抗細(xì)菌耐藥性策略：質(zhì)粒消除

劉泉　曹征征　崔潞晴　郭凱旋　張凡　戴夢紅

摘要：細(xì)菌可以通過多種方式產(chǎn)生對抗菌藥物的耐藥性，其中最為常見的方式之一為獲得攜帶有耐藥基因的質(zhì)粒。耐藥質(zhì)?？梢栽诰曛g轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致耐藥性的廣泛傳播，因此消除耐藥質(zhì)粒是緩解細(xì)菌耐藥擴(kuò)散的關(guān)鍵。本綜述介紹了基于物理、化學(xué)以及生物學(xué)的細(xì)菌耐藥質(zhì)粒消除方法的研究進(jìn)展，并闡述了質(zhì)粒消除的機(jī)理，為今后探尋安全有效地消除耐藥質(zhì)粒的研究方法提供參考。

關(guān)鍵詞：耐藥性；質(zhì)粒；質(zhì)粒消除；消除機(jī)制；抗生素；耐藥基因

中圖分類號：R378? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? ? ?文章編號：1001-8751（2023）03-0185-07

Strategies to Combat Bacterial Resistance： Plasmid Curing

Liu Quan，? ?Cao Zheng-zheng，? ?Cui Lu-qing，? ?Guo Kai-xuan，? ?Zhang Fan，? ?Dai Meng-hong

（The Cooperative Innovation Center for Sustainable Pig Production， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070）

Abstract： acteria can develop resistance to antimicrobial drugs in a variety of ways， among which the most common way is to obtain plasmids carrying resistance genes. Therefore， strengthening the research on the elimination methods of resistant plasmids becomes critical to alleviate the increasing severity of bacterial drug resistance. In this review， the research progress of plasmid elimination methods based on physics， chemistry and biology is introduced， and the mechanism of plasmid curing is described， which will provide reference for the research methods of safe and effective plasmid curing in the future.

Key words： antimicrobial resistance; plasmids; plasmid curing; curing mechanism; antibiotic; antibiotic resistance gene

抗生素耐藥性是全世界范圍內(nèi)一個日益嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，目前已被視為“同一健康”中的重點(diǎn)之一。長期抗生素的濫用導(dǎo)致了嚴(yán)重的環(huán)境污染問題，不斷促進(jìn)耐藥菌甚至超級細(xì)菌的產(chǎn)生。一項新的研究發(fā)現(xiàn)在2018年至2000年間，全球抗生素使用量增加了46%[1]。在動物身上不適當(dāng)?shù)厥褂每股匾彩菍?dǎo)致抗生素耐藥性上升的原因之一。據(jù)估計，抗生素消費(fèi)總量的三分之二用于動物生產(chǎn)[2]。2013年，全球動物生產(chǎn)中的抗生素使用量為13.1萬噸，預(yù)計2030年將增加到20萬噸[3]。導(dǎo)致抗生素耐藥多樣性和持久性存在的另一個關(guān)鍵因素是抗生素耐藥基因。它們通常位于質(zhì)粒上，質(zhì)粒是具有自主復(fù)制能力的環(huán)狀DNA片段。耐藥性質(zhì)粒通常是接合型質(zhì)粒，不僅能夠啟動自身的轉(zhuǎn)移，還能帶動其他質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移[4]。非接合型質(zhì)粒，不能自我傳播，但是能夠在接合型質(zhì)粒轉(zhuǎn)移基因的誘導(dǎo)下被轉(zhuǎn)移到特定宿主；這種轉(zhuǎn)移既可以垂直進(jìn)行，也可以通過水平轉(zhuǎn)移進(jìn)行[5]。

作為一種新型環(huán)境污染物，抗生素耐藥基因先于抗生素的發(fā)現(xiàn)而廣泛存在于自然環(huán)境中[6]。在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中，土壤已成為重要的耐藥基因儲存庫，土壤中的耐藥基因能夠通過受污染作物和地下水系統(tǒng)進(jìn)入食物鏈，對人類健康造成潛在威脅[7]。養(yǎng)殖場、河流湖泊、醫(yī)療廢水也都是耐藥基因的主要儲存庫，促進(jìn)了耐藥基因在環(huán)境中的傳播。對臨床治療產(chǎn)生威脅的耐藥基因包括編碼超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的基因（例如CTX-M）、碳青霉烯酶耐藥基因（例如OXA、KpC和NDM）、黏菌素耐藥基因（例如mcr-1）和替加環(huán)素耐藥基因（例如tetX3、tetX4）。CTX-M型耐藥菌已經(jīng)在全球范圍內(nèi)被分離出來，其發(fā)病率急劇增加，并仍處上升趨勢。blaCTX-M基因本身是高度可變的，現(xiàn)已確認(rèn)了207多種CTX-M變種[8]。NDM-1于2008年首次從一名在印度新德里住院的患者分離出的肺炎克雷伯菌株中發(fā)現(xiàn)[9]，隨后NDM-1陽性菌株在全球范圍內(nèi)被發(fā)現(xiàn)。blaNDM基因的廣泛傳播很大程度上是由某些質(zhì)粒介導(dǎo)的，尤其是IncX3型質(zhì)粒[10]。由于NDM酶的不斷進(jìn)化，目前已發(fā)現(xiàn)了24種NDM變種，這對臨床管理和公共衛(wèi)生構(gòu)成重大挑戰(zhàn)[11]。2016年，首次在中國的人源和動物源的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌分離株中報道了mcr-1[12]。大多數(shù)攜帶mcr-1的質(zhì)粒是可轉(zhuǎn)移的，IncI2、IncHI2和IncX4是攜帶mcr-1的主要質(zhì)粒類型[13-14]。多黏菌素，被認(rèn)為是抵抗多重耐藥革蘭陰性菌感染的最后一道防線。但攜帶黏菌素和碳青霉烯耐藥基因的菌株仍在世界范圍內(nèi)繼續(xù)傳播，是臨床治療的重大挑戰(zhàn)和對公共衛(wèi)生的重大威脅。

內(nèi)源質(zhì)?？梢宰园l(fā)地從細(xì)菌中丟失，但其丟失效率很低[15]，且大部分內(nèi)源質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)是穩(wěn)定存在的。因此，開發(fā)新的策略來限制質(zhì)粒介導(dǎo)的抗生素耐藥性的傳播是至關(guān)重要的。質(zhì)粒消除是指從細(xì)菌中去除質(zhì)粒的過程。質(zhì)粒消除有可能去除菌群中的耐藥基因，同時保留完整的細(xì)菌群落，因此其可作為對抗抗生素耐藥性的策略。研究發(fā)現(xiàn)可以采用物理、化學(xué)、生物學(xué)的方法來提高耐藥質(zhì)粒在細(xì)菌中的丟失效率，從而達(dá)到消除耐藥質(zhì)粒，恢復(fù)細(xì)菌對抗生素敏感性的目的。本文對質(zhì)粒的消除方法進(jìn)行了分類和總結(jié)，并對質(zhì)粒的消除機(jī)理進(jìn)行了介紹。

1 物理消除方法

物理消除法是質(zhì)粒消除方法中最簡單的方法，其操作方便，且對細(xì)菌自身基因組的損害較小，不存在突變風(fēng)險。主要是采用高溫、高壓、微波、紫外線照射等方式來消除耐藥質(zhì)粒。Mesas等[16]通過使用高壓電穿孔方法誘導(dǎo)細(xì)菌內(nèi)質(zhì)粒丟失，結(jié)果顯示質(zhì)粒pRS2在電穿孔后以33.3%的頻率丟失，質(zhì)粒pRS3在電穿孔后以25%的頻率丟失。推測利用高壓消除細(xì)菌內(nèi)質(zhì)粒的原理為高電壓可以擊穿細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使質(zhì)粒流出，導(dǎo)致細(xì)菌質(zhì)粒丟失。Klassen等[17]將羅伯茨放線菌（Wingea robertsiae）CBS6693暴露于254 nm的紫外線下100～360 s，結(jié)果顯示菌株中線性質(zhì)粒pWR1A和pWR1B均消失，推測細(xì)菌質(zhì)粒可能經(jīng)紫外線照射而消失。Berzin等[18]利用2.45 GHZ微波處理細(xì)菌，結(jié)果顯示梭氏菌（Clostridium）MT962質(zhì)粒pMT351被消除，且消除效率達(dá)到42%～47%。物理消除法可用于去除拷貝數(shù)較低或化學(xué)試劑難以進(jìn)入細(xì)胞的細(xì)菌質(zhì)粒。

2 化學(xué)消除方法

2.1 化學(xué)試劑

2.1.1 表面活性劑

十二烷基磺酸鈉（SDS）是最常用的一種表面活性劑，利用其消除質(zhì)粒主要有兩種機(jī)制：一是使內(nèi)源質(zhì)粒從細(xì)胞膜上的附著位點(diǎn)脫離，抑制質(zhì)粒的正常復(fù)制，最終導(dǎo)致質(zhì)粒在分裂過程中丟失；二是當(dāng)SDS到達(dá)細(xì)胞質(zhì)后，通過將蛋白質(zhì)解離成單個亞基從而干擾細(xì)胞新陳代謝，部分與質(zhì)粒復(fù)制有關(guān)的蛋白失去活性，導(dǎo)致質(zhì)粒的丟失[19]。朱美秋等[20]利用高溫-SDS法對菌株LBA4404中的質(zhì)粒進(jìn)行消除實(shí)驗，經(jīng)處理后的菌株內(nèi)質(zhì)粒被完全消除。Paul等[21]利用濃度分別為8%，10%及12%的SDS對銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）中編碼金屬β-內(nèi)酰胺酶抗性的blaNDM-1和blaVIM-2質(zhì)粒進(jìn)行清除，結(jié)果顯示SDS成功清除細(xì)菌內(nèi)質(zhì)粒，且消除效率達(dá)到100%。SDS作為一種陰離子消除劑，具有消除質(zhì)粒的功能，但由于具有高毒性和誘變性質(zhì)，故臨床很少使用。

2.1.2 嵌合染料及其他

嵌合染料消除劑主要包括吖啶黃、吖啶橙、溴化乙錠（EB）等，其作用機(jī)制是它們可以優(yōu)先與細(xì)菌內(nèi)質(zhì)粒結(jié)合，隨即嵌入到DNA雙鏈中，在質(zhì)粒上形成切口，阻礙質(zhì)粒的正常復(fù)制，從而造成質(zhì)粒的丟失。在沙門菌[22]、銅綠假單胞菌[23]和鮑曼不動桿菌[24]中已經(jīng)證明溴化乙錠可以消除細(xì)菌內(nèi)源質(zhì)粒。Saranathan等[24]利用稀釋至亞抑菌濃度（320～5120 μg/mL）的溴化乙錠對鮑曼不動桿菌進(jìn)行質(zhì)粒消除試驗，結(jié)果顯示細(xì)菌內(nèi)質(zhì)粒丟失，并發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒丟失后菌株恢復(fù)了對兩種以上抗生素的敏感性，表明鮑曼不動桿菌的耐藥性與菌株自身攜帶的質(zhì)粒有關(guān)。Sa?lam等[25]利用吖啶黃消除法對植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）進(jìn)行質(zhì)粒消除，結(jié)果顯示菌株內(nèi)質(zhì)粒在80 μg/mL濃度下被成功消除。Dhanarani等[26]將鏈球菌（Streptococcus）、微球菌（Micrococcus）分別置于含有75、100 μg/mL吖啶橙的營養(yǎng)肉湯中，并在37 ℃下培養(yǎng)24 h，檢測到細(xì)菌內(nèi)含有的4.2 kb及5.1 kb大小的質(zhì)粒被成功消除。EB的質(zhì)粒消除效率通常比較高，且對多種細(xì)菌有效，但由于EB具有強(qiáng)大的誘變活性，并且具有明顯的毒性和致癌性，因此其實(shí)際應(yīng)用很少。此外，結(jié)晶紫[27]、萘啶酸[28]也都具有質(zhì)粒消除作用。

2.2 化學(xué)藥物

2.2.1 吩噻嗪類

雜環(huán)有機(jī)化合物例如吩噻嗪，已廣泛用于人類醫(yī)學(xué)，最初是作為抗蠕蟲藥，現(xiàn)在多用于精神病的治療。吩噻嗪類藥物已被證明對某些細(xì)菌和質(zhì)粒具有活性[29-30]。Spengler等[31]利用吩噻嗪類化合物及其衍生物針對大腸埃希菌（Escherichia coli）K12LE140攜帶的質(zhì)粒進(jìn)行消除實(shí)驗，證明吩噻嗪具有消除質(zhì)粒的能力。推斷當(dāng)此類化合物作用于細(xì)菌質(zhì)粒時，使質(zhì)粒出現(xiàn)切口，該過程導(dǎo)致質(zhì)粒解螺旋，從而影響質(zhì)粒進(jìn)行正常復(fù)制[32-34]。Costa等[35]將耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Meticillin-resistant Staphylococcus aureus）HPV107置于含有氯丙嗪的培養(yǎng)基中連續(xù)傳代，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌內(nèi)含有的大小為30 kb的質(zhì)粒消失。Molnár等[36]發(fā)現(xiàn)在異丙嗪和丙咪嗪的存在下，從藤黃微球菌（Micrococcus luteus）中分離出來的DNA促旋酶活性受到抑制。說明吩噻嗪類化合物可以通過阻斷DNA促旋酶的活性使質(zhì)粒復(fù)制受阻。有研究發(fā)現(xiàn)一些質(zhì)子泵抑制劑增強(qiáng)了吩噻嗪類化合物對大腸埃希菌K12LE140的質(zhì)粒消除效果[37]，表明質(zhì)子泵抑制劑可以增強(qiáng)質(zhì)粒消除藥物的活性。

2.2.2 抗菌藥物

一些抗菌藥物在較高濃度時可以抑制細(xì)菌生長，但在亞抑菌濃度時可以消除細(xì)菌內(nèi)攜帶的耐藥質(zhì)粒。Brandi等[38]選擇3株含有相同抗性基因的三種不同質(zhì)粒（pT713、pJLL144、pRK2）的大腸埃希菌菌株進(jìn)行質(zhì)粒消除試驗。實(shí)驗結(jié)果表明，在37 ℃條件下，抗生素可導(dǎo)致部分質(zhì)粒的丟失。在曲伐沙星濃度為10 μg/mL時，觀察到質(zhì)粒pJLL144丟失，消除效率達(dá)到50%。當(dāng)曲伐沙星在一半的最小抑菌濃度下，大約30%的質(zhì)粒pRK2丟失。最后，對從曲伐沙星處理的細(xì)胞中提取的質(zhì)粒pT713進(jìn)行了定量PCR，觀察到該質(zhì)粒在最小抑菌濃度條件下?lián)p失了大約50%，結(jié)果表明曲伐沙星可作為細(xì)菌質(zhì)粒消除的一種有效方法。新生霉素作為拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑也可以有效治療許多革蘭陽性細(xì)菌的質(zhì)粒，包括糞腸球菌[39]、植物乳桿菌[40]、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌[41]等。此外，頭孢菌素類藥物對細(xì)菌的耐藥質(zhì)粒也有一定的消除能力[42]。

三氯生，作為一種廣譜抗菌劑，被廣泛應(yīng)用于消毒劑、化妝品、香皂等中，在低濃度時具有抑菌作用，而在高濃度時具有殺菌作用。Riber等[43]將三氯生嵌入到有機(jī)硅水凝膠的互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)中可以促進(jìn)細(xì)菌群體中的質(zhì)粒丟失。該研究發(fā)現(xiàn)，使用遠(yuǎn)低于最小抑菌濃度的三氯生可以導(dǎo)致大腸埃希菌中質(zhì)粒pMIB4的丟失，且隨著三氯生濃度的增加，細(xì)菌中質(zhì)粒丟失顯著增加，但高濃度的三氯生會使細(xì)菌形成適應(yīng)性反應(yīng)，導(dǎo)致其對三氯生產(chǎn)生耐藥性，這表明三氯生在未來治療和醫(yī)療目的的應(yīng)用中存在局限性。

2.3 納米顆粒

近年來，納米顆粒被認(rèn)為是對抗細(xì)菌耐藥性的潛在工具[44]。銅和鉑納米顆粒有助于消除耐藥質(zhì)粒，因為它們與超螺旋質(zhì)粒DNA或參與復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和重組過程的拓?fù)洚悩?gòu)酶相互作用，最終導(dǎo)致質(zhì)粒的消除[45-46]。另一種類型的納米顆粒，有機(jī)納米顆粒，通過影響質(zhì)粒DNA的完整性和結(jié)合能力顯示出對耐藥菌的治療活性[47]。Bharathan等[48]研究了果膠包裹的鉑納米顆粒（PtNPs）的質(zhì)粒消除效應(yīng)。實(shí)驗結(jié)果表明，在斑馬魚感染模型中，果膠包裹的鉑納米顆粒在體外和體內(nèi)均能導(dǎo)致大腸埃希菌U3790質(zhì)粒的丟失，從而導(dǎo)致美羅培南和頭孢曲松的MIC顯著降低。在10 μmol/L濃度下觀察到質(zhì)粒消除現(xiàn)象，在20 μmol/L濃度下，PtNPs引起質(zhì)粒的有效丟失。且實(shí)驗證明，該納米顆粒是無毒的。機(jī)理研究表明，納米顆粒與細(xì)胞表面相互作用，擾亂了細(xì)胞內(nèi)膜的完整性，并且可以引起質(zhì)粒DNA的裂解，進(jìn)而導(dǎo)致質(zhì)粒丟失，使多重耐藥細(xì)菌在體內(nèi)恢復(fù)對抗菌劑的敏感性。

盡管金屬納米顆粒是另一種對抗細(xì)菌耐藥性的武器，但由于金屬在動物飼料添加劑和消毒劑生產(chǎn)等領(lǐng)域的使用，細(xì)菌也能夠?qū){米顆粒產(chǎn)生耐藥性。由于納米顆粒使用劑量較低，盡管它們對身體無害，然而，納米顆粒在人體內(nèi)長時間存在可能會造成生物積累[49]。因此，需要對納米顆粒的長期毒性和致癌性進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

2.4 中草藥

中藥作為一種天然藥物，來源廣泛，安全性高，毒副作用小。且許多中草藥不僅具有抑菌、殺菌作用，還被發(fā)現(xiàn)具有逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性的作用。劉彥晶等[50]以亞抑菌濃度的黃芩醇提劑和水煎劑作為消除劑對乙酸鈣不動桿菌的NDM-1質(zhì)粒進(jìn)行消除試驗，結(jié)果顯示，黃芩醇提劑和水煎劑均可導(dǎo)致質(zhì)粒的丟失，其中醇提劑的消除效率更高。彭苗苗[51]以七種單味中藥黃連、柴胡、大黃、魚腥草、板藍(lán)根、穿心蓮及黃柏對臨床分離的豬源大腸埃希菌進(jìn)行耐藥質(zhì)粒消除試驗。實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，七種單味中藥均具有耐藥質(zhì)粒消除作用，且黃連的消除效果最佳。綜上所述，中草藥可以在體外有效地消除質(zhì)粒，然而由于中草藥具有復(fù)雜的成分，還需要更多的研究來確認(rèn)其作用機(jī)制，及確定有無毒性和體內(nèi)有效性。

3 生物消除方法

3.1 轉(zhuǎn)座子消除

利用轉(zhuǎn)座子消除質(zhì)粒的基本原理是通過插入細(xì)菌攜帶的質(zhì)粒，引入具有自殺特性的基因。例如，消除攜帶抗性基因的質(zhì)粒，其突變株應(yīng)表現(xiàn)為對此抗性敏感等。目前應(yīng)用于質(zhì)粒消除研究的轉(zhuǎn)座子包括Tn5[52]、Tn5-rpsL[53]、Tn10[54]和Tn1-amp[55]等。胡國元等[56]用Tn5-mob-sacB 標(biāo)記根瘤菌攜帶的質(zhì)粒，使其獲得對蔗糖敏感的基因。將菌株置于含有7%蔗糖的培養(yǎng)基上于28 ℃培養(yǎng)，經(jīng)過篩選獲取質(zhì)粒丟失的突變菌株。

3.2 質(zhì)粒不相容性消除

質(zhì)粒不相容性是指同一種或者親緣關(guān)系相近的兩種質(zhì)粒不能在同一細(xì)胞中同時穩(wěn)定存在的現(xiàn)象。通過引入另一個相同復(fù)制子，干擾菌株中原始質(zhì)粒的復(fù)制，使質(zhì)粒在多次傳代過程中造成丟失。質(zhì)粒不相容已廣泛用于質(zhì)粒消除，可成功消除芽孢桿菌屬中的一些質(zhì)粒，如蘇云金芽孢桿菌[57]和炭疽芽孢桿菌[58]。Tian等[59]通過構(gòu)建不相容質(zhì)粒pBV02，后將其導(dǎo)入貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）NSZ-YBGJ001中，在含25 μg/mL卡那霉素的培養(yǎng)基中連續(xù)多次傳代，最終消除質(zhì)粒pBV01。Kamruzzaman等[60]利用質(zhì)粒不相容性，構(gòu)建了與編碼抗毒素和復(fù)制子的基因相結(jié)合的干擾質(zhì)粒。在干擾質(zhì)粒的存在下，可以有效消除體外培養(yǎng)腸桿菌科細(xì)菌中編碼blaIMP-4和blaCMY-2基因的質(zhì)粒，以及小鼠腸道內(nèi)定殖的大腸埃希菌中的目標(biāo)質(zhì)粒，使整個腸道微生物群可以恢復(fù)對抗生素的敏感性，而不會產(chǎn)生任何新的抗生素耐藥性。該研究表明，利用不相容質(zhì)粒，可以在體外和小鼠腸道中實(shí)現(xiàn)安全、徹底消除細(xì)菌的抗生素耐藥性。這種方法的質(zhì)粒消除效率高，且避免了使用化學(xué)消除方法時產(chǎn)生的毒性，但其主要缺點(diǎn)是在質(zhì)粒消除前必須詳細(xì)了解菌株靶質(zhì)粒的復(fù)制類型[61-62]，適用于對菌株靶質(zhì)粒信息較清楚的質(zhì)粒消除實(shí)驗。且目前尚不清楚該方法是否適用于不同宿主物種中的微生物群，因此需要進(jìn)行深入的研究，以克服該系統(tǒng)的局限性。

3.3 基于CRISPR/Cas系統(tǒng)消除法

近年來，科研人員已經(jīng)探索了CRISPR/Cas系統(tǒng)作為質(zhì)粒消除的可行性。CRISPR/Cas系統(tǒng)是細(xì)菌體內(nèi)一種天然免疫系統(tǒng)，是重要的基因編輯工具之一?？股乜剐约?xì)菌可以通過使用CRISPR-Cas9系統(tǒng)特異性切割抗性基因或質(zhì)粒來恢復(fù)其對抗生素的敏感性。Hao等[63]開發(fā)了一種新型的CRISPR/Cas9介導(dǎo)的pCasCure質(zhì)粒消除系統(tǒng)，以消除臨床腸桿菌目細(xì)菌分離物中的碳青霉烯酶基因和質(zhì)粒。該系統(tǒng)將pCasCure質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到臨床耐藥腸桿菌分離株中，靶向目標(biāo)質(zhì)粒后，可高效去除碳青霉烯酶基因和質(zhì)粒，并使其恢復(fù)對碳青霉烯的敏感性。Wang等[64]通過建立pMBLcas9-sgRNA質(zhì)粒成功消除了臨床大腸埃希菌分離株14EC007中的2個原生質(zhì)粒，從而使分離株14EC007對多黏菌素和羧芐青霉素重新敏感。

CRISPR-Cas系統(tǒng)在臨床治療方面有著巨大潛力，但目前的開發(fā)仍處于初級階段，進(jìn)一步的工作需要將CRISPR/Cas元件整合到一個最佳的輸送系統(tǒng)中，使其適用于臨床應(yīng)用。噬菌體被認(rèn)為是遞送CRISPR-Cas元件的理想載體，但這種方法仍存在一些局限性。大多數(shù)噬菌體的宿主范圍較窄[65-66]，且將較大的CRISPR-Cas元件整合到噬菌體基因組中可能會影響噬菌體自身的復(fù)制和組裝[67]。其次，噬菌體可以傳遞宿主的DNA片段，在噬菌體介導(dǎo)的水平基因轉(zhuǎn)移下，將會引發(fā)傳播毒力因子或耐藥基因的安全問題[68]。一些研究試圖使用接合法將CRISPR/Cas9質(zhì)粒遞送到受體細(xì)菌中，但是轉(zhuǎn)移效率都較低。目前，雖然大多數(shù)研究證明了CRISPR系統(tǒng)可用于體外消除耐藥質(zhì)粒，但其體內(nèi)的有效性尚未得到驗證。此外，如何將其運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)病原體的靶點(diǎn)是另一個重大挑戰(zhàn)。

4 展望

抗生素耐藥性是對公共健康和環(huán)境的重大威脅，尋找有效和安全的消除質(zhì)粒的方法對減輕細(xì)菌耐藥性至關(guān)重要。雖然已知的一些消除耐藥質(zhì)粒的方法不適用于臨床耐藥細(xì)菌感染的治療，但可以應(yīng)用于環(huán)境污染處理。例如，可以將質(zhì)粒消除劑應(yīng)用于養(yǎng)殖場、醫(yī)療廢水、土壤中，減少耐藥基因?qū)Νh(huán)境中的污染，從而減緩耐藥性的傳播?？梢苿釉谀退幓虻墨@取和傳播中起著關(guān)鍵作用，因此控制耐藥性的一種方法就是限制可移動元件的轉(zhuǎn)移。盡管有很多基于物理、化學(xué)方法到基于不相容性或CRISPR/Cas的方法可以消除質(zhì)粒，但是目前還沒有一個較好的可供體內(nèi)使用的消除質(zhì)粒的方法，因此需要進(jìn)一步的研究以發(fā)現(xiàn)安全有效的方法來消除質(zhì)粒，并在未來的臨床應(yīng)用中防止抗生素耐藥基因的傳播。

參 考 文 獻(xiàn)

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收稿日期：2022-09-22

基金項目：“十三五”國家重點(diǎn)研發(fā)計劃項目（2017YFC1600100）。

作者簡介：劉泉，碩士研究生，主要從事抗菌藥耐藥研究。

*通訊作者：戴夢紅，副教授，主要從事抗菌藥耐藥研究。