎甘藍新品種選育進程［16 ］。譚舒心等［17 ］首次開展了白菜小孢子超低溫凍存研究，建立了白菜小孢子超低溫凍存復蘇體系，使小孢子供體植株不受生長季節(jié)、生長期影響，可長期持續(xù)的獲取高生活力的白菜小孢子。

花粉和小孢子培養(yǎng)誘導出胚受多種因素影響。小孢子的發(fā)育時期是影響小孢子培養(yǎng)的一個關鍵因素，并不是整個的發(fā)育期都可以培養(yǎng)，在許多作物中，以小孢子單核靠邊期至雙核初期誘導胚狀體為最佳［18 - 20 ］。研究發(fā)現，小孢子的每個發(fā)育時期與花器官外部形態(tài)極為相關，針對不同的作物可根據花器官形態(tài)特征來判斷小孢子的發(fā)育時期［11， 21 ］。本研究發(fā)現，紅花誘導愈傷最佳時期為小孢子單核靠邊期。同一品種不同的變異株系之間愈傷組織及胚狀體的誘導率相差很大，大多研究中都是只有一部分組織獲得了胚狀體［22 - 23 ］。也有材料全部培養(yǎng)出胚狀體，如在青梗菜游離小孢子培養(yǎng)中，10個品種全部獲得了胚狀體，但基因型不同其胚胎的發(fā)生能力差異很大［24 ］，所以合適基因型的選擇也是花藥和小孢子培養(yǎng)成功的關鍵因素?；A培養(yǎng)基只有配合使用適當濃度的激素才能誘導愈傷組織的生長以及胚狀體的分化，不同物種需要的激素組合有差別。在瓜類中被認為6-BA配合2，4-D和KT效果最佳［25 ］，蕓薹屬中常用的激素組合為NAA和6-BA［26 - 27 ］，除此之外，在小麥和水稻小孢子上的研究表明麥芽糖、2，4-D和 PEG 濃度會對愈傷組織率和綠苗分化率產生影響［28 - 30 ］。小孢子胚狀體的產生受多種因素的影響。有研究者對實驗材料進行4 ℃冷處理、熱激處理后發(fā)現，小孢子的出胚率均有明顯的提高［31 - 33 ］。此外，除了加入植物激素，研究人員通常會在培養(yǎng)基中添加一定量的活性炭提高胚狀體的產生［34 - 36 ］。這些因素是否有利于誘導紅花小孢子產生胚狀體有待進一步研究。

研究結果表明，小孢子發(fā)育時期、紅花品種、基本培養(yǎng)基和激素濃度是影響紅花誘導愈傷組織的關鍵因素?；ㄋ幣囵B(yǎng)的愈傷及胚誘導率高于游離小孢子，且受基因型影響。單核靠邊期管狀花長度為 0.45～0.50 cm時誘導成功率達到68.32%。供試的20份紅花材料中，有11個誘導出了愈傷組織，僅C02分化出了胚狀愈傷，誘導成功率為15.79%。分化培養(yǎng)最適分化培養(yǎng)基組合為1/2 MS+B5+ 6-BA 1.0 mg/L + NAA 1.0 mg/L；小孢子懸浮培養(yǎng)最適培養(yǎng)基激素濃度以添加6-BA 4.0 mg/L 和NAA 0.5 mg/L效果最好，誘導愈傷率為22.5%。

參考文獻：

［1］ 王嘉祺，李志超，張應銳.? 紅花黃色素對老年H型高血壓患者心率變異性等的影響［J］.? 西北藥學雜志，2022，37（5）：147-152.

［2］ 鮑喜靜，李建英，彭? ?一，等.? 紅花黃色素聯合二甲雙胍對早期糖尿病腎病患者免疫功能和生活質量的影響［J］.? 河北醫(yī)藥，2022，44（7）：1042-1045.

［3］ NIE P H， ZHANG L， ZHANG? W H， et al. The effects of hydroxysafflor yellow A on blood pressure and cardiac function［J］.? Journal of Ethnopharmacology， 2012， 139（3）： 746-750.

［4］ 丁文浩.? 紅花油的營養(yǎng)價值與保健作用［J］.? 農村科技，2007（4）：51.

［5］ ROBERT LICHTER. Induction of haploid plants from isolated pollen of Brassica napus［J］.? Zeitschrift f？魨？讕？讈r Pflanzenphysiologie， 1982， 105（5）： 427-434.

［6］ 苗如意.? 辣椒小孢子培養(yǎng)關鍵技術研究［Z］.? 山西省，山西農業(yè)大學，2020-09-08.

［7］ 張? ?麗，王慶彪，王艷萍.? 利用離體小孢子培養(yǎng)技術培育心里美蘿卜新品系［J］.? 中國蔬菜，2020（8）：53-56.

［8］ 張勝雪，范偉強，王超楠，等.? 青蘿卜游離小孢子培養(yǎng)體系優(yōu)化［J］.? 中國瓜菜，2022，35（2）：34-38.

［9］ 伍健繽，陳坤豪，陳木溪，等.? 蕓薹屬蔬菜游離小孢子培養(yǎng)研究進展［J］.? 農學學報，2022，12（3）：44-49.

［10］ 陸瑞菊.? 大麥游離小孢子培養(yǎng)技術的優(yōu)化及單倍體耐鹽、耐低氮脅迫篩選體系的建立［D］.? 南京：南京農業(yè)大學，2012.

［11］ 許蘭杰，梁慧珍，余永亮，等.? 紅花花器官形態(tài)與小孢子發(fā)育時期的關系研究［J］.? 河南農業(yè)科學， 2021，50（11）：55-61.

［12］ 谷文英，祈新梅，龐巧遇，等.? 蒺藜苜蓿小孢子不同發(fā)育時期花蕾形態(tài)與花藥脫分化能力的研究［J］.? 中國農學通報，2011，27（20）：29-33.

［13］ 張恩慧，馬英夏，楊安平，等.? 甘藍小孢子培養(yǎng)中花蕾長度與細胞單核期的關系［J］.? 西北農業(yè)學報，2012，21（6）：124-128.

［14］ 張景景，穆國俊，侯名語，等.? 花生（Arachis hypogaea L.）游離小孢子培養(yǎng)獲得愈傷組織研究［J］.? 中國油料作物學報，2012，34（6）：592-597.

［15］ 賈俊香.? 基于小孢子培養(yǎng)的白菜類蔬菜種質創(chuàng)新［D］.? 沈陽：沈陽農業(yè)大學，2019.

［16］ LV， H H， WANG， et al. Breeding of cabbage （Brassica oleracea L. var. capitata） with fusarium wilt resistance based on microspore culture and marker-assisted selection［J］.? Euphytica， 2014， 200（3）： 465-473.

［17］ 譚舒心，張淑江，章時蕃，等.? 白菜小孢子超低溫保存及復蘇后胚狀體誘導［J］.? 中國蔬菜，2022（7）：52-61.

［18］ 馮? ?輝，姜鳳英，馮建云，等.? 羽衣甘藍游離小孢子培養(yǎng)技術研究及應用［J］.? 園藝學報，2007（4）：1019-1022.

［19］ 李桂花，王亭亭，劉? ?凱，等.? 芥藍小孢子培養(yǎng)研究初報［J］.? 熱帶作物學報，2016，37（8）：1518-1525.

［20］ 唐? ?兵，陶? ?蓮，盧? ?松，等.? 白菜游離小孢子培養(yǎng)高頻胚誘導技術體系優(yōu)化［J］.? 熱帶作物學報，2017，38（10）：1913-1920.

［21］ 賈俊香，李? ?娜，楊國棟，等.? 大蔥小孢子發(fā)育時期細胞學與形態(tài)特征觀察［J］.? 園藝與種苗，2022，42（5）：1-3；29.

［22］ 趙曉嫚.? 青花菜小孢子胚胎發(fā)生及品質影響因素研究［D］.? 南京：南京農業(yè)大學，2013.

［23］ 王莎莎.? 甘藍小孢子發(fā)育觀察與小孢子培養(yǎng)中高出胚率的誘導技術研究［D］.? 楊凌：西北農林科技大學，2008.

［24］ 張? ?琨，王一衡，王? ?琦.? 青梗菜游離小孢子培養(yǎng)關鍵因素研究［J］.? 種子，2022，41（5）：144-148.

［25］ 耿晨光，何? ?剛.? 瓜類花藥培養(yǎng)中激素和碳源的應用研究進展［J］.? 長江蔬菜，2008（10）：5-9.

［26］ 單  ?宏.? 基于小孢子培養(yǎng)的大白菜優(yōu)異種質創(chuàng)制［D］.? 沈陽：沈陽農業(yè)大學，2017.

［27］ 趙大芹，陶? ?蓮，張朝君，等.? 培養(yǎng)基成分對黔白大白菜雜交種小孢子胚誘導的影響［J］.? 貴州農業(yè)科學，2007（6）：24-25；29.

［28］ 蘭素缺，李光威，權書月，等.? 碳源組份及濃度對小麥花藥培養(yǎng)和游離小孢子培養(yǎng)的影響［J］.? 華北農學報，2002（S1）：93-97.

［29］ 郭桂梅.? 水稻和大麥游離小孢子培養(yǎng)條件的優(yōu)化［D］.? 上海：上海海洋大學，2013.

［30］ KAMIL ZIELI？譵SKI， et al.? The effect of glutathione and mannitol on androgenesis in anther and isolated microspore cultures of rye Secale cereale L.［J］.? Plant Cell， Tissue and Organ Culture PCTOC， 2020， 140（3）： 577-592.

［31］ 張勝雪，范偉強，王超楠，等.? 青蘿卜游離小孢子培養(yǎng)體系優(yōu)化［J］.? 中國瓜菜，2022，35（2）：34-38.

［32］ 王葆生，廉? ?勇，張艷萍，等.? 胡蘿卜游離小孢子胚狀體誘導技術優(yōu)化［J］.? 北方園藝，2019（13）：68-72.

［33］ RAHMAN， ZURAIDA ABD， SEMAN， et al.? Establishment of effective plantlets regeneration protocol via isolated microspore culture in Malaysian indica rice MR219［J］.? Plant Biotechnology Reports， 2022（prepublish）.

［34］ 郭世星，牛應澤，余學杰，等.? 活性炭對甘藍型油菜（Brassica napus L.）小孢子胚胎發(fā)生的影響［J］.? 種子，2005（7）：37-39.

［35］ 張? ?麗，鄭鵬婧.? 春白蘿卜游離小孢子培養(yǎng)的研究［J］.? 北方園藝，2013（23）：31-33.

［36］ YANG? H L， HU J F， et al.? Isolated microspore culture and plant regeneration of leaf mustard ［Brassica juncea（L.） Czern. et Coss.］［J］.? Agricultural Biotechnology， 2016， 5（6）：10-12; 15.