產KPC酶肺炎克雷伯菌對頭孢他啶/阿維巴坦耐藥機制研究進展

鄭媚　匡徐　李甫豪　馮可瑩　于洋

摘要：頭孢他啶/阿維巴坦（Ceftazidime/Avibactam，CZA）是頭孢他啶和一種新型β-內酰胺酶抑制劑（阿維巴坦）的組合，已被美國食品藥品監(jiān)督管理局和國家市場監(jiān)督管理總局批準，主要用于治療復雜的腹部和尿道感染、醫(yī)院獲得性細菌性肺炎和呼吸機相關的細菌性肺炎，特別是由肺炎克雷伯菌引起的感染和炎癥。然而，CZA臨床應用導致了多重耐藥肺炎克雷伯菌的出現(xiàn)。其耐藥機制主要有三種：blaKPC基因的突變、細菌細胞膜孔蛋白突變和KPC酶的表達量增加。本文就耐CZA的肺炎克雷伯菌流行情況和耐藥機制進行綜述，旨在為臨床防治CZA的耐藥菌株提供科學依據(jù)，并為新藥開發(fā)提供指導。

關鍵詞：產KPC酶肺炎克雷伯菌；頭孢他啶；阿維巴坦；耐藥機制；作用機理；突變

中圖分類號：R978.1? ? ? ? 文獻標志碼：A? ? ? ? ?文章編號：1001-8751（2023）03-0160-06

Research Progress on the Resistance Mechanism of KPC-Producing Klebsiella pneumoniae to Ceftazidime/Avibactam

Zheng Mei1，? ?Kuang Xu1，? ?Li Fu-hao1，? ?Feng Ke-ying2，? ?Yu Yang1

（1 South China Agricultural University，Guangzhou 510642；2 Feipeng Biotechnology Co.， Ltd，Dongguan 523808）

Abstract： Ceftazidime/avibactam （CZA） is a combination of ceftazidime and a novel β-lactamase inhibitor （avibactam） approved by the U.S. Food and Drug Administration and the State Administration of China for the treatment of complex abdominal and urinary tract infections， hospital-acquired bacterial pneumonia， and ventilator-associated bacterial pneumonia， particularly those caused by Klebsiella pneumoniae. However， the clinical use of CZA has led to the emergence of multidrug-resistant Klebsiella pneumoniae. There are three main mechanisms of drug resistance： mutation of blaKPC， mutation of cell membrane pore protein， and increased expression of KPC enzyme. The article reviews the prevalence and mechanism of Klebsiella pneumoniae resistant to CZA， aiming to provide scientific basis for the clinical prevention and treatment of drug-resistant strains of CZA and provide guidance for the development of new drugs.

Key words： KPC-producing Klebsiella pneumoniae；ceftazidime ；avibactam ；drug resistance； mechanism? mechanism of action；mutation

1 碳青霉烯類耐藥的肺炎克雷伯菌（CRKP）流行現(xiàn)狀

據(jù)估計，在世界范圍內，因細菌感染引起的死亡人數(shù)每年可達700，000，預計到2050年，將有1000萬人死于多重耐藥性微生物引起的相關疾病[1]?？股啬退幮砸殉蔀楫斀褡罹o迫的公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)之一，而肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）是一種重要的革蘭陰性機會致病菌，具有超強的環(huán)境適應能力，除污水、土壤、地表水、工業(yè)廢水和植被外，肺炎克雷伯菌還可寄居在易感人類和動物粘膜表面，并誘導局部組織感染，包括尿路感染、菌血癥、肺炎及肝膿腫等，或誘發(fā)全身性感染，如敗血癥等，甚至危及患者生命[2-3]。肺炎克雷伯菌被列為ESKAPE病原體，已成為我國僅次于大腸埃希菌的第二大革蘭陰性致病菌，其菌體細胞內可攜帶多種高效的可移動性抗菌藥物耐藥性維持和傳播的遺傳元件，是抗生素耐藥性（Antimicrobial Resistance，AMR）在人、動物和環(huán)境中傳播的重要媒介。在抗菌藥物壓力下，由于這些質粒、轉座子、插入序列等可移動元件，肺炎克雷伯菌已進化出多種抗菌藥耐藥性表型，且耐藥基因在種屬間及跨種屬間廣泛傳播，導致出現(xiàn)了具有“超級耐藥性”的泛耐藥菌株（Extensive drug resistance，XDR）[4]。碳青霉烯類耐藥的肺炎克雷伯菌（Carbapenems resistant K. pneumoniae， CRKP）在國內外有越來越多的報道。在意大利，美國紐約州感染CRKP引起的死亡率分別為41.6%和48%。其中，ST258以及ST512是CRKP在美洲和南歐的主要克隆株[5-6]。值得注意的是，根據(jù)我國抗菌藥物監(jiān)測網(wǎng)絡（CHINET）報道顯示，在我國肺炎克雷伯菌對美羅培南和亞胺培南的耐藥率上升 8 倍以上[7]。近十年間， CRKP在我國廣泛傳播，流行范圍幾乎覆蓋了所有省份，且引起了較高的臨床發(fā)病率；其中基因型ST11是我國CRKP感染中最主要的MLST分型[8]。而ST11和ST258屬于克隆復合物CC258，其包含ST11、ST258和另外五個分型ST270、ST340、ST379、ST407和ST418 [9]。此外，新出現(xiàn)的ST307也被認為是一種高?？寺⌒?，其在醫(yī)院的高流行率應該引起重視[10]。CRKP菌株中碳青霉烯酶編碼基因包括KPC、NDM、OXA、IMP、VIM，最主要的碳青霉烯酶基因是blaKPC-2，blaNDM-1，blaOXA-48，其中ST11型攜帶blaKPC-2的肺炎克雷伯菌的克隆傳播速度驚人[11]。CRKP感染通常具有較高的發(fā)病率和死亡率，給臨床治療帶來了嚴峻的挑戰(zhàn)[12 -13]。

2 CZA使用現(xiàn)狀以及作用機理

目前用于治療CRKP感染的抗生素選擇十分有限，主要包括多黏菌素、替加環(huán)素和氨基糖苷類藥物，因此亟需有效的治療CRKP感染的方法。頭孢他啶/阿維巴坦（CZA）由阿斯利康制藥有限公司開發(fā)，于2015年2月獲得美國食品和藥物管理局批準[14-15]，并于2019年底在中國投入使用。它將廣譜頭孢菌素頭孢他啶與新型非β-內酰胺酶抑制劑阿維巴坦結合，用于治療復雜的腹部和尿道感染、醫(yī)院獲得性細菌性肺炎和呼吸機相關的細菌性肺炎[16]。毫無疑問，CZA的出現(xiàn)為對抗CRKP感染提供了十分寶貴的替代方案。值得注意的是，盡管CZA對大多數(shù)碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌都是敏感的，但是在我國臨床使用CZA之前就已經(jīng)出現(xiàn)了對該藥物的耐藥菌[17]。有研究表明，KPC-2單個基因替換突變使得阿維巴坦對KPC的β-內酰胺酶失去抑制作用[18]，以及突變的KPC-3酶顯著降低了肺炎克雷伯菌對CZA的易感性[19]。一方面阿維巴坦可以保護頭孢他啶免受KPCs、OXA-48、AmpC等β-內酰胺酶的水解，但無法抵抗金屬β-內酰胺酶（MBLs），如NDM、VIM或IMP的水解。因此，阿維巴坦可恢復頭孢他啶對KPC陽性肺炎克雷伯菌（KPC-Kp）的活性，在受到KPC酶親核進攻后，阿維巴坦的酰胺鍵斷開，從而開環(huán)與酶形成共價結合物，進而達到抑制效果。與他唑巴坦、克拉維酸等經(jīng)典的“自殺式酶抑制劑”不同的是，酶-抑制劑復合體不發(fā)生水解，經(jīng)環(huán)合形成內酰胺環(huán)可又形成阿維巴坦，因此具有長效抑酶作用[20]。

3 產KPC酶肺炎克雷伯菌對CZA的耐藥機制

據(jù)報道，KPC-Kp對CZA的耐藥機制主要有三種，包括blaKPC基因的突變所引起的KPC酶上的氨基酸取代/缺失/插入，KPC酶的表達量增加和細菌細胞膜孔蛋白突變。

3.1 blaKPC基因的突變

blaKPC基因由879個堿基組成，當基因發(fā)生突變時，會引起肺炎克雷伯菌所表達的KPC酶發(fā)生變化，當blaKPC基因出現(xiàn)堿基置換時，其結果對應的是氨基酸的單取代或多取代；當blaKPC基因出現(xiàn)多個堿基缺失和插入時，其結果對應的是KPC酶的氨基酸缺失或者插入，值得注意的是，臨床上所出現(xiàn)的blaKPC基因變體所插入或者缺失的堿基數(shù)均是3的倍數(shù)，所以并未出現(xiàn)移碼突變而導致KPC酶的結構大幅改變。近年來，攜帶blaKPC基因亞型的肺炎克雷伯菌在世界范圍內迅速出現(xiàn)，自2020年以來報告的新型KPC酶變體數(shù)量超過了前17年的總和。迄今為止，NCBI參考基因目錄共收錄了123個KPC酶變體，其中有16個變體來自臨床報道的CZA耐藥肺炎克雷伯菌，于表1中列出。

總體而言，導致肺炎克雷伯菌對CZA耐藥產生的blaKPC基因突變以置換為主，表現(xiàn)為KPC酶的氨基酸取代。其中，以第179位的天冬氨酸被其余氨基酸取代最為常見。研究顯示在一株分型為ST258的臨床肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)了KPC-3變體Asp179Tyr，命名為KPC-33；另有研究報道在一株分型為ST11的臨床菌株中發(fā)現(xiàn)了KPC-2變體Asp179Ala，命名為KPC-78；這些菌株對CZA的敏感性均下降，其對CZA的最小抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration， MIC）與親本菌株相比分別上升了64倍和16倍[17-18]。研究顯示通過定點飽和突變技術獲得了19種不同的Asp179變異體，并使用質譜分析和比較酶促動力學參數(shù)確定了一種特別值得關注的變異體—Asp179Asn，其可以幫助肺炎克雷伯菌對多種β-內酰胺類藥物和β-內酰胺類抑制劑的組合產生抗性[23]。Alsenani等[24]在分析了Asp179N和Asp179Tyr的晶體結構之后，發(fā)現(xiàn)Asp179Asn和Asp179Tyr的存在破壞了Ω環(huán)上鹽橋的穩(wěn)定性，從而使得KPC酶更容易與頭孢他啶結合，從而使得肺炎克雷伯菌對CZA耐藥。同樣的機理可以用以解釋KPC-39（Ala172Thr）和KPC-46（Leu168Phe）變體所引起的CZA抗性，因為它們的突變位點也處于KPC酶的Ω環(huán)上（Arg164 – Asp179），其上的突變會導致分子間的氫鍵作用減弱，從而使得Ω環(huán)結構變得不穩(wěn)定而易于頭孢他啶結合；同時，有研究報道Ω環(huán)上鹽橋被破壞后，會使得KPC酶與阿維巴坦的親和力降低，從而使得阿維巴坦不能有效抑制KPC酶。

除氨基酸取代外，由于KPC酶上出現(xiàn)氨基酸插入和缺失等突變而引起的CZA耐藥在近幾年也時有發(fā)生。Niu等[25]在紐約分離的一株臨床肺炎克雷伯菌中，存在 KPC-14變體，該變體是由KPC-2缺失第242位甘氨酸和第243位蘇氨酸而形成；在將blaKPC-2和blaKPC-14基因克隆并構建到pET-28質粒后，并比較了KPC-2和KPC-14的酶促動力學參數(shù)，發(fā)現(xiàn)了 KPC-14對于頭孢他啶的親和力明顯上升，因此可以介導CZA的耐藥。研究報道在瑞士分離的一株臨床肺炎克雷伯菌中，發(fā)現(xiàn)了KPC-3的變體，命名為KPC-50，其在276至277位插入了谷氨酸、丙氨酸和纈氨酸等三個氨基酸；Shi等[26]也確定了新變體KPC-76和KPC-79，它們都在KPC-2的第261位至262位中插入了纈氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、精氨酸、丙氨酸、脯氨酸和天冬酰胺七個氨基酸，KPC-76和KPC-79的區(qū)別在于前者多一個Asp179Tyr突變。耐人尋味的是，Shi等提到了在治療KPC-kp感染中KPC酶多次突變的現(xiàn)象，在治療9 d后，KPC-2突變成了KPC-79，隨后又在CZA治療21 d后突變成了KPC-76，但后期使用美羅培南進行治療后又恢復突變成KPC-2，這說明了KPC酶具有高度的靈活性以幫助宿主適應環(huán)境的威脅。

值得注意的是，有多項研究報道了攜帶KPC變體的肺炎克雷伯菌對除頭孢他啶外其他β-內酰胺類藥物的敏感性逆轉，這一方面提示了美羅培南等β-內酰胺類藥物可以作為治療CZA耐藥肺炎克雷伯菌感染的備選方案，另一方面卻增加了快速檢測KPC-Kp的難度，因為其對β-內酰胺類藥物的MIC值較低而無法被篩選。

3.2 膜孔蛋白突變和KPC酶高表達

KPC-Kp的膜孔蛋白突變和KPC酶的高表達均可導致細菌對CZA耐藥，并且在某些時候這兩種因素是偶聯(lián)在一起的。膜孔蛋白發(fā)揮著重要的生理作用，可以促進小分子親水性溶質的流入，并促進有毒物質通過原本不透水的革蘭陰性外膜的流出。與CZA耐藥相關的細菌膜孔蛋白主要包括OmpC和OmpF，其中尤以OmpK35和OmpK36最受關注，也是近年來研究的熱點[32-33]。OmpK35和OmpK36的整體結構顯示出與其他一般孔蛋白相似的特征，即由16個β-折疊片組成的三聚體結構?？椎鞍字械膬蓚€重要結構成分是細胞外L3和L4區(qū)域[38]（Major nonspecific porins are matrix porin，OmpF）。Humphries等[39]將CZA耐藥株KP1244和敏感株KP1245比較分析后，發(fā)現(xiàn)前者的ompK35基因由于發(fā)生了移碼突變，導致OmpK35不能正常表達而變成了一個非功能性孔蛋白。此外，前者與后者相比在ompK36中存在一個突變—Thr333Asn；進一步研究發(fā)現(xiàn)，將野生型ompK36轉移到KP1244后，其對CZA的MIC值降低了，說明Thr333Asn突變可以介導KPC-Kp的低水平耐藥。Castanheira等[40]也證明了在ompK36的L3區(qū)域產生的突變可以導致細菌對于頭孢他啶的MIC值上升（表2）。KPC酶的高表達也是近年來導致CZA耐藥的原因之一。2017年有報道通過熒光定量PCR技術發(fā)現(xiàn)一株耐CZA的KPC-3陽性肺炎克雷伯菌中blaKPC基因的表達量是敏感菌株的3.8倍[34-36]。Zhang等[42]對12株CZA耐藥的KPC-Kp研究后發(fā)現(xiàn)，耐藥菌株可通過增加blaKPC-2所在質粒的拷貝數(shù)從而介導KPC酶的高表達；值得注意的是，在將酶抑制劑阿維巴坦的濃度提升之后，大部分耐藥菌株可以恢復對CZA的敏感性，說明耐藥菌株中KPC酶量的增加使得阿維巴坦的量相對不足而導致耐藥。Coppi等[44]也發(fā)現(xiàn)KPC-Kp通過多拷貝攜帶blaKPC-3的轉座子Tn4401a從而使得blaKPC-3基因高表達，同時研究也發(fā)現(xiàn)blaKPC-3基因高表達跟外膜蛋白的結構變化相關，blaKPC-3基因高表達使得細菌的膜孔蛋白的通透性降低，從而導致對CZA的耐藥性升高。但是，在Sun等[44]的研究中，blaKPC基因的突變和其高表達共同導致了KPC-Kp對CZA的抗性增加，然而其膜孔蛋白的突變對CZA的易感性并無影響。

4 小結和展望

綜上所述，KPC陽性肺炎克雷伯菌對 CZA產生耐藥性主要是由于blaKPC基因的突變、細菌細胞膜孔蛋白突變和KPC酶的表達量增加，這三種機制有可能同時出現(xiàn)而導致KPC-Kp對CZA的高水平耐藥。針對KPC-Kp的感染，在使用CZA進行治療的同時，臨床醫(yī)生應當密切關注KPC-Kp對美羅培南等碳青霉烯類抗生素的敏感性變化，依據(jù)實際情況進行聯(lián)合用藥和輪換用藥。

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收稿日期：2022-11-06

作者簡介： 鄭媚，碩士研究生，主要從事細菌耐藥性研究。

*通訊作者：于洋，副教授，主要從事細菌耐藥性以及藥動藥代等研究。