高效液相色譜法測(cè)定益氣補(bǔ)肺膏中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿的質(zhì)量控制與方法

葉吉明,楊景然,劉宇,安寧,柏永強(qiáng),陳文君

哮喘屬中醫(yī)學(xué)“哮證”“喘證”的范疇?！秲?nèi)經(jīng)》認(rèn)為,哮喘主要是肺病變引起,“伏痰”遇感引觸,痰氣交結(jié),肺氣宣降失常,而致痰鳴氣喘。發(fā)作期以邪實(shí)為主,與肺脾腎三臟關(guān)系密切[1]。目前中醫(yī)藥治療哮喘的研究取得了很大進(jìn)展,治療支氣管哮喘由緩解支氣管痙攣轉(zhuǎn)向控制炎性反應(yīng),在臨床發(fā)揮中醫(yī)整體辨證施治的優(yōu)勢(shì)[2-3]。益氣補(bǔ)肺膏系云南省第一人民醫(yī)院臨床有效經(jīng)驗(yàn)方研制而成的中藥復(fù)方制劑,膏中黃芪、法半夏和麻黃為君藥,南沙參、白術(shù)、茯苓、陳皮等為臣藥,干姜和大棗為佐藥,炙甘草為使藥,明確君藥、臣藥、佐藥和使藥并對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制,對(duì)保證藥效至關(guān)重要。本研究以方劑中麻黃為主要質(zhì)控指標(biāo),對(duì)制劑中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿進(jìn)行高效液相色譜法測(cè)定[4-8],旨在建立益氣補(bǔ)肺膏的質(zhì)量控制方法和標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料與方法

1.1 儀器 LC-2030plus液相色譜儀(日本島津有限公司),Polar-Phenyl色譜柱(5 μm,120 A,250 mm×4.6 mm,蘇州賽分科技有限公司),CPA225D型電子天平(賽多利斯),KQ-500B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司),薄層自動(dòng)鋪板器(重慶南岸新力實(shí)驗(yàn)電器廠),定量毛細(xì)管(美國Drummond公司)。

1.2 試藥及試劑 鹽酸麻黃堿對(duì)照品(批號(hào):171241-201809);鹽酸偽麻黃堿對(duì)照品(批號(hào):171237-201510),均為中國食品藥品檢定研究院提供。乙腈(色譜純,Sigma公司),鹽酸、乙醚和三乙胺(分析純,天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司),實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水;其他試劑均為分析純。供試品(樣品):益氣補(bǔ)肺膏(云南省第一人民醫(yī)院制劑,批號(hào):20190221、20190227和20190228,規(guī)格:150 g/瓶)。樣品含黃芪、南沙參、麻黃等。本品每1 g含麻黃以鹽酸麻黃堿(C10H5NO·HCl)和鹽酸偽麻黃堿(C10H5NO·HCl)的總量計(jì),不少于0.1 mg。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Polar-Phenyl色譜柱(5 μm,120 A,250 mm×4.6 mm),流動(dòng)相:乙腈-0.1%磷酸溶液(含0.1%三乙胺)(3∶97),流速:1.0 ml/min,檢測(cè)波長(zhǎng):210 nm,柱溫:30 ℃。

2.2 制備對(duì)照品溶液 取對(duì)照品鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿,精密稱定,加入稀乙醇溶液,隨后制備成每1 ml含60 μg、30 μg的對(duì)照品溶液,備用。

2.3 制備供試品溶液 取供試品益氣補(bǔ)肺膏(批號(hào):20190221)約5 g,精密稱定,置于帶玻璃塞的錐形瓶中,加0.1%的鹽酸溶液50 ml,稱定重量,超聲處理(功率240 W,頻率45 kHz)30 min,放冷,用0.1%的鹽酸溶液補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過,精密量取續(xù)濾液25 ml,滴加氨水(《中國藥典》2015版附錄要求)調(diào)pH值至11～12,用乙醚振搖提取3次,每次30 ml,合并乙醚液,加2 ml稀鹽酸,水浴80 ℃蒸干,殘?jiān)昧鲃?dòng)相溶解置于10 ml容量瓶中,加流動(dòng)相至刻度,搖勻,濾過,作為供試品溶液,備用。

2.4 制備陰性對(duì)照品溶液 按處方比例,稱取不含麻黃的陰性對(duì)照樣品,加水煎煮3次,每次2 h,濃縮成浸膏,按照制備處方工藝加入比例的輔料,混勻。按“2.3”項(xiàng)制成不含鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿的陰性對(duì)照品溶液,備用。

2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)[9]精密吸取鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿對(duì)照品、益氣補(bǔ)肺膏供試品和陰性對(duì)照品溶液各10 μl,按“2.1”項(xiàng)的色譜條件,自動(dòng)進(jìn)樣于高效液相色譜中,分析、記錄色譜圖,見圖1-5。陰性對(duì)照品色譜圖與對(duì)照品、混合對(duì)照品、供試品色譜圖中相應(yīng)的保留時(shí)間處無色譜峰出現(xiàn),表明陰性對(duì)照品無干擾,方法專屬性好。

2.6 考察線性范圍 精密吸取“2.2”項(xiàng)鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿對(duì)照品溶液1、5、10、15、20、25 μl,自動(dòng)進(jìn)樣于高效液相色譜中,測(cè)其峰面積。以峰面積積分值為縱坐標(biāo),鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿對(duì)照品的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,回歸方程:鹽酸麻黃堿Y=2287169.849X-19746.09355,R2=0.9998,鹽酸偽麻黃堿Y=2233878.861X-6498.427419,R2=0.9998,表明,鹽酸麻黃堿在0.05944～1.486 μg,鹽酸偽麻黃堿在0.03116～0.779 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

圖2 偽麻黃堿對(duì)照品溶液色譜圖

圖3 混合對(duì)照溶液色譜圖

圖4 供試品溶液色譜圖

圖5 陰性對(duì)照品溶液色譜圖

2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2”項(xiàng)鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿對(duì)照品溶液10 μl,自動(dòng)進(jìn)樣于高效液相色譜中,連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄峰面積,鹽酸麻黃堿峰面積RSD為0.07%,鹽酸偽麻黃堿峰面積RSD為0.14%,結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取同一批次益氣補(bǔ)肺膏(批號(hào):20190221)6份,按“2.3”項(xiàng)供試品溶液制備方法平行制備,精密吸取各10 μl,自動(dòng)進(jìn)樣于高效液相色譜中,鹽酸麻黃堿峰面積RSD為1.97%,鹽酸偽麻黃堿峰面積RSD為1.72%,結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.3”項(xiàng)益氣補(bǔ)肺膏供試品溶液(批號(hào):20190221),于室溫下存放,分別于0、2、4、6、8、12、18、24 h精密吸取供試品溶液10 μl,自動(dòng)進(jìn)樣于高效液相色譜中,鹽酸麻黃堿峰面積RSD為0.23%,鹽酸偽麻黃堿峰面積RSD為0.35%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.10 加樣回收試驗(yàn)[10]稱取同一批次益氣補(bǔ)肺膏(批號(hào):20190221;鹽酸麻黃堿含量0.25 mg/g;鹽酸偽麻黃堿含量0.13 mg/g)約2.5 g,精密稱取6份,置于帶玻璃塞的錐形瓶中。分別精密加入鹽酸麻黃堿對(duì)照品溶液(濃度0.5944 mg/ml)0.8、1.0、1.2 ml,鹽酸偽麻黃堿對(duì)照品溶液(濃度0.3116 mg/ml)0.8、1.0、1.2 ml,按“2.3”項(xiàng)制備供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定,鹽酸麻黃堿回收率為90.2%、RSD為1.93%,鹽酸偽麻黃堿回收率為86.4%、RSD為0.67%。表明該法回收率好,滿足回收率限度85%～110%的要求,見表1-2。

表1 鹽酸麻黃堿的加樣回收試驗(yàn) (n=6)

表2 鹽酸偽麻黃堿的加樣回收試驗(yàn) (n=6)

2.11 樣品含量測(cè)定 取3批益氣補(bǔ)肺膏(批號(hào):20190221、20190227和20190228)2.5 g,每批取2份,精密稱取6份,按“2.3”項(xiàng)進(jìn)行制備,精密吸取各10 μl,注入高效液相色譜儀,進(jìn)行含量測(cè)定,見表3。根據(jù)3批中試樣品麻黃中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿總含量為2.89%,由于藥材隨產(chǎn)地、批次不同,其含量略有差異,依據(jù)麻黃藥材鹽酸麻黃堿和鹽酸麻黃堿總量限度為不得少0.80%投料計(jì)算,制得成品的總含量為0.1 mg/g?？紤]到提取過程中偏差,故本品的含量限度定為每克含麻黃以鹽酸麻黃堿(C10H5NO·HCl)和鹽酸偽麻黃堿(C10H5NO·HCl)的總量計(jì),不少于0.1 mg。

表3 3批樣品含量測(cè)定

3 討 論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)角度認(rèn)為,麻黃先煮可降低揮發(fā)油成分。研究發(fā)現(xiàn),麻黃堿是麻黃發(fā)汗的主要成分,而麻黃中的麻黃堿大劑量使用會(huì)引起失眠不安、震顫等不良反應(yīng)。麻黃堿屬芳香胺類衍生物,常壓條件下有揮發(fā)性,易隨水蒸氣揮發(fā),故麻黃煎煮時(shí)間長(zhǎng)可降低麻黃堿含量[11]。鹽酸麻黃堿可治療支氣管哮喘和咳嗽等病癥,靜脈注射鹽酸麻黃堿主要治療低血壓,劑量范圍為0.7～1.0 mg/kg,口服劑量達(dá)到20 mg以上可能會(huì)產(chǎn)生心動(dòng)過速和心悸等不良反應(yīng)。鹽酸麻黃堿在生物體內(nèi)過量表現(xiàn)為類似甲基苯丙胺的性質(zhì),可引起神經(jīng)緊張、心跳加速、高血壓和癲癇。但現(xiàn)階段的研究中未對(duì)中藥制劑麻黃中的麻黃堿檢測(cè)設(shè)定上限和下限范圍,在用藥過程中是否存在一定的潛在使用風(fēng)險(xiǎn),應(yīng)引起業(yè)界的重點(diǎn)關(guān)注。

流動(dòng)相的優(yōu)化,對(duì)甲醇、乙腈與不同濃度的磷酸溶液進(jìn)行了考察,結(jié)果表明,酸的種類、濃度對(duì)鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的峰形影響大,最終確定了乙腈-0.1%磷酸溶液(含0.1%三乙胺)(3∶97)為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫時(shí),峰形好,保留時(shí)間適宜。提取方式的優(yōu)化,采用超聲處理(功率240 W,頻率45 kHz)和回流提取各30 min同時(shí)測(cè)定鹽酸麻黃堿與鹽酸偽麻黃堿兩種成分的含量,在甲醇40.0 ml條件下對(duì)兩種成分的提取效果較好,而提取方式對(duì)兩種成分含量無較大影響,鹽酸麻黃堿與鹽酸偽麻黃堿含量測(cè)定分別為0.21 mg/g、0.10 mg/g,結(jié)果一致,故選超聲處理進(jìn)行提取。提取時(shí)間的優(yōu)化,采用超聲處理(功率240 W,頻率45 kHz)分別提取30、60、90 min后,鹽酸麻黃堿含量在0.24～0.25 mg/g、鹽酸偽麻黃堿含量在0.12～0.13 mg/g,其結(jié)果表明提取時(shí)間不同30、60、90 min,但提取效果一致,故確定超聲提取時(shí)間為30 min。

利益沖突:所有作者聲明無利益沖突。