外源物質(zhì)對(duì)油茶花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)的影響

徐金銘, 常毅洪, 龔 涵, 龔文芳, 袁德義

(中南林業(yè)科技大學(xué) 林學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙 410004)

油茶(CamelliaoleiferaAbel.)是山茶科山茶屬常綠小喬木,是我國(guó)南方特有的重要木本油料樹(shù)種,與油棕、油橄欖和椰子并稱(chēng)為世界四大木本食用油料植物[1]。在開(kāi)花植物中,落在柱頭上的花粉萌發(fā)和花粉管在雌蕊組織中的生長(zhǎng)是植物有性繁殖的關(guān)鍵[2]。授粉成功是雙受精的先決條件?；ǚ勐涞街^后,花粉會(huì)附著、水合并萌發(fā)花粉管[3]?；ǚ酃芡ㄟ^(guò)柱頭細(xì)胞和花柱向胚珠生長(zhǎng),來(lái)自胚珠的吸引信號(hào)引導(dǎo)花粉管沿著株柄生長(zhǎng)并進(jìn)入胚珠的珠孔,最后,花粉管在退化的助細(xì)胞中停止生長(zhǎng),然后破裂釋放出兩個(gè)精細(xì)胞進(jìn)行雙受精[4]。體外花粉萌發(fā)提供了一種新的方法和策略來(lái)加速樹(shù)木育種的遺傳改良[5]。據(jù)報(bào)道,花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)會(huì)受到許多內(nèi)部和外部因素的影響[6]。影響花粉萌發(fā)的外在因素包括培養(yǎng)時(shí)間、溫度、濕度、培養(yǎng)基成分、pH值等[7-11],蔗糖、硼酸、激素、Ca2+、硝酸鈣、硝酸鉀和硫酸鎂等有機(jī)和無(wú)機(jī)物質(zhì)對(duì)花粉的體外萌發(fā)有影響[5,12-13]。此外,一氧化氮(NO)在植物發(fā)育過(guò)程中的許多生物和非生物脅迫中發(fā)揮著重要作用,包括花粉管生長(zhǎng)[14]。活性氧(reactive oxygen species,ROS)也調(diào)節(jié)植物的許多發(fā)育過(guò)程,如細(xì)胞增殖和分化、種子萌發(fā)、程序性細(xì)胞死亡、向地性、根毛發(fā)育、衰老等[15]。上述各物質(zhì)對(duì)油茶花粉萌發(fā)的影響鮮見(jiàn)報(bào)道。因此,本文探討了外源激素赤霉素(GA3)、生長(zhǎng)素(NAA)、乙烯利(ETH)、礦質(zhì)元素(Ca2+、Mg2+)、一氧化氮(NO)和活性氧(ROS)對(duì)油茶花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)的影響,研究結(jié)果將為調(diào)控油茶花粉萌發(fā)提供理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料采于湖南省長(zhǎng)沙市望城區(qū)中南林業(yè)科技大學(xué)油茶試驗(yàn)基地。該地區(qū)氣候?qū)賮啛釒Ъ撅L(fēng)氣候,年平均氣溫19.3 ℃,年平均降雨量1 380 mm,日照和熱量充足,雨量充裕。供試品種為‘華碩’。2020年11月采集花藥開(kāi)裂前1～2 d的帶花枝條,置于室內(nèi)水培待用,含苞欲放時(shí),用消毒的鑷子取出新鮮花藥置于硫酸紙袋中,放在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱烘12 h,再將散出的花粉收集起來(lái)放入醫(yī)用的潔凈青霉素小瓶中,于4 ℃冰箱保存待用[16-17]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外源物質(zhì)濃度配置

采取瓊脂培養(yǎng)基萌發(fā)法[18],以100 g·L-1蔗糖、10 g·L-1瓊脂、0.1 g·L-1H3BO3作為花粉離體培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基(對(duì)照,CK)。配置不同質(zhì)量濃度的溶液,GA3、NAA、乙烯利各設(shè)置3個(gè)質(zhì)量濃度梯度,分別為0.5、5、50 mg·L-1;MgSO4設(shè)置3個(gè)質(zhì)量濃度梯度,分別為10、30、50 mg·L-1;CaCl2·2H2O設(shè)置3個(gè)質(zhì)量濃度梯度,分別為50、150、450 mg·L-1;EGTA(乙二醇二乙醚二胺四乙酸)設(shè)置4個(gè)濃度梯度,分別為200、400、600、800 μmol·L-1;SNP(硝普鈉)和L-NNA(N′-硝基-L-精氨酸)設(shè)置3個(gè)濃度梯度,分別為100、200、300 μmol·L-1;H2O2和NAC(N-乙酰-L-半胱氨酸)設(shè)置3個(gè)濃度梯度,分別為100、300、500 μmol·L-1。

1.2.2 花粉離體培養(yǎng)

參照文獻(xiàn)[19]的方法,在天平上稱(chēng)取所需培養(yǎng)基材料,倒入錐形瓶中并依次標(biāo)記,然后加入定量蒸餾水,加熱煮沸至內(nèi)容物充分溶解,室溫冷卻至50 ℃左右后,加入計(jì)算好的每種藥物母液的體積,用玻璃棒攪拌使藥物溶液與培養(yǎng)基充分混合,然后倒入培養(yǎng)皿中。當(dāng)培養(yǎng)基變成固體后,用干凈毛刷蘸取少許花粉均勻撒于培養(yǎng)基表面,然后在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)2 h。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。2 h后,使用BX-53顯微鏡(Olympus,Tokyo,Japan)監(jiān)測(cè)花粉萌發(fā)。每個(gè)樣品(培養(yǎng)皿)隨機(jī)選擇5個(gè)光場(chǎng),每個(gè)光場(chǎng)包含不少于50個(gè)花粉粒[16,20]。之后,每隔2 h在顯微鏡下觀察花粉管長(zhǎng)度,直至24 h?；ǚ勖劝l(fā)的標(biāo)準(zhǔn)是花粉管的長(zhǎng)度超過(guò)花粉粒的直徑。

γ=(n/N)×100%。

式中:γ為發(fā)芽率,n為花粉萌發(fā)數(shù),N為花粉總數(shù)。

1.2.3 正交法優(yōu)化培養(yǎng)基成分

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果,選取對(duì)普通油茶花粉萌發(fā)影響較大的處理進(jìn)行正交試驗(yàn),試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。以正交表L10(34)安排試驗(yàn),來(lái)確定花粉萌發(fā)培養(yǎng)基中各種組分的最佳濃度組合。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用圖像處理軟件Image J來(lái)測(cè)量花粉管長(zhǎng)度;試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2016軟件整理,用Origin 2021軟件繪制圖表。使用SPSS 25.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA),在P≤ 0.05時(shí)使用Duncan的多重比較評(píng)估平均值之間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同外源物質(zhì)對(duì)花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)的影響

2.1.1 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的直接作用對(duì)普通油茶的花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)有影響(表2)。與對(duì)照組萌發(fā)率(54.78%)相比,隨著乙烯利質(zhì)量濃度的升高,花粉萌發(fā)率逐漸降低,50 mg·L-1乙烯利處理的花粉萌發(fā)率最低(4.37%)?；ǚ勖劝l(fā)率隨NAA質(zhì)量濃度升高先升高后下降,0.5 mg·L-1NAA處理的花粉萌發(fā)率(71.29%)顯著高于對(duì)照,50 mg·L-1NAA處理的花粉萌發(fā)率(2.86%)顯著低于對(duì)照。0.5、5 mg·L-1GA3處理的花粉萌發(fā)率與對(duì)照無(wú)顯著差異,50 mg·L-1GA3處理的花粉萌發(fā)率(4.90%)顯著低于對(duì)照。

表2 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理下油茶花粉萌發(fā)率與花粉管長(zhǎng)度Table 2 Pollen germination rate and pollen tube length of C. oleifera under different plant growth regulator treatments

培養(yǎng)2 h后對(duì)照組花粉管長(zhǎng)度為789.22 μm,50 mg·L-1乙烯利、NAA和GA3的培養(yǎng)基中,2 h后花粉管的平均長(zhǎng)度最小,分別為202.59 μm、127.83 μm和357.95 μm,顯著小于對(duì)照。0.5、5.0 mg·L-1乙烯利處理的花粉管長(zhǎng)度與對(duì)照組無(wú)顯著差異,0.5 mg·L-1NAA處理的花粉管長(zhǎng)度顯著大于對(duì)照組,0.5、5.0 mg·L-1GA3處理的花粉管長(zhǎng)度也顯著大于對(duì)照組。

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果,選取每種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑促進(jìn)或抑制效果最顯著的濃度(0.5 mg·L-1NAA、5 mg·L-1GA3和50 mg·L-1乙烯利)進(jìn)行處理,不同處理的油茶花粉管長(zhǎng)度見(jiàn)圖1。對(duì)照組在0～10 h花粉管生長(zhǎng)最快,10 h后開(kāi)始趨于緩慢,24 h花粉管長(zhǎng)度為2 619.61 μm。50 mg·L-1乙烯利處理的花粉管生長(zhǎng)十分緩慢,24 h的花粉管長(zhǎng)度僅為392.21 μm。0.5 mg·L-1NAA和5 mg·L-1GA3處理的花粉管生長(zhǎng)速率相近,0～12 h花粉管生長(zhǎng)較快,12 h后開(kāi)始趨于平緩,24 h花粉管長(zhǎng)度分別為2 820.70、2 865.57 μm(圖1)。在適當(dāng)?shù)臐舛确秶鷥?nèi),低質(zhì)量濃度的GA3和NAA促進(jìn)油茶花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng),而高濃度抑制,乙烯利的質(zhì)量濃度越高,油茶花粉萌發(fā)率越低,花粉管長(zhǎng)度越小。

圖1 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理對(duì)油茶花粉管生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effects of different plant growth regulator on pollen tube growth of C. oleifera

2.1.2 礦質(zhì)元素

外源礦質(zhì)元素的直接作用對(duì)普通油茶的花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)有影響(表3)。與對(duì)照組萌發(fā)率(54.78%)相比,隨著MgSO4、CaCl2·2H2O和EGTA濃度的升高,花粉萌發(fā)率逐漸降低,其中10 mg·L-1MgSO4處理的花粉萌發(fā)率顯著高于對(duì)照組,50 mg·L-1MgSO4處理的花粉萌發(fā)率與對(duì)照組無(wú)顯著差異;50 mg·L-1CaCl2·2H2O處理花粉萌發(fā)率顯著高于對(duì)照組,450 mg·L-1CaCl2·2H2O處理的花粉萌發(fā)率顯著低于對(duì)照組;200 μmol·L-1EGTA處理的花粉萌發(fā)率與對(duì)照組無(wú)顯著差異,400～800 μmol·L-1EGTA處理的花粉萌發(fā)率顯著低于對(duì)照組。

培養(yǎng)2 h后,對(duì)照組花粉管長(zhǎng)度為789.22 μm,花粉管長(zhǎng)度隨著MgSO4、CaCl2·2H2O、EGTA濃度的提高而變小,10 mg·L-1MgSO4處理的花粉管平均長(zhǎng)度最大,其次是50 mg·L-1CaCl2·2H2O處理,均顯著大于對(duì)照組;200～800 μmol·L-1EGTA 處理的花粉管長(zhǎng)度顯著小于對(duì)照組。

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,選取每種礦質(zhì)元素促進(jìn)或抑制效果最顯著的濃度(10 mg·L-1MgSO4、50 mg·L-1CaCl2·2H2O、800 μmol·L-1EGTA、800 μmol·L-1EGTA+50 mg·L-1CaCl2·2H2O共培養(yǎng))進(jìn)行處理,花粉管長(zhǎng)度見(jiàn)圖2。對(duì)照組在0～10 h花粉管生長(zhǎng)最快,10 h后開(kāi)始趨于緩慢,24 h花粉管長(zhǎng)度為2 619.61 μm。10 mg·L-1MgSO4和50 mg·L-1CaCl2·2H2O處理的花粉管生長(zhǎng)速率相近,0～8 h生長(zhǎng)速率最快,8 h后趨于緩慢,24 h花粉管長(zhǎng)度分別為2 809.56、2 770.11 μm。800 μmol·L-1EGTA 處理的花粉管0～2 h生長(zhǎng)最快,但整體速率緩慢,24 h花粉管長(zhǎng)度為1 061.06 μm。800 μmol·L-1EGTA+50 mg·L-1CaCl2·2H2O共培養(yǎng)處理在0～8 h花粉管生長(zhǎng)速率比800 μmol·L-1EGTA處理的速率快,24 h的花粉管長(zhǎng)度為1 311.04 μm,這說(shuō)明Ca2+可以減輕EGTA對(duì)花粉管生長(zhǎng)的抑制作用。

圖2 不同礦質(zhì)元素處理對(duì)油茶花粉管生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effects of different mineral elements on pollen tube growth of C. oleifera

綜上,一定濃度的Mg2+和Ca2+促進(jìn)油茶花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng),但濃度不宜過(guò)高,濃度過(guò)高反而會(huì)抑制。EGTA的濃度越高,油茶花粉萌發(fā)率越低,花粉管長(zhǎng)度越小。

2.1.3 化合物

SNP、H2O2和NAC處理均能降低花粉萌發(fā)率,且隨著濃度的升高,花粉萌發(fā)率逐漸降低;花粉萌發(fā)率隨著L-NNA濃度升高先升高后下降,200 μmol·L-1L-NNA萌發(fā)率最高,顯著大于對(duì)照組(表4)。

表4 不同化合物處理下油茶花粉萌發(fā)率與花粉管長(zhǎng)度Table 4 Pollen germination rate and pollen tube length of C. oleifera under different compound treatments

培養(yǎng)2 h后,100～300 μmol·L-1SNP花粉管長(zhǎng)度與對(duì)照組無(wú)顯著差異,200 μmol·L-1L-NNA處理的花粉管長(zhǎng)度顯著大于對(duì)照組,100～500 μmol·L-1H2O2和NAC處理的花粉管長(zhǎng)度均顯著小于對(duì)照組。

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,選取每種外源化合物促進(jìn)或抑制效果最顯著的濃度(300 μmol·L-1SNP、200 μmol·L-1L-NNA、500 μmol·L-1H2O2和500 μmol·L-1NAC)進(jìn)行處理,花粉管長(zhǎng)度見(jiàn)圖3。對(duì)照組在0～10 h花粉管生長(zhǎng)最快,10 h后開(kāi)始趨于緩慢,24 h花粉管長(zhǎng)度為2 619.61 μm。300 μmol·L-1SNP、200 μmol·L-1L-NNA和500 μmol·L-1NAC處理的花粉管生長(zhǎng)速率相近,均在0～6 h最快,之后略有降低,24 h的花粉管長(zhǎng)度分別為2 410.99、2 726.66、2 253.19 μm。500 μmol·L-1H2O2處理的花粉管整體生長(zhǎng)緩慢,24 h的花粉管長(zhǎng)度為僅為878.71 μm,顯著低于對(duì)照組(圖3)。

圖3 不同化合物處理對(duì)油茶花粉管生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effect of different compounds on the pollen tube growth of C. oleifera

外源NO和ROS均能抑制油茶花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng),且濃度越高,花粉萌發(fā)率越低,花粉管長(zhǎng)度越小。這是否由于濃度設(shè)置過(guò)高,導(dǎo)致內(nèi)源性ROS的平衡被打破,花粉管生長(zhǎng)受到抑制,還有待進(jìn)一步考究。

從單因素試驗(yàn)結(jié)果可以看出促進(jìn)花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)的外源物質(zhì)為NAA、GA3、CaCl2·2H2O、L-NNA、MgSO4,但它們濃度過(guò)高會(huì)產(chǎn)生抑制作用;抑制花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)的外源物質(zhì)(EGTA、SNP、NAC、H2O2)的濃度越高,花粉萌發(fā)率和花粉管長(zhǎng)度越小;因此,外源物質(zhì)的濃度對(duì)花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)有非常重要的影響。分析0～24 h 花粉管的長(zhǎng)度可知,50 mg·L-1乙烯利、800 μmol·L-1EGTA處理對(duì)花粉管生長(zhǎng)的抑制作用十分明顯,與對(duì)照組差異顯著。0.5 mg·L-1NAA、5 mg·L-1GA3、10 mg·L-1MgSO4、50 mg·L-1CaCl2·2H2O和200 μmol·L-1L-NNA處理的花粉管長(zhǎng)度顯著大于對(duì)照組。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表5和表6。油茶花粉培養(yǎng)2 h后,各處理組合的花粉萌發(fā)率和花粉管長(zhǎng)度均大于對(duì)照組。由極差分析可知, 參試的4個(gè)因素對(duì)普通油茶花粉萌發(fā)的影響程度從大到小依次是CaCl2·2H2O、MgSO4、NAA、GA3。根據(jù)各因素水平均值k的大小,可得最佳萌發(fā)培養(yǎng)基組合是A1B1C1D1,即100 g·L-1蔗糖、10 g·L-1瓊脂、0.1 g·L-1H3BO3、50 mg·L-1CaCl2·2H2O、10 mg·L-1MgSO4、0.5 mg·L-1NAA、2 mg·L-1GA3,這一組合也存在于9個(gè)處理組合中,即處理1,萌發(fā)率也達(dá)到了最高值(表5)。值得一提的是,在萌發(fā)方面,處理1的配方中各種成分濃度都是最小的,因此,處理1還具有經(jīng)濟(jì)友好的優(yōu)勢(shì)。

表5 油茶花粉萌發(fā)的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Orthogonal test results of pollen germination of C. oleifera

2 h后對(duì)照組的花粉管長(zhǎng)度最短,為1 056.62 μm,由極差分析可知,參試的4個(gè)因素對(duì)油茶花粉管生長(zhǎng)的影響大小依次為CaCl2·2H2O濃度>NAA濃度>MgSO4濃度>GA3濃度。根據(jù)均值k的大小可得,花粉管生長(zhǎng)的最佳培養(yǎng)基組合是A1B1C1D3(表6),即100 g·L-1蔗糖、10 g·L-1瓊脂、0.1 g·L-1H3BO3、50 mg·L-1CaCl2·2H2O、10 mg·L-1MgSO4、0.5 mg·L-1NAA、8 mg·L-1GA3。

表6 極差分析結(jié)果Table 6 Results of range analysis

綜上可知,CaCl2·2H2O對(duì)油茶花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)影響最大,GA3對(duì)油茶花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)影響最小。4個(gè)因素對(duì)花粉萌發(fā)與花粉管生長(zhǎng)都具有重要的影響,并且油茶花粉萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基配比和花粉管生長(zhǎng)的最佳培養(yǎng)基配比不同。

3 討論

植物花粉的萌發(fā)是一個(gè)復(fù)雜的生理過(guò)程和形態(tài)過(guò)程,涉及花粉管的極性生長(zhǎng)和管壁的構(gòu)建,有許多因素參與花粉萌發(fā)和花粉管的生長(zhǎng)過(guò)程,包括培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基pH值[7]、營(yíng)養(yǎng)[8]、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、濕度、溫度等[5,9-11,13]。

3.1 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑

許多與植物生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的生理過(guò)程都受到生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的影響[21]。曾令達(dá)等[22]研究表明,0.5～3.0 mg·L-1NAA對(duì)荔枝花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。本研究發(fā)現(xiàn),0.5 mg·L-1NAA促進(jìn)油茶花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng),而5 mg·L-1NAA抑制了花粉萌發(fā)。低濃度的NAA對(duì)植物花粉萌發(fā)的促進(jìn)作用明顯,物種不同,NAA的促進(jìn)作用也相近。Acar等[23]發(fā)現(xiàn),隨著GA3濃度的增加,雄性開(kāi)心果的花粉萌發(fā)減少,薛曉敏等[24]研究表明,高濃度的GA3會(huì)導(dǎo)致桃花花粉萌發(fā)能力喪失。本研究中,50 mg·L-1GA3也表現(xiàn)出非常顯著的抑制作用,這與薛曉敏等[24]的研究結(jié)果一致。曾令達(dá)等[22]認(rèn)為,20.0 mg·L-1乙烯利對(duì)荔枝花粉的萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)具有抑制作用。劉才宇等[25]發(fā)現(xiàn),乙烯利對(duì)番茄和茄子的花粉萌發(fā)均有不同的抑制作用。本研究中,不同濃度的乙烯利對(duì)油茶花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)均有抑制作用,且濃度越高抑制作用越明顯。說(shuō)明乙烯利在不同物種上對(duì)花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)都表現(xiàn)出一定的抑制作用,濃度越高,抑制作用越明顯,造成花粉管破裂、變形、彎曲,不能正常生長(zhǎng)發(fā)育。

3.2 礦質(zhì)元素

鎂在10～50 mg·L-1時(shí),對(duì)花粉發(fā)芽和花粉管生長(zhǎng)都有促進(jìn)作用[26]。硫酸鎂為100、300 mg·L-1時(shí)甘蔗花粉萌發(fā)率較高,0、400 mg·L-1時(shí)甘蔗花粉萌發(fā)率處于較低水平[27]。本試驗(yàn)中,10～50 mg·L-1MgSO4均可促進(jìn)油茶花粉萌發(fā),并且10 mg·L-1MgSO4的促進(jìn)效果最明顯,這與韓志強(qiáng)等[26]的研究結(jié)果一致。Mg2+對(duì)植物花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)有一定的作用,這與Mg2+的濃度密切相關(guān),濃度的高低在不同物種上的促進(jìn)作用差異較為明顯。

鈣是花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)的核心調(diào)節(jié)劑,它在花粉管生長(zhǎng)的各個(gè)方面都發(fā)揮著重要作用[28]。EGTA作為鈣離子的特異性螯合劑,主要與細(xì)胞壁上的細(xì)胞外Ca2+螯合,抑制花粉管頂端的Ca2+流入[29]。已有研究表明,Ca2+可以影響許多植物的花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)[28,30]。適當(dāng)濃度的Ca2+可促進(jìn)花粉萌發(fā),EGTA可抑制花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng),而外源Ca2+可逆轉(zhuǎn)EGTA的抑制作用[31]。Zhan等[32]指出,在一定濃度下,Ca2+可以促進(jìn)金合歡花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng),隨著濃度的增加,花粉的萌發(fā)率、花粉管長(zhǎng)度均增加,但隨著Ca2+濃度的繼續(xù)增加,花粉的萌發(fā)率下降。本研究中,50、150 mg·L-1CaCl2·2H2O促進(jìn)了花粉管的生長(zhǎng),而450 mg·L-1CaCl2·2H2O則抑制了花粉的萌發(fā),且CaCl2·2H2O是正交試驗(yàn)4個(gè)因素中對(duì)油茶花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)影響最大的因素。EGTA濃度越高,抑制作用越明顯,外源Ca2+可減輕EGTA對(duì)花粉管生長(zhǎng)的抑制作用,這進(jìn)一步驗(yàn)證了Ca2+對(duì)花粉管的重要作用,這些結(jié)果與上述其他人的研究結(jié)果一致。也有研究表明,不同作物花粉離體萌發(fā)所需的Ca2+濃度差異極顯著,植物花粉萌發(fā)對(duì)Ca2+需求的差異可能是植物進(jìn)化過(guò)程中對(duì)環(huán)境適應(yīng)的結(jié)果,具體原因有待進(jìn)一步的探究。

3.3 化合物

NO是一種參與生理過(guò)程的信號(hào)分子[33-34]。常溫下,SNP的施用抑制花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng),隨著SNP濃度的增加,抑制作用加強(qiáng)。NO抑制劑L-NNA處理可以減弱SNP處理對(duì)花粉萌發(fā)率和花粉管生長(zhǎng)的抑制作用[35]。使用NO清除劑或NOS抑制劑降低花粉細(xì)胞中NO含量,導(dǎo)致花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)減少,并導(dǎo)致嚴(yán)重的形態(tài)異常[36]。Duan等[37]報(bào)道了擬南芥中由FERONIA控制的機(jī)制,其中第1個(gè)花粉管到達(dá)胚珠會(huì)觸發(fā)NO在絲狀器中的積累,從而改變胚珠的條件并抑制其他花粉管的進(jìn)入。本研究發(fā)現(xiàn),100、200、300 μmol·L-1SNP抑制花粉管的生長(zhǎng);L-NNA促進(jìn)花粉管的生長(zhǎng),但濃度應(yīng)控制在一定范圍內(nèi),其中200 μmol·L-1L-NNA的促進(jìn)效果最好,這與李孝誠(chéng)[35]的試驗(yàn)結(jié)果一致,但與Pasqualini等[36]的結(jié)果不一致,這可能與物種不同有一定的關(guān)系,但NO對(duì)植物花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)的作用是顯而易見(jiàn)的。結(jié)合Duan等[37]的結(jié)果,NO抑制花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng),可能是因?yàn)镹O對(duì)誘導(dǎo)花粉管進(jìn)入胚珠的誘餌蛋白進(jìn)行了亞硝基化修飾,一方面可能會(huì)阻止其分泌,另一方面會(huì)使其失去誘導(dǎo)花粉管的活性。因此,花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)受到抑制。

在植物中,ROS作為有氧代謝的正常副產(chǎn)品或在環(huán)境壓力下產(chǎn)生[38],對(duì)多種生理過(guò)程很重要,但由于其高反應(yīng)性,ROS會(huì)破壞蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA[38-40]。當(dāng)ROS的產(chǎn)生超過(guò)其失活時(shí),會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激[38,41]。ROS在柏樹(shù)的花粉萌發(fā)和花粉管形成中具有信號(hào)傳導(dǎo)作用,NAD(P)H氧化酶抑制劑可以降低花粉細(xì)胞中的內(nèi)源性ROS含量,導(dǎo)致花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)減少[36]。在擬南芥中,來(lái)自花粉的不同肽類(lèi)與柱頭肽競(jìng)爭(zhēng)與柱頭受體激酶復(fù)合物的相互作用,導(dǎo)致柱頭處的ROS減少,從而使花粉水合和萌發(fā)[42]。本試驗(yàn)中,添加H2O2和NAC會(huì)降低花粉發(fā)芽率和花粉管長(zhǎng)度,推測(cè)適當(dāng)降低ROS的含量可以促進(jìn)花粉管的生長(zhǎng),但一旦內(nèi)源性ROS平衡被打破,花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)會(huì)受到抑制,這值得進(jìn)一步探討。

4 結(jié)論

油茶花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)受到激素、礦質(zhì)元素(Ca2+、Mg2+)、化合物(一氧化氮(NO)、活性氧(ROS)等外源物質(zhì)的影響。其中,Ca2+、Mg2+與適當(dāng)濃度的GA3、NAA促進(jìn)花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng),而乙烯利、NO和ROS對(duì)花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)起抑制作用。CaCl2對(duì)油茶花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)影響最大,GA3對(duì)油茶花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)影響最小。油茶花粉離體萌發(fā)最佳配比為100 g·L-1蔗糖、10 g·L-1瓊脂、0.1 g·L-1H3BO3、50 mg·L-1CaCl2·2H2O、10 mg·L-1MgSO4、0.5 mg·L-1NAA和2 mg·L-1GA3,油茶花粉管離體生長(zhǎng)的最佳配比為100 g·L-1蔗糖、10 g·L-1瓊脂、0.1 g·L-1H3BO3、50 mg·L-1CaCl2·2H2O、10 mg·L-1MgSO4、0.5 mg·L-1NAA和8 mg·L-1GA3。