人參果主要病毒檢測方法研究

裴懷弟，宿兵兵，李玉斌，李淑潔，王立光，李琦，劉新星

摘要：為了給人參果病毒檢驗及抗病性研究提供支持，對人參果采用ELISA和RT-PCR兩種檢測方法對8份田間材料中的馬鈴薯M病毒（PVM）、番茄花葉病毒（ToMV）和煙草花葉病毒（TMV）進行檢測，對比篩選病毒檢測方法。結(jié)果表明，ELISA法檢測PVM的陽性檢出率為87.5%；ToMV為37.5%，疑似率為12.5%；TMV為37.5%。通過RT-PCR檢測體系，從人參果樣品中分別擴增出與試驗設(shè)計大小相符的特異條帶，PVM陽性檢出率為100%，ToMV為 50.0%，TMV為37.5%，檢測靈敏性和準(zhǔn)確性更高，檢測結(jié)果符合率在87.5%以上。對擴增陽性產(chǎn)物進行凝膠回收測序，確定為目標(biāo)條帶。

關(guān)鍵詞：人參果；病毒；ELISA檢測；RT-PCR檢測

中圖分類號：S662.5? ? ? ? ? ? ? 文獻標(biāo)志碼：A? ? ? ? ? ? ? 文章編號：2097-2172（2023）04-0365-04

doi：10.3969/j.issn.2097-2172.2023.04.016

Study on the Detection Methods for Main Viruses of Ginseng Fruit

PEI Huaidi 1， SU Bingbin 1， 2， LI Yubin 3， LI Shujie 1， WANG Liguang 1， LI Qi 1， LIU Xinxing 1

（1. Biotechnology Institute， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China; 2. School of Environmental

and Municipal Engineering， Lanzhou Jiaotong University， Lanzhou Gansu 730070， China; 3. Institute of Fruit and Floriculture Research， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China）

Abstract： To provide references for virus testing and disease resistance research in ginseng fruit （Solanum muricatum Aiton），8 materials of ginseng fruit were tested from the fields by using ELISA and RT-PCR methods to detect potato virus M（PVM）， tomato mosaic virus （ToMV） and tobacco mosaic virus （TMV）， and comparison and screening of virus detection methods were conducted. The results showed that by using the ELISA method， the positive detection rates of PVM and ToMV were 87.5% and 37.5%， respectively，suspicion rate was 12.5%， and the positive rate of TVM was 37.5%. By using the RT-PCR detection system， specific bands were amplified from ginseng fruit samples which were consistent with the size of the test design， the positive detection rates of PVM， ToMV and TMV were 100%， 50.0% and 37.5%， respectively， which indicated better detection sensitivity and accuracy， the coincident rate of the detected results was more than 87.5%. The amplified positive product was sequenced by gel recovery and was identified as the target band.

Key words： Solanum muricatum Aiton; Virus; ELISA test; RT-PCR test

人參果（Solanum muricatum Ait.）又名香瓜茄、長壽果、鳳果等，為茄科茄屬多年生草本植物，原產(chǎn)于南美洲安第斯山脈北麓［1 - 2 ］，自20世紀(jì)80年代引入中國，在我國多地均有種植。生產(chǎn)過程中人參果通常采用扦插繁殖育苗，長期無性繁殖造成人參果病毒病的感染和蔓延，主要表現(xiàn)為植株矮化、節(jié)間變短、葉片皺縮呈黃綠相嵌的斑駁狀、果實僵化畸形等，對作物產(chǎn)量及品質(zhì)影響巨大。培育無病毒種苗是預(yù)防病毒病的有效措施，同時對病毒的防控、無毒苗生產(chǎn)及海關(guān)檢疫等方面顯得尤為必要［3 ］。目前，關(guān)于人參果的研究主要集中在組培快繁［4 - 7 ］、溫室栽培 及基因組學(xué)等方面［8 - 13 ］，而關(guān)于病毒的種類、鑒定及高效檢測研究相對較少。我們采用雙抗體夾心ELISA和RT-PCR兩種檢測方法，對人參果植株主要病毒進行分析，以期為人參果病毒檢驗及抗病性研究提供支持。

1? ?材料與方法

1.1? ?供試材料

供試材料為人參果組培苗，共8份，培養(yǎng)材料為人參果側(cè)芽，采自甘肅省武威市民勤縣雙茨科鎮(zhèn)農(nóng)戶溫室大棚，由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所培育并提供，實驗所用試劑均為化學(xué)分析純。

1.2? ?試驗方法

將大田采集的人參果側(cè)芽用流水沖洗3～4 h，控干水分，在超凈工作臺上用無菌水洗3～5遍，用70%乙醇消毒30～40 s，投入1 g/kg升汞溶液中消毒5～6 min，再用無菌水洗5～6次，置于墊有濾紙的培養(yǎng)皿中晾干水分后接種于MS培養(yǎng)基（添加30 g/L蔗糖）中，pH為5.8～6.0。在溫度（25±2） ℃、光照12～16 h，光照強度2 000～3 000 lx條件下培養(yǎng)，每隔25 d左右進行轉(zhuǎn)接，獲得無菌苗備用。

1.2.1? ? 引物的設(shè)計? ? 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫上已公布的PVM 、TMV、ToMV的RNA序列，對PVM（NC_001361.2）、ToMV（NC_002692.1）和TMV（NC_ 001367.1）序列進行BLAST（basic local alignment search tool）相似性比較，找出3種病毒RNA的高度特異性區(qū)域，設(shè)計試驗所用引物。所用引物均由上海生工生物技術(shù)有限公司設(shè)計、合成，引物序列信息見表1。

1.2.2? ? RNA提取? ? 采用TIAN GEN RNAprep pure Plant Kit（DP432）提取人參果葉片總RNA。取50～100 mg植物葉片，在液氮中迅速研磨成粉，加入450 μL裂解液RL，旋渦劇烈震蕩混勻。其他步驟按說明書操作。將提取的總RNA溶解于50 μL的ddH2O中備用。

1.2.3? ? RT-PCR檢測? ? 采用TIAN GEN FastKinggDNA Dispelling RT SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒（KR118- 02），以總RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，然后在MiniAmp Thermal Cycler儀上進行PCR擴增。擴增體系為將cDNA 1 μL加入14 μLRT-PCR反應(yīng)液中，混勻后放入儀器中進行擴增。擴增條件為95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，57 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.4? ? RT-PCR產(chǎn)物回收與測序? ? 取擴增產(chǎn)物25 μL進行2%瓊脂糖凝膠電泳，各條帶充分分離時切取膠進行純化。PCR產(chǎn)物純化步驟按TIANgel Purification Kit瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒操作說明進行，回收產(chǎn)物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.2.5? ? 雙抗體夾心ELISA檢測? ? 取0.2 g人參果葉片置于研缽中，加1.5 mL提取緩沖液，研磨成勻漿后轉(zhuǎn)移到2 mL離心管中，搖勻；4 ℃、12 000 r/min下離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的離心管中，置-20 ℃保存?zhèn)溆?。ELISA檢測所用試劑盒購自Agdia公司（產(chǎn)品編號：PSA60000），測定方法按抗體說明書進行。在試驗條件恒定的情況下，利用標(biāo)本/陰性對照的比值進行分析。根據(jù)測定所得的吸光度求出被測樣品光密度值（P）與標(biāo)樣（健康材料）光密度值（N）比值（P/N）。結(jié)果判定：P/N＜1.50者，為陰性（不帶毒材料）；P/N介于1.50～1.99者，為疑似（輕度帶毒材料）；P/N≥2.00者，為陽性（帶毒材料）。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?ELISA檢測

利用雙抗體夾心ELISA 對人參果主要病毒進行檢測，結(jié)果（表2）表明，人參果中含有馬鈴薯M病毒（PVM）、番茄花葉病毒（ToMV）和煙草花葉病毒（TMV）病毒。檢測數(shù)據(jù)顯示，PVM的陽性檢出率為87.5%；ToMV的陽性檢出率為37.5%，疑似率為12.5%；TMV的陽性檢出率為37.5%。上述結(jié)果表明，田間種植的人參果中普遍含有馬鈴薯M病毒，為最主要病毒，其次為番茄花葉病毒和煙草花葉病毒。

2.2? ?RT-PCR檢測

以人參果總RNA為模板，經(jīng)RT-PCR擴增后，3種病毒的感病植株在瓊脂糖凝膠上分別呈現(xiàn)出與目標(biāo)片段大小相一致的反應(yīng)譜帶。如圖1所示，擴增后得到了分子量分別為261 bp（PVM）、365 bp（ToMV）、 343 bp（TMV）的片段，且該片段與理論設(shè)計長度相一致。測定結(jié)果表明，PVM的陽性檢出率為100%。ToMV的陽性檢出率為50.0%，TMV的陽性檢出率為37.5%。

2.3? ?基因序列同源性比對

隨機抽取人參果3種病毒cDNA擴增檢測為陽性的樣本各3份進行凝膠回收純化，對回收產(chǎn)物進行測序（圖2）。測序結(jié)果經(jīng)與NCBI報道的3種病毒的基因序列相比同源性很高，陽性標(biāo)本基因序列比對結(jié)果：PVM同源性為94.25%，ToMV為100%，TMV為81.34%，說明3種病毒引物在人參果中所提取的RNA中擴增出的基因片段為PVM、ToMV和TMV的目標(biāo)片段。

2.4? ?兩種檢測方法對比

對8份人參果材料用兩種方法檢測的結(jié)果進行比較，結(jié)果（表3）表明，2種檢測方法有較高的符合率，RT-PCR檢測效率和準(zhǔn)確性更高，ELISA檢測為疑似的植株通過RT-PCR檢測則為陽性，避免了假陰性的出現(xiàn)，檢測靈敏性更高。二者檢測符合率在87.5%以上。

3? ?討論與結(jié)論

植物病毒檢測常用的方法中有生物學(xué)、電子顯微觀察法、血清學(xué)和分子生物學(xué)等［14 - 15 ］，實際操作中多采用兩種以上方法相結(jié)合來判斷檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定方便、靈敏度較高，但只能檢測到納克水平的病毒，難于檢測更低濃度的病毒［16 ］；聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（PCR）是分子生物學(xué)中最常見的檢測方法之一，通過體外擴增的方法對供試樣品中的目的基因片段進行擴增，從而對即使病毒含量極低的樣品也能靈敏準(zhǔn)確地得到定性的檢測結(jié)果，其靈敏度和特異性較高，是一種較好的植物病毒檢測方法［17 ］。

本試驗采用兩種方法檢測的結(jié)果表明，田間種植的人參果普遍含有馬鈴薯M病毒，為最主要的病毒，其次為番茄花葉病毒和煙草花葉病毒。ELISA檢測中PVM的陽性檢出率為87.5%；ToMV為37.5%，疑似率為12.5%；TMV為37.5%。試驗建立的RT-PCR檢測體系，從人參果樣品中分別擴增出與試驗設(shè)計大小相符的特異條帶，結(jié)果顯示，PVM陽性檢出率為100%，ToMV為 50.0%，TMV為37.5%，這在基因水平上為馬鈴薯M病毒、番茄花葉病毒和煙草花葉病毒的檢測提供了更快速、靈敏檢測手段，避免了假陰性的出現(xiàn)，且檢測結(jié)果符合率在87.5%以上。

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