細(xì)菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)及其抑制劑研究進(jìn)展

陳棟梁　班曼曼　朱夢(mèng)晗　王霄旸　王春梅　周文　張可煜

摘要：隨著耐藥性的發(fā)展，抗生素的應(yīng)用面臨著嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，通過抑制劑來抑制細(xì)菌生長而不尋求直接殺滅細(xì)菌成為一種新的抗細(xì)菌感染策略。細(xì)菌分泌系統(tǒng)是效應(yīng)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的通道，在效應(yīng)蛋白分泌過程中發(fā)揮重要作用，在抗細(xì)菌感染策略中被作為優(yōu)先選擇對(duì)象。其中細(xì)菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)（T3SS）結(jié)構(gòu)復(fù)雜，功能卻相對(duì)保守，是眾多重要效應(yīng)分子轉(zhuǎn)運(yùn)的必經(jīng)路徑，已成為抑制劑選擇的熱點(diǎn)靶標(biāo)。本文就細(xì)菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)、功能研究進(jìn)展及其抑制劑的發(fā)展進(jìn)行闡述，為其通過抑制T3SS的抗細(xì)菌感染，新型抑制劑開發(fā)以及減緩細(xì)菌耐藥的研究提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：細(xì)菌分泌系統(tǒng)；T3SS；抑制劑；耐藥性； 細(xì)菌；化合物

中圖分類號(hào)：R978.1? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? ? ?文章編號(hào)：1001-8751（2023）03-0192-10

Research Progress of Bacterial Type Ⅲ Secretion System and its Inhibitors

Chen Dong-liang1，? ?Ban Man-man2，? ?Zhu Meng-han1，? ?Wang Xiao-yang1，

Wang Chun-mei1，? ?Zhou Wen1，? ?Zhang Ke-yu1

（1 Key Laboratory of veterinary chemicals and preparations， Ministry of agriculture and rural areas，

Shanghai Institute of veterinary medicine， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Shanghai 200241;

2? Henan Animal Quarantine Station，Zhengzhou? 450008）

Abstract： With the development of drug resistance， the application of antibiotics is facing challenges. Instead of seeking to kill bacteria， inhibiting the growth of bacteria through inhibitors has become a new anti-infection strategy. The bacterial secretion system is the channel of effector protein transport， which plays an important role in the process of effector protein secretion， and has become the preferred target of bacteriostatic strategy. The type Ⅲ secretion system， which is a necessary pathway for the transport of many important effector molecules， has become a hot target for inhibitor selection. In this paper， the structure and function of the type Ⅲ secretion system of bacteria and the development of inhibitors are reviewed， so as to provide a theoretical basis for the study of anti-bacterial infection by inhibiting the type Ⅲ secretion system， the development of new inhibitors and the mitigation of bacterial drug resistance.

Key words： bacterial secretion system； T3SS；inhibitor； antibiotic resistance；bacteria；antibiotic

1 前言

當(dāng)前細(xì)菌耐藥性愈發(fā)嚴(yán)重，已經(jīng)成為人類迫切需要解決的全球公共衛(wèi)生問題。以新型抗菌靶點(diǎn)研發(fā)新的抗菌藥物的耐藥性應(yīng)對(duì)策略不僅需要耗費(fèi)大量成本和時(shí)間，也會(huì)帶來誘發(fā)新的耐藥表型和機(jī)制的潛在威脅[1-2]。老藥新用的策略也存在篩選庫容量有限，命中率低以及老藥本身所具有的副作用可能危害機(jī)體等問題[3]。近年來，隨著研究的深入，不尋求直接殺滅病原菌，而是通過抑制病原菌的致病力，減輕或緩解病原菌對(duì)機(jī)體造成的直接危害，并依靠自身防御系統(tǒng)恢復(fù)機(jī)體健康，已經(jīng)逐步成為一種新型抗耐藥細(xì)菌感染的策略[4]。這是因?yàn)椴≡鷮?duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性的根本驅(qū)動(dòng)力可歸因于抗生素對(duì)其生長的脅迫作用巨大，而抑制病原菌的致病力作為一種選擇壓力較小，不直接影響細(xì)菌生長的抗感染方式，理論上細(xì)菌對(duì)其產(chǎn)生耐藥抵抗的驅(qū)動(dòng)力很小。病原菌的致病力主要依賴于毒力因子，常見的毒力因子包括毒素、細(xì)胞溶素、蛋白酶等毒性分子以及分泌系統(tǒng)、菌毛、鞭毛等細(xì)菌特有的毒性裝置[5]。其中細(xì)菌分泌系統(tǒng)（Bacterial secretion system）是細(xì)菌重要的毒力因子，承擔(dān)著胞內(nèi)效應(yīng)分子轉(zhuǎn)運(yùn)至宿主的重要功能，是一種選擇壓力較小，理論上不易產(chǎn)生耐藥性的優(yōu)良抗感染途徑。因此，細(xì)菌分泌系統(tǒng)及其抑制藥物研究越來越受重視，成為當(dāng)前抗菌感染藥物研究的重點(diǎn)。

細(xì)菌分泌系統(tǒng)是一類存在于細(xì)菌細(xì)胞膜上由大分子復(fù)合物組成的分子機(jī)器，承擔(dān)各種致病相關(guān)效應(yīng)蛋白和遺傳物質(zhì)的分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)，為多種細(xì)菌的效應(yīng)物提供分泌途徑[6]。分泌系統(tǒng)的有些結(jié)構(gòu)對(duì)于細(xì)菌病原體來說是獨(dú)一無二的，對(duì)細(xì)菌毒力乃至至關(guān)重要，并影響著細(xì)菌的生存及致病能力。這些重要的作用促進(jìn)了人們對(duì)細(xì)菌分泌系統(tǒng)的研究不斷深入。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了9種細(xì)菌分泌系統(tǒng)（即T1SS～T9SS）[7]，其中Ⅲ型分泌系統(tǒng)（Type Ⅲ secretory system，T3SS）主要存在于革蘭陰性菌中[8]，因其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)與功能，成為近年來分泌系統(tǒng)研究的重點(diǎn)，相應(yīng)地也出現(xiàn)了許多能抑制T3SS組成和功能的抑制劑。本文從T3SS結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、分泌過程、潛在作用靶點(diǎn)、抑制劑等方面進(jìn)行綜述，為新型T3SS抑制劑的進(jìn)一步探索和發(fā)現(xiàn)提供理論依據(jù)。

2 T3SS的結(jié)構(gòu)

T3SS是形狀類似于小注射器，由多種蛋白組成的分子機(jī)器，在進(jìn)化和結(jié)構(gòu)上與細(xì)菌鞭毛有關(guān)[9]，其功能與細(xì)菌定植、存活和復(fù)制有關(guān)[10]。革蘭陰性菌通?？杀磉_(dá)兩類T3SSs，一類被注入復(fù)合體或針狀復(fù)合物，簡稱iT3SS，可將細(xì)菌胞質(zhì)中的效應(yīng)蛋白或毒力因子轉(zhuǎn)運(yùn)至宿主細(xì)胞，從而調(diào)控宿主細(xì)胞的代謝過程及細(xì)菌與宿主細(xì)胞的相互作用[8]；另一類是編碼細(xì)菌的鞭毛，簡稱fT3SS，可調(diào)控細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)能力[11]。本文主要介紹的是iT3SS。

形似于小注射器的T3SS含有許多高度保守的結(jié)構(gòu)成分，主要由針狀復(fù)合物、轉(zhuǎn)運(yùn)孔、內(nèi)桿蛋白、胞質(zhì)環(huán)與分選平臺(tái)、底物輸出裝置、基底等裝置組成[12]，是9種分泌系統(tǒng)中最為復(fù)雜的一種[7]。由于組成T3SS各結(jié)構(gòu)成分在不同物種間命名不同，其中在耶爾森菌系統(tǒng)中編碼分泌裝置的基因被命名為Ysc，研究人員在此基礎(chǔ)上使用其后綴，將Ⅲ型分泌系統(tǒng)分泌裝置基因稱為Sct，用于分泌和細(xì)胞易位，本文則采用標(biāo)準(zhǔn)化的“Sct”進(jìn)行描述。

2.1 針狀復(fù)合物

T3SS的核心結(jié)構(gòu)為針復(fù)合物（Needle complex ， NC），是一種低聚膜包埋復(fù)合物，它是一種大型的圓柱形大分子復(fù)合物，嵌入細(xì)菌的內(nèi)膜和外膜中，跨越質(zhì)周空間，并通過針絲延伸到細(xì)胞外環(huán)境[13]。這些絲狀結(jié)構(gòu)允許這些病原體通過宿主細(xì)胞黏液屏障，在與靶細(xì)胞接觸時(shí)，在宿主膜中組裝一個(gè)易位孔[12]，通過該易位孔注入效應(yīng)蛋白[14]。

2.2 轉(zhuǎn)運(yùn)孔

轉(zhuǎn)運(yùn)孔是由T3SS轉(zhuǎn)運(yùn)子SctB和SctE在宿主細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層中形成的異源低聚復(fù)合體。SctB和SctE是親水性的，能夠插入宿主質(zhì)膜上，然后它們寡聚形成易位子孔[15]。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)運(yùn)孔的組裝和對(duì)接需要借助宿主細(xì)胞的趨化因子受體、表面硫酸化和巖藻糖化、波形中間絲蛋白等。

2.3 內(nèi)桿蛋白

內(nèi)桿蛋白由SctI亞基螺旋組裝而成，通過“插座”結(jié)構(gòu)連接到內(nèi)膜環(huán)上，可將針狀復(fù)合物錨定到基體[16]。研究表明，SctR和SctT的周質(zhì)結(jié)構(gòu)域與內(nèi)桿蛋白SctI有一定聯(lián)系。SctR、SctT和SctI的密切相互作用可能會(huì)為底物易位創(chuàng)建連續(xù)的導(dǎo)管，其中SctI可以作為適配器將內(nèi)膜的扁平易位孔與螺旋針絲連接起來，從而為底物從細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)易位到宿主細(xì)胞創(chuàng)造了連續(xù)的管道[17]。

2.4 胞質(zhì)環(huán)與分選平臺(tái)

胞質(zhì)環(huán)（SctQ）也稱C環(huán)[15]，位于底物輸出裝置下方，與ATPase 復(fù)合體（SctN、SctO和SctL）一起組成底物的裝載和分選平臺(tái)[18]，是一種對(duì)于T3SS至關(guān)重要的外周膜相關(guān)蛋白[15]。其中，胞質(zhì)環(huán)負(fù)責(zé)底物的裝載與卸載，ATPase復(fù)合體為整個(gè)T3SS的運(yùn)行提供能量。在分選平臺(tái)中，ATPase復(fù)合體中的SctN由連接蛋白SctO錨定在SctV的異構(gòu)環(huán)上，從而連接ATPase復(fù)合體與底物輸出裝置[19]。而SctQ和 SctK位于SctL的輻條末端，為SctN提供對(duì)接位點(diǎn)，將SctN錨定在胞質(zhì)環(huán)上，并調(diào)節(jié)其活性[15， 20]。

2.5 輸出裝置

底物輸出裝置位于基底下方，嵌入在內(nèi)膜中，充當(dāng)?shù)孜锏娜肟?，由SctR、SctS、SctT、SctU和SctV等5種膜蛋白組裝而成[17]。SctV及其同系物的大細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域形成一個(gè)非絳化環(huán)，在底物的切換和易位中發(fā)揮重要作用[21]；SctU及其同系物在早期分泌到中晚期底物分泌的特異性轉(zhuǎn)換中起作用；基本輸出裝置組分SctR、SctS和SctT在針復(fù)合物的組裝和分泌過程中起著重要作用，組分中五個(gè)SctR和一個(gè)SctT組成一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)。另外，實(shí)驗(yàn)證實(shí)SctR、SctS、SctT、SctU的復(fù)合物在摻入針復(fù)合物基質(zhì)之前在體內(nèi)組裝，并且這四個(gè)輸出裝置組件在SctR五聚體能夠形成具有多種相互作用的緊湊組件[9， 17]。實(shí)驗(yàn)研究還表明，SctS，SctT和SctU不纏繞在SctR五聚體周圍，而是在SctR的一側(cè)形成一個(gè)緊湊的組件，其中SctS是與所有其他組件接觸的中心組件。SctS，SctT和SctU形成的組裝還可以促進(jìn)SctR孔的門控，這對(duì)于防止?fàn)I養(yǎng)和離子泄漏穿過細(xì)菌內(nèi)膜產(chǎn)生有害影響具有重要作用[17]。

2.6 基底

T3SS基底是嵌在細(xì)菌內(nèi)外膜上的一系列環(huán)狀結(jié)構(gòu)，主要由SctC（InvG）、SctD（PrgH）和SctJ（PrgK）構(gòu)成，其中SctC形成外膜環(huán)，SctJ和SctD在內(nèi)膜上形成同心環(huán)。三者都含有1個(gè)結(jié)構(gòu)保守的楔形折疊，這是內(nèi)膜環(huán)和外膜環(huán)共同的成環(huán)基序，有助于環(huán)的組裝[7， 22]。SctC的N端結(jié)構(gòu)域深入周質(zhì)，與SctD直接接觸，實(shí)現(xiàn)內(nèi)外膜的連接。

SctC位于細(xì)菌外膜內(nèi)，是細(xì)菌分泌系統(tǒng)中不可缺少的細(xì)胞外環(huán)境的大門戶。SctC結(jié)構(gòu)是一個(gè)巨大的雙層β管狀結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)域形成一個(gè)八鏈β夾，在細(xì)胞外末端分開。外層β片構(gòu)成外壁，內(nèi)層β片形成一個(gè)紐結(jié)的反平行桶，即支撐外壁又形成內(nèi)部的“周質(zhì)門”[23]。同源性區(qū)域由N端周質(zhì)區(qū)域和高度保守的蛋白酶耐藥C端區(qū)域組成。不僅為細(xì)菌蛋白在內(nèi)膜的擠出提供了通道，而且還在其周圍質(zhì)面上與各種輸出裝置的其他組分提供了關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)界面[22]。在這些結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)對(duì)“注射體”的整體組裝和穩(wěn)定產(chǎn)生了巨大作用。

3 T3SS的調(diào)節(jié)分泌

細(xì)菌分泌系統(tǒng)的重要功能就是將效應(yīng)蛋白的特定子集分泌到宿主細(xì)胞中，分泌過程中所分泌的效應(yīng)蛋白不在胞漿間隙中停留，也不被切割，而是直接從胞質(zhì)運(yùn)輸?shù)剿拗骷?xì)胞中。對(duì)分泌過程和機(jī)制的研究認(rèn)為，整個(gè)分泌過程可進(jìn)一步細(xì)分為一步分泌機(jī)制和兩步分泌機(jī)制[24]。一步分泌是效應(yīng)蛋白在分泌過程中不依賴一般（Secretion，Sec）分泌或雙精氨酸易位（Twin-arginine translocation，Tat）途徑，可直接將底物從細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)靶向宿主；兩步分泌則需要Sec的傳輸，在分泌過程中首先在細(xì)胞內(nèi)膜上依靠轉(zhuǎn)運(yùn)體發(fā)生易位，一旦進(jìn)入周質(zhì)外，底物就會(huì)被靶向其中一個(gè)分泌系統(tǒng)，然后通過某個(gè)分泌系統(tǒng)介導(dǎo)穿過外膜將底物運(yùn)輸釋放到細(xì)菌細(xì)胞外[6]。

T3SS分泌體系由跨越內(nèi)膜和外膜的復(fù)雜蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)組成，不依賴于Sec途徑，可以將分泌蛋白直接注入宿主細(xì)胞，屬于一步分泌。當(dāng)細(xì)菌與真核宿主細(xì)胞接觸后，外界環(huán)境因子首先刺激產(chǎn)生分泌信號(hào)。Ⅲ型分泌底物的N端攜帶Sec-非依賴性信號(hào)序列，在分子伴侶的協(xié)助下定向結(jié)合到分泌通道的入口。轉(zhuǎn)位器在真核宿主細(xì)胞膜中形成孔道，使“針頭結(jié)構(gòu)”經(jīng)由孔道刺入宿主細(xì)胞，然后效應(yīng)蛋白通過“針頭結(jié)構(gòu)”進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，分泌過程見圖1。

3.1 識(shí)別定位

T3SS分泌蛋白在其N端含有不可清除的信號(hào)序列，出口設(shè)備組件SctU和SctV，胞質(zhì)環(huán)，ATP酶復(fù)合物和SctW負(fù)責(zé)介導(dǎo)分泌途徑中的分泌順序，膜靶向和導(dǎo)出[25]。

3.2 通道開放

通過注射體的蛋白質(zhì)分泌以連續(xù)的步驟進(jìn)行，不同的切換機(jī)制確保了分泌層次結(jié)構(gòu)。有兩種分泌模型：第一種是內(nèi)桿SctI在輸出裝置的周質(zhì)與SctU相互作用，導(dǎo)致其易位到基底體并與分泌素SctC結(jié)合[15]。之后，SctI以某種方式調(diào)節(jié)針的長度并促進(jìn)SctU的自體蛋白水解；第二種是，一旦針或細(xì)絲結(jié)構(gòu)達(dá)到正確的長度，完全擴(kuò)展的SctP錨定在其上的SctU的自體蛋白發(fā)生溶解[25]。而守門的SctW在中后期底物分泌過程中起著重要作用，沒有SctW，易位子（中間底物）不分泌，效應(yīng)子（晚期底物）過度分泌。并且它與易位子相互作用，能夠促進(jìn)分泌，促進(jìn)易位子孔打開。一旦宿主質(zhì)膜中的易位子孔形成，離子流到細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)可能改變局部電位，也因電位改變導(dǎo)致SctW從膜上分泌，SctW從膜上脫落驅(qū)動(dòng)了晚期底物的分泌[15]。

3.3 靶向受體

在靶向受體過程中，主要是輸出裝置SctV的主要成分與伴侶—分泌蛋白復(fù)合物之間的相互作用。研究表明，SctU和SctW的構(gòu)象改變及膜電位的局部變化可能改變SctV與伴侶—分泌蛋白復(fù)合物的親和力，從而對(duì)分泌步驟有一定的調(diào)節(jié)作用[15]。

4 抑制T3SS功能可能的靶點(diǎn)

干擾T3SS發(fā)揮分泌功能進(jìn)程的每個(gè)階段都可能減少或阻斷細(xì)菌的毒力效應(yīng)因子的釋放?，F(xiàn)有研究資料表明，T3SS的針尖結(jié)構(gòu)、基底組裝的過程調(diào)控以及效應(yīng)蛋白是最主要的抑制T3SS功能可能的靶點(diǎn)。

4.1 作用于針尖蛋白

主要由于針尖蛋白的特殊結(jié)構(gòu)，小分子抑制劑能夠與針尖蛋白結(jié)合。抑制劑在結(jié)合過程中會(huì)以不同的形式阻塞效應(yīng)分子通過針尖孔道，主要形式有：小分子抑制劑直接阻塞針孔道[26]；抑制劑在不阻塞孔隙的情況下與針尖結(jié)合，使效應(yīng)分子不能夠順利到達(dá)宿主膜上；還有一種是小分子抑制劑與針尖結(jié)合，使針尖蛋白的構(gòu)象發(fā)生改變[27]，造成其效應(yīng)分子不能通過孔道。

4.2 影響基底的組裝過程

T3SS結(jié)構(gòu)形式“注射器”樣，但細(xì)致劃分出來是由許多亞基組裝而成，各個(gè)亞基之間相互協(xié)同，相互作用，共同調(diào)節(jié)著效應(yīng)分子的分泌。對(duì)于基底的抑制，一種是抑制基底的組裝。研究發(fā)現(xiàn)，抑制組裝的任何一個(gè)步驟都可能阻止針的形成，從而阻止效應(yīng)分子分泌到宿主細(xì)胞中[28]。另一種是抑制周質(zhì)門，在基體的SctC內(nèi)，有一個(gè)周質(zhì)門，它參與針的形成，它通常有閉合、半開放、開放等三種構(gòu)象。當(dāng)處于閉合狀態(tài)時(shí)，針不能伸出，效應(yīng)分子也就不能夠與宿主分子結(jié)合；當(dāng)處于開放狀態(tài)則能夠順利分泌到宿主[29]。因此，對(duì)于周質(zhì)門的調(diào)節(jié)主要由于SctC構(gòu)象的改變。典型的噻唑烷酮類抑制劑則是通過影響SctC構(gòu)象的改變，阻止周質(zhì)門的開放，抑制針的形成，進(jìn)而有效阻止效應(yīng)分子分泌到宿主細(xì)胞。

4.3 阻斷效應(yīng)分子靶向宿主

細(xì)菌分泌的毒力或效應(yīng)分子蛋白等通過分泌系統(tǒng)針狀孔道進(jìn)入宿主，并與宿主結(jié)合，發(fā)揮作用。可以抑制效應(yīng)分子的黏附、內(nèi)化和干擾效應(yīng)分子的伴侶蛋白等途徑來抑制效應(yīng)分子與宿主的結(jié)合[30]，從而達(dá)到抑制分泌效應(yīng)功能的目的。對(duì)于黏附過程的抑制，主要是效應(yīng)分子易位的黏附素受體（Tir）的N端與黏附素的結(jié)合，C端則會(huì)與多個(gè)宿主因子相互作用，最終調(diào)節(jié)效應(yīng)分子的分泌[31]；對(duì)于內(nèi)化的抑制過程，主要是效應(yīng)分子與宿主因子的結(jié)合，導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白重排和聚合，肌動(dòng)蛋白重排導(dǎo)致膜褶皺的形成[32]，之后則會(huì)吞噬細(xì)菌細(xì)胞，發(fā)生內(nèi)化。效應(yīng)分子能否順利通過針孔通道進(jìn)入宿主，還需要有一個(gè)關(guān)鍵蛋白，即分子伴侶蛋白[33]。在伴侶蛋白存在的情況下，效應(yīng)分子會(huì)與伴侶蛋白結(jié)合，進(jìn)而使效應(yīng)分子通過T3SS進(jìn)行分泌[34]。對(duì)效應(yīng)分子伴侶蛋白的抑制也能有效抑制效應(yīng)分子順利通過針孔通道。

5 T3SS抑制劑

T3SS分泌系統(tǒng)抑制劑根據(jù)其作用機(jī)制大致可分為3類[35]：（1）轉(zhuǎn)錄抑制劑。菌體與宿主結(jié)合后，系統(tǒng)的相關(guān)轉(zhuǎn)錄被激活，而在轉(zhuǎn)錄過程中起重要作用的是ExsA轉(zhuǎn)錄因子。Marsden等發(fā)現(xiàn)N-羥基苯并咪唑能夠結(jié)合ExsA，并抑制它的轉(zhuǎn)錄激活活性，從而降低細(xì)胞毒性作用[36]。（2）外毒素抑制劑。T3SS分泌毒性最大的外毒素為ExoU，它作用于宿主的磷脂酶A2可引起宿主的死亡，研究發(fā)現(xiàn)磺胺類藥物能夠高強(qiáng)度抑制ExoU酶活性。（3）針管狀結(jié)構(gòu)蛋白抑制劑。在細(xì)菌的外表面，存在一種針管狀的復(fù)合物[37]，其能夠?qū)⑼舛舅剞D(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞。位于針管狀結(jié)構(gòu)尖端的一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PcrV可以控制菌體通過T3SS分泌外毒素。針對(duì)PcrV抑制劑的研究多數(shù)集中在單克隆抗體上[35]。

5.1 水楊基酰肼類

水楊酰肼類及其衍生物（主要包括磺酰氨基苯甲酰苯胺、水楊酰亞胺和水楊酰肼等三種化合物，圖2）是研究較早的一類小分子T3SS抑制劑[38]。不同化合物對(duì)轉(zhuǎn)錄和運(yùn)動(dòng)性有著不同的影響，進(jìn)而產(chǎn)生不同的靶標(biāo)和作用機(jī)制?；酋０被郊柞１桨凡挥绊慣3SS的運(yùn)動(dòng)性和一般的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[29]；水楊酰亞胺對(duì)運(yùn)動(dòng)沒有影響，可能通過影響雙組分信號(hào)傳導(dǎo)，從而間接影響T3SS分泌，同時(shí)對(duì)轉(zhuǎn)錄激活也有一定影響，抑制T3SS基因的轉(zhuǎn)錄[39]；而水楊酰肼能夠影響其分泌和運(yùn)動(dòng)，但不會(huì)影響轉(zhuǎn)錄[40]。在大腸埃希菌中，該類抑制劑可以靶向WrbA，Tpx和Flox等T3SS調(diào)節(jié)蛋白，通過直接結(jié)合和干擾T3SS基礎(chǔ)裝置相關(guān)的蛋白來發(fā)揮作用[39]。

5.2 噻唑烷酮類

噻唑烷酮是一種飽和雜環(huán)噻唑，含有羰基官能團(tuán)（圖3），主要有噻唑烷-2-酮、噻唑烷-4-酮和噻唑烷-5-酮[41]。在對(duì)沙門菌研究過程中，鑒定出2-亞氨基-5-芳基噻唑烷酮是T3SS的廣譜抑制劑，其雜環(huán)在一系列連接子末端顯示為二聚體，一些二聚體則對(duì)于毒力蛋白的分泌起到抑制作用[42]。通過純化沙門菌的針狀復(fù)合物，研究人員發(fā)現(xiàn)化合物處理的樣品具有較低水平的針狀成分，但全細(xì)胞水平不變[40]。由此可見，該化合物通過破壞分泌素之間的相互作用起作用，從而影響針狀復(fù)合物的組裝和穩(wěn)定性，但對(duì)纖毛系統(tǒng)沒有影響[40]。研究還發(fā)現(xiàn)，該化合物能夠通過靶向多蛋白系統(tǒng)的外膜環(huán)蛋白來阻止毒力蛋白的分泌[43]。

5.3 苯氧乙酰胺

苯氧乙酰胺衍生物（圖4）能夠特異性地影響某些T3SS效應(yīng)因子的分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)，從降低T3SS介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，并促進(jìn)細(xì)胞中細(xì)菌的內(nèi)化[44]。該抑制劑與靶蛋白結(jié)合后，能夠干擾影響感染持久性、擴(kuò)散性的效應(yīng)蛋白ExoS或ExoU的分泌或轉(zhuǎn)運(yùn)。2014年，Bowlin等發(fā)現(xiàn)苯氧乙酰胺等衍生物對(duì)突變株T3SS針狀復(fù)合物PscF基因有一定影響，能夠影響T3SS的分泌和易位[45]。該研究表明，苯氧乙酰胺抑制劑與組裝的PscF針狀復(fù)合物結(jié)合[34， 46]，一方面通過影響亞基之間的相互作用來抑制針狀復(fù)合物的組裝和穩(wěn)定性；另一方面通過與針腔結(jié)合來改變其親水性來抑制其功能，從而阻斷T3SS功能[45]。

5.4 喹啉類

VirF是一種AraC家族轉(zhuǎn)錄激活劑，能夠直接激活icsA和virB毒力基因的表達(dá)，是T3SS表達(dá)所必需的。喹啉是一種AraC家族抑制劑（圖5），它選擇地抑制兩個(gè)AraC家族激活劑RhaS和RhaR。在對(duì)于喹啉類T3SS抑制劑的研究發(fā)現(xiàn)，該化合物有效地抑制了VirF與DNA的結(jié)合，從而抑制AraC家族在體內(nèi)激活轉(zhuǎn)錄的能力。一種類似物8-羥基喹啉類抑制劑在發(fā)揮作用過程中能夠阻斷負(fù)調(diào)控因子ExsE經(jīng)T3SS向胞外分泌，不利于胞內(nèi)ExsC-ExsD復(fù)合物的形成，使得ExsA無法激活T3SS基因的轉(zhuǎn)錄[47]。研究還發(fā)現(xiàn)其化合物能夠作用于鞭毛和T3SS的注射體中的ATP酶，能夠抑制ExoS和FliC的分泌以及鞭毛的運(yùn)動(dòng)。此外，羥基喹啉保護(hù)真核細(xì)胞免受T3SS介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，并抑制半胱天冬酶的活性和在吞噬細(xì)胞中的IL-1β釋放[44]。

5.5 N-羥基苯并咪唑類

通過計(jì)算機(jī)篩選與屬于AraC家族的大腸埃希菌中基因表達(dá)調(diào)節(jié)因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域相互作用的小分子，發(fā)現(xiàn)N-羥基苯并咪唑類藥物是以多重適應(yīng)反應(yīng)（MAR）蛋白（如E.coli的MarA、SoxS和Rob等）為靶標(biāo)的小分子抑制劑。MAP蛋白的特征是兩個(gè)高度保守的雙螺旋DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，能夠控制細(xì)菌引起的感染，抵抗抗生素和適應(yīng)外部環(huán)境的能力。AraC家族的蛋白質(zhì)可以通過調(diào)控對(duì)抗生素和氧化應(yīng)激的抗性、T3SS的表達(dá)、毒素產(chǎn)生以及感染期間相關(guān)重要過程來調(diào)節(jié)毒力[48]。N-羥基苯并咪唑及其衍生物（圖6）可以結(jié)合一些轉(zhuǎn)錄因子（LcrF、ExsA等）的DNA結(jié)合域后[49]，如能夠與ExsA的羧基末端結(jié)構(gòu)域相互作用。另外還存在變構(gòu)機(jī)制，如N-羥基苯并咪唑結(jié)合誘導(dǎo)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)改變[50]，阻止其與DNA上的啟動(dòng)子位點(diǎn)結(jié)合[44]，從而抑制ExsA-DNA復(fù)合物的形成[51]。

5.6 酚酸類

除亞水楊基酰肼和羥基苯并咪唑衍生物能夠抑制T3SS基因表達(dá)外，某些天然來源的酚酸類成分（圖7）也有類似的活性[47]。研究發(fā)現(xiàn)，P-香豆酸、O-香豆酸、反式肉桂酸等能夠抑制植物病原體的T3SS基因的表達(dá)[52]，通過操縱T3SS的表達(dá)來防御細(xì)菌病原體[53]。對(duì)于許多細(xì)菌能夠使用調(diào)控系統(tǒng)GacS/A和由T3SS基因簇中心的基因HrpX/Y編碼的雙組分系統(tǒng)（TCS）來感知其環(huán)境并調(diào)節(jié)基因以響應(yīng)環(huán)境變化；對(duì)于香豆素則通過T3SS的核心調(diào)節(jié)器HrpX/Y雙組分系統(tǒng)抑制了T3SS調(diào)控基因的表達(dá)[54]，而不是通過調(diào)節(jié)劑GacS/A來間接調(diào)節(jié)T3SS。

5.7 4-甲基苯酚

T3SS的基質(zhì)由稱為Ysc（Yop分泌）的蛋白組成，從基部延伸出來的是一個(gè)空心針狀結(jié)構(gòu)，由YscF的重復(fù)亞基組成。針末端的孔由LcrV、YopB、YopD三種蛋白組成。4-甲基苯酚化合物（圖8）能夠與YopD相互作用從而有效抑制Yop的分泌[55]。

5.8 Aurodox

Aurodox是最初于1973年被發(fā)現(xiàn)的一種抗生素化合物，對(duì)革蘭陽性菌具有抗菌作用。在新型T3SS抑制特性的研究表明，Aurodox能夠下調(diào)腸出血性大腸埃希菌（Enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC）T3SS的表達(dá)[56]；轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析表明，其作用于腸細(xì)胞消失位點(diǎn)（Locus of enterocyte effacement， LEE）基因主調(diào)控因子Ler的上游[25]，而不是直接作用于分泌系統(tǒng)本身。研究發(fā)現(xiàn)：（1）Aurodox能夠抑制T3SS相關(guān)效應(yīng)蛋白的易位；（2）抑制EHEC附著于上皮細(xì)胞和去除上皮細(xì)胞的能力；（3）抑制多種毒力基因的表達(dá)，如能夠抑制LEE基因中包括主調(diào)節(jié)因子Ler和grlA在內(nèi)的25個(gè)基因表達(dá)[57]。對(duì)于Ler的調(diào)節(jié)機(jī)制，一方面可能直接抑制Ler的表達(dá)；另一方面可能與T3SS的組分結(jié)合導(dǎo)致Ler的負(fù)反饋，從而影響Ler的上游調(diào)節(jié)器。此外，還抑制了編碼T3SS分泌的非編碼效應(yīng)蛋白的基因的表達(dá)，如NleB和EspG[58]。

5.9 Csn-B

Csn-B（Cytosporone B，圖9）通過 Hha–H-NS–HilD–HilC–RtsA–HilA 調(diào)節(jié)途徑影響鼠傷寒沙門菌染色體插入物沙門菌毒力島1（SPI-1）相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[59]。Csn-B及其衍生物對(duì)SPI-1介導(dǎo)的HeLa細(xì)胞侵襲表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑制作用[60]，但未觀察到對(duì)細(xì)菌有毒性。類核蛋白Hha和H-NS與SPI-1調(diào)節(jié)基因hilD，hilC和rtsA的啟動(dòng)子結(jié)合以抑制其表達(dá)，從而調(diào)節(jié)SPI-1裝置和效應(yīng)基因的表達(dá)[61]。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)Csn-B上調(diào)了hha和hns的轉(zhuǎn)錄。另外，Csn-B及其類似物能夠阻斷沙門菌SPI-1相關(guān)效應(yīng)蛋白的分泌，但不影響鞭毛蛋白FilC在體外的分泌[62]。

5.10 黃酮類

Guo等[63]研究發(fā)現(xiàn)，異戊二烯化類黃酮及其類似物對(duì)沙門菌SPI-1相關(guān)效應(yīng)蛋白的分泌具有抑制作用，但不會(huì)影響鞭毛蛋白FilC的分泌和細(xì)菌的生長；另外黃酮類似物檸檬黃酮醇能夠通過調(diào)節(jié)AicA/InvF基因的轉(zhuǎn)錄和效應(yīng)蛋白SipC的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而對(duì)SPI-1效應(yīng)蛋白的分泌起到抑制作用[64]。

5.11 鹽酸血根堿

研究發(fā)現(xiàn)天然化合物鹽酸血根堿（圖10）可以減少SPI-1編碼的Ⅲ型分泌系統(tǒng)主要毒力蛋白SipA和SipB的產(chǎn)生，并防止鼠傷寒沙門菌侵襲HeLa細(xì)胞的能力，而不會(huì)影響沙門菌的生長[65]。

5.12 Harmine

研究發(fā)現(xiàn)，Harmine（圖11）能夠抑制T3SS調(diào)節(jié)基因HilA的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，降低鼠傷寒沙門菌T3SS效應(yīng)蛋白Sipa、SipB和SipC的表達(dá)，從而抑制T3SS效應(yīng)蛋白的分泌和表達(dá)，最終減弱鼠傷寒沙門菌的侵襲力[66]，是T3SS靶向抑制劑。

5.13 SAHs

SAHs首次發(fā)現(xiàn)在2003年，該化合物及其衍生物對(duì)結(jié)核桿菌、鼠傷寒沙門菌、鏈球菌T3SS具有抑制作用[25]，能夠降低鼠傷寒沙門菌和鏈球菌感染期間的巨噬細(xì)胞毒性和上皮細(xì)胞侵襲[67]。Hudson等[68]研究發(fā)現(xiàn)能夠抑制SPI-1編碼的T3SS在鼠傷寒沙門菌中的分泌以及SPI-1介導(dǎo)的分泌和炎癥反應(yīng)。目前對(duì)于該化合物的具體作用機(jī)制尚不清楚，可能是通過多種細(xì)菌蛋白來抑制T3SS，對(duì)多種途徑進(jìn)行干擾。

6 總結(jié)與展望

近年來，隨著超級(jí)耐藥菌的層出不窮，抗生素耐藥性也急劇增加，已成為全球關(guān)注的重大公共衛(wèi)生問題。鑒于新型抗菌藥物研究周期長、成本高以及細(xì)菌極易對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥等問題，研究人員逐漸由之前殺死細(xì)菌向抑制細(xì)菌毒力方向轉(zhuǎn)變。細(xì)菌分泌系統(tǒng)恰是分泌毒力因子等效應(yīng)蛋白所必需的通道，抑制效應(yīng)蛋白的分泌，在分泌過程中阻斷細(xì)菌毒力的傳播，成為一個(gè)很不錯(cuò)的選擇。革蘭陰性菌在生產(chǎn)生活中危害極大，而T3SS是革蘭陰性菌主要的毒力裝置，在革蘭陰性菌感染過程中發(fā)揮重要作用，自然成為抗毒力策略的重要選擇目標(biāo)。

目前，盡管T3SS抑制劑取得了一定進(jìn)展，已經(jīng)涌現(xiàn)出一些具有前景的T3SS抑制劑（圖12）。但是T3SS抑制劑的研究仍較為緩慢，多是在老藥的基礎(chǔ)上進(jìn)行改造，研制其衍生物，由于其作用的機(jī)制研究不夠深入，所以抑制機(jī)理也不是完全清楚。當(dāng)前中藥有效成分等天然產(chǎn)物是一個(gè)超級(jí)龐大的化合物庫，有關(guān)T3SS抑制劑的篩選研究已逐漸轉(zhuǎn)向從天然產(chǎn)物中開發(fā)可能的新型抑制劑，這又為T3SS等細(xì)菌分泌系統(tǒng)抑制劑的篩選和應(yīng)用注入了新的源泉。總之，對(duì)于T3SS及其抑制劑的研究仍有廣闊的空間和應(yīng)用前景，需要進(jìn)一步發(fā)掘其新的分泌機(jī)制與新的抑制手段，對(duì)未來新型抗生素的研發(fā)，藥物“佐劑”的應(yīng)用具有重要的作用，為抑制劑從研究走向運(yùn)用奠定基礎(chǔ)。

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收稿日期：2022-10-21

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（31872516）；國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFE0192600）。

作者簡介：陳棟梁，碩士研究生，主要從事抗菌藥物研究。

*通訊作者：張可煜，研究員，主要從事獸醫(yī)藥理學(xué)與新獸藥研究