鞘氨醇激酶1（Sphk1）抑制劑在肝纖維化大鼠模型中的作用機(jī)制

王燕　馬麗　肖雄　雷冬梅　趙奉茹　郭力源　王曉忠

摘要：目的探討鞘氨醇激酶1（SphK1）抑制劑在不同肝纖維化大鼠模型中的治療作用。方法170只SD大鼠隨機(jī)分為4組：正常組（30只）、HFE組（給予高脂乳劑，45只）、CCl₄組（CCl₄誘導(dǎo)，45只）、CCl₄+HFE組（HFE聯(lián)合CCl₄，50只），經(jīng)病理及實驗室檢查證實造模成功后，分別給予SphK1抑制劑PF-543，同組別以生理鹽水作為對照，分別在第1、7、14天取肝組織進(jìn)行Masson染色，比較肝纖維化面積占比、透射電鏡下觀察自噬小體形成情況、Real-time PCR檢測肝纖維化及自噬相關(guān)標(biāo)志物mRNA表達(dá)水平。計量資料多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD檢驗。相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析。結(jié)果與正常組（0.57±0.13）相比，CCl₄組（6.93±5.81）和HFE+CCl₄組（10.89±2.67）肝纖維化面積占比均升高（P值均＜0.01）。PF-543干預(yù)第7天可顯著降低CCl₄組及HFE+CCl₄組纖維化病變面積（P值均＜0.01）。與正常組相比，HFE組、CCl₄組和HFE+CCl₄組的SphK1表達(dá)水平均明顯降低（P值均＜0.01），HFE+CCl₄組的α平滑肌肌動蛋白、轉(zhuǎn)化生長因子-β、α1-Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)水平均明顯升高（P值均＜0.01），干預(yù)后各指標(biāo)水平無明顯變化（P值均＞0.05）。Atg5、Atg12、Becn1的表達(dá)水平與肝纖維化病變面積均呈負(fù)相關(guān)（r分別為-0.715、-0.640、-0.632，P值均＜0.01）；SphK1的表達(dá)水平與Atg5、Atg12、Becn1、Map1lc3a 的mRNA表達(dá)均呈正相關(guān)（r分別為0.603、0.561、0.510、0.498，P值均＜0.01）。電鏡示：CCl₄組肝組織輕微水腫，細(xì)胞器豐富，輕度腫脹，以粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張為主。該視野可見9個自噬溶酶體結(jié)構(gòu)。在PF-543 干預(yù)第7天后，未見典型自噬結(jié)構(gòu)。HFE+CCl₄組肝組織輕度水腫，結(jié)構(gòu)不清晰，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量豐富，明顯擴(kuò)張，表面附著核糖體顆粒較少。該視野可見6個自噬溶酶體結(jié)構(gòu)。在PF-543 干預(yù)第7天后，該視野未見典型自噬結(jié)構(gòu)。結(jié)論PF-543對自噬有顯著抑制作用，并同時伴有纖維化面積的減少。提示靶向SphK1，可影響到肝臟的自噬水平，并進(jìn)而緩解兩種肝纖維化模型的纖維化狀態(tài)。

關(guān)鍵詞：肝纖維化； 鞘氨醇激酶1； 自噬； 模型，? 動物

基金項目：國家自然科學(xué)基金（81860808）

Mechanism of action of sphingosine kinase 1 inhibitor in a rat model of liver fibrosis

WANG Yan MA Li XIAO Xiong LEI Dongmei ZHAO Fengru GUO Liyuan WANG Xiaozhong?（1. The Fifth Peoples Hospital Affiliated to Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 611130， China; 2. Xinjiang Technical Institute of Physics and Chemistry， Chinese Academy of Sciences， Urumqi 830000， China; 3. Traditional Chinese Medicine Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi 830000， China）

Corresponding author： WANG Yan， wy751105@126.com （ORCID：0000-0001-9730-8279）

Abstract：ObjectiveTo investigate the therapeutic effect of sphingosine kinase 1 （SphK1） inhibitor in different liver fibrosis models. MethodsA total of 170 Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal group （30 rats）， HFE group （45 rats given high-fat emulsion）， CCl₄group （45 rats induced by CCl₄）， and CCl₄+HFE group （50 rats given HFE and CCl₄）. After successful modeling confirmed by pathology and laboratory examination， the SphK1 inhibitor PF-543 was given， and the rats in the same group were given normal saline as control. Liver tissue samples were collected on days 1， 7， and 14 for Masson staining; the percentage of liver fibrosis area was compared; the formation of autophagosome was observed under a transmission electron microscope; real-time PCR was used to measure the mRNA expression levels of markers associated with liver fibrosis and autophagy. A one-way analysis of variance was used for comparison between multiple groups， and the LSD method was used for further comparison between two groups; a Spearman correlation analysis was also performed. ResultsCompared with the normal group， the CCl₄group and the HFE+CCl₄group had a significant increase in the percentage of liver fibrosis area （6.93±5.81/10.89±2.67 vs 0.57±0.13， both P＜0.01），? the CCl₄group and the HFE+CCl₄group had a significant reduction in the percentage of liver fibrosis area on day 7 （both P＜0.01）. Compared with the normal group， the HFE group， the CCl₄group， and the HFE+CCl₄group had a significant reduction in the expression level of SphK1 （all P＜0.01）， and the HFE+CCl₄group had significant increases in the mRNA expression levels of alpha-smooth muscle actin， transforming growth factor-β， and collagen type I alpha 1 （all P＜0.01）， while there were no significant changes in these indices after intervention （all P＞0.05）. The expression levels of Atg5， Atg12， and Becn1 were negatively correlated with the area of liver fibrosis （r=-0.715， -0.640， and -0.632， all P＜0.01）， and the expression level of SphK1 was positively correlated with the mRNA expression of Atg5， Atg12， Becn1， and Map1lc3a （r=0.603， 0.561， 0.510， and 0.498， all P＜0.01）. Electron microscopy showed that the CCL₄group had slight edema， abundant organelles， and mild swelling in liver tissue， mainly the expansion of rough endoplasmic reticulum， and nine autolysosome （ASS） structures were seen in this field， while no typical ASS structure was observed on day 7 of PF-543 intervention. The HFE+CCL₄group had mild edema， unclear structure， and abundant rough endoplasmic reticulum with marked expansion and few ribosome particles attached to its surface in liver tissue， and 6 ASS structures were seen in this field， while no typical ASS structure was observed on day 7 of PF-543 intervention. ConclusionPF-543 significantly inhibits autophagy and is associated with a reduction in fibrosis area. It is suggested that targeting SphK1 can affect the level of liver autophagy， thereby alleviating the state of liver fibrosis in two liver fibrosis models.

Key words：Hepatic Fibrosis; Sphingosine Kinase 1; Autophagy; Models， Animal

Research funding：National Natural Science Foundtion of China（81860808）

全球有15億人受到多種形式慢性肝病的影響［1］。肝纖維化被認(rèn)為是肝臟結(jié)構(gòu)惡化的節(jié)點。近年來，由于肝炎、非酒精性脂肪性肝炎等所致肝硬化的發(fā)病率及其相關(guān)病死率急劇增加［2］。不同病因所致肝硬化潛在的發(fā)病機(jī)制和在疾病進(jìn)展、治療效應(yīng)上的差別是未知的。迫切需求探索可減輕肝纖維化的新細(xì)胞與分子途徑。

鞘氨醇激酶（SphK）蛋白是一個激酶家族，負(fù)責(zé)鞘氨醇的磷酸化和鞘氨醇-1-磷酸（S1P）的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)不同的生物事件，如細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和血管生成［3］。S1P是一種具有廣泛生物活性的磷脂酶，由SphK1催化而來。SphK1所產(chǎn)生鞘氨醇-1-磷脂，已被證明可調(diào)節(jié)肥胖人類和小鼠的肝臟脂肪含量、脂肪組織炎癥及胰島素抵抗［4］。有報道［5］SphK1抑制劑可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子α，可改善小鼠暴發(fā)性肝衰竭。SphK1缺乏可顯著提高小鼠對對乙酰氨基酚誘導(dǎo)肝損傷的耐受能力［6］。SphK1在高飽和脂肪喂養(yǎng)誘導(dǎo)的小鼠非酒精性脂肪性肝炎模型中介導(dǎo)肝臟炎癥，并啟動肝細(xì)胞促炎信號傳導(dǎo)。SphK1-/-可保護(hù)肝臟免受胰島素抵抗［7］，研究還表明，對代謝功能障礙的其他參數(shù)，包括血漿游離脂肪酸，SphK1沒有保護(hù)作用。相反，另有研究［8］證實，在非酒精性脂肪性肝病肝臟缺血再灌注損傷（I/R）的小鼠模型中敲低SphK1可引起脂毒性的神經(jīng)酰胺生成增加，加重肝細(xì)胞氧化應(yīng)激，引起細(xì)胞凋亡與壞死，進(jìn)而加重肝臟I/R損傷。這表明在肥胖背景下，SphK1在代謝異常中的作用是多樣化的。新近研究［9］發(fā)現(xiàn)，SphK1能夠通過誘導(dǎo)自噬參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展。在四氯化碳（CCl₄）誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型中，檢測到肝組織中的微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ表達(dá)增加，說明自噬水平在肝纖維化中明顯增加。饑餓狀態(tài)下，SphK1激活自噬，抑制了 MCF-7細(xì)胞的死亡，保證了細(xì)胞存活［10］。

在本研究中，設(shè)計了肝纖維化和脂肪肝肝纖維化兩種大鼠模型，兩者造模時間均為12周。運用 SphK1抑制劑PF-543干預(yù)，比較兩種不同纖維化模型對SphK1抑制劑反應(yīng)是否相同，探討SphK1在不同病因所致肝纖維化中的作用及機(jī)制。

1材料與方法

1.1肝組織與動物SD大鼠購自新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心［實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（新）2018-0003，實驗動物使用許可證號：SYXK（新）2018-0003］，雄性，年齡5～6周齡，無特殊病原級，平均體質(zhì)量176.7 g。SD大鼠共170只，隨機(jī)分為4組：正常組、高脂乳劑組（high fat emulsion，HFE）、四氯化碳組（CCl₄）、高脂乳劑+四氯化碳組（HFE+CCl₄），其中Normal組30只、HFE組45只、CCl₄組45只、HFE+CCl₄組50只。

正常組每天灌胃給水+每周三、日皮下注射生理鹽水；HFE組每天10 mL/kg灌胃高脂乳劑；CCl₄組每周三、日按3 mL/kg皮下注射CCl₄; HFE+CCl₄組每天按10 mL/kg灌胃高脂乳劑+每周三、日按3 mL/kg皮下注射CCl₄，連續(xù)12周。分別于造模第4、8、12周各組處死指定數(shù)量大鼠。造模13周結(jié)束后二次分組，各組分別給予PF-543（SphK1抑制劑）及生理鹽水，按照劑量0.5 mg/kg、濃度0.2 mg/mL、體積2.5 mL/kg? ?腹腔注射PF-543及等體積生理鹽水。各組分別于注射后第1、7、14天（D1、D7、D14）處死動物，取肝組織，部分置于2.5%戊二醛中固定，進(jìn)行電鏡觀察；部分肝組織置于4%多聚甲醛中固定，用于光鏡觀察、Masson染色。

1.2HE染色常規(guī)烤片及脫蠟處理，酒精水化后進(jìn)行染色，蘇木精復(fù)染3 min，鹽酸酒精分化1～2 s后置于自來水中終止分化。脫水后伊紅復(fù)染：0.5%伊紅乙醇液對切片進(jìn)行對比染色，染色1 min后放入95%乙醇中清洗，清洗掉多余的紅色后放入無水乙醇中浸泡5 min。二甲苯Ⅰ、Ⅱ 各5 min進(jìn)行透明。中性樹膠封片。

1.3Masson染色4%多聚甲醛中固定24 h的組織標(biāo)本經(jīng)修剪、脫水、包埋、切片、染色、封片，最后鏡檢合格的樣片。使用PANNORAMIC全景切片掃描儀將組織切片上機(jī)掃描成像，形成文件夾，該文件夾包含了組織切片上所有的組織信息。文件夾用CaseViewer 2.4軟件打開后可以1～400倍任意倍數(shù)放大后進(jìn)行觀察。使用Halo v3.0.311.314分析軟件中Indica Labs-Area Quantification v2.1.3模塊分別定量每張切片的目的區(qū)域，測量出組織面積、陽性面積并得出陽性面積占比。

1.4透射電鏡下觀察自噬體新鮮組織確定取材部位，組織體積一般不超過1 mm×1 mm×1 mm，迅速投入電鏡固定液4 ℃固定2～4 h。0.1 mmol/L磷酸緩沖液PB漂洗3次，每次15 min。后固定：1%鋨酸·0.1 mmol/L磷酸緩沖液PB室溫（20 ℃）固定2 h。0.1 mmol/L磷酸緩沖液PB漂洗3次，每次15 min。脫水：組織依次入50%-70%-80%-90%-95%-100%-100%酒精-100%丙酮-100%丙酮上行脫水，每次15 min。滲透：丙酮︰812包埋劑=1∶1， 2～4 h； 丙酮∶812包埋劑=2∶1，滲透過夜；純812包埋劑5～8 h，將純812包埋劑倒入包埋板，將樣品插入包埋板后37 ℃烤箱過夜。包埋：60 ℃烤箱聚合48 h。切片：超薄切片機(jī)切片60～80 nm超薄切片。染色：鈾鉛雙染色（2%醋酸鈾飽和酒精溶液，枸櫞酸鉛，各染色15 min），切片室溫干燥過夜。透射電子顯微鏡下觀察，采集圖像分析。

1.5Real-time PCR檢測mRNA表達(dá)水平采用HieffTM qPCR SYBR Green Master Mix （Low Rox Plus）（Yeasen）和特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件如下：預(yù)變性95 ℃ 5 min，變性95 ℃ 10 s，退火延伸60 ℃ 30 s，擴(kuò)增40個cycle，熔解曲線采集95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。采用2-ΔΔCT方法測定基因相對表達(dá)量，并針對GAPDH進(jìn)行歸一化處理，引物序列見表1。

1.6實驗試劑高脂乳劑（20%豬油200 g、10%膽固醇100 g、0.5%丙基硫氧嘧啶5 g、4%吐溫-80 40 mL、1%豬膽酸鹽10 g、加蒸餾水至1 000 mL）、膽固醇（批號：180110，上海藍(lán)季生物科技發(fā)展有限公司）、丙基硫氧嘧啶（批號：20201011，上海藍(lán)季生物科技發(fā)展有限公司）、吐溫（批號：20200820，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司）、橄欖油［批號：B20200612X，嘉里糧油（天津）有限公司］、10%中性福爾馬林固定液（批號：0603A20，0225A21，安徽雷根生物技術(shù)有限公司）、2.5%戊二醛固定液（批號：0122A21，安徽雷根生物技術(shù)有限公司），PF-543（99.34%，批號：S717703，美國Selleckchen公司）、Dimethyl sulfoxide

（批號：1129E0312，北京索萊寶科技有限公司）。熒光定量PCR實驗試劑：One-Step gDNA Removal and cDNA（批號：AT311-03，Transgene）；HieffTM qPCR SYBR Green Master Mix（批號：11202ES08，Yeasen）

1.7統(tǒng)計學(xué)方法采用GraphPad 8.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD檢驗。相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果

2.1各組動物造模后肝組織病理學(xué)觀察圖1顯示，正常組肝細(xì)胞索排列有序，肝細(xì)胞未見變性、壞死，肝竇未見淤血。HFE組可見明顯肝細(xì)胞空泡變性（++++）。CCl₄組可見肝細(xì)胞空泡變性（++++），間質(zhì)結(jié)締組織增生，炎癥細(xì)胞浸潤，符合肝纖維化表現(xiàn)；HFE+CCl₄組肝細(xì)胞空泡變性，假小葉形成，間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤，符合肝硬化表現(xiàn)。

2.2各組動物第1、7、14天給予PF-543對肝纖維化面積占比的影響 兩種肝纖維化模型組肝纖維化面積（CCl₄組：6.93±5.81，HFE+CCl₄組：10.89±2.67）均較正常組（0.57±0.13）升高（P值均＜0.01）；各組經(jīng)PF-543干預(yù)第7天，CCl₄組（2.16±2.07）、HFE+CCl₄組（6.32±2.42）肝纖維化面積均有改善（P值均＜0.01）；在干預(yù)第14天時各組肝纖維化面積較第7天略有升高，與各自模型組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＞0.05）。HFE組的肝纖維化面積在干預(yù)前后無明顯變化（P值均＞0.05）（圖2）。

如圖3所示，正常組肝組織經(jīng)Masson染色，未見明顯的膠原纖維增生。HFE組肝組織脂肪變性明顯，大量的肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見數(shù)量不等的圓形空泡。CCl₄組、HFE+CCl₄組肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，廣泛膠原纖維明顯增生，染色呈藍(lán)色；增生的膠原纖維將肝細(xì)胞分割包繞成大小不等的圓形或橢圓形的肝細(xì)胞團(tuán)，廣泛可見假小葉形成；肝組織脂肪變性明顯，大量的肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見數(shù)量不等、體積大小不一的圓形空泡。

CCl₄組給予PF-543干預(yù)第1天，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，廣泛膠原纖維明顯增生；增生的膠原纖維將肝細(xì)胞分割包繞成大小不等的圓形或橢圓形的肝細(xì)胞團(tuán)，廣泛可見假小葉形成。干預(yù)第7天，可見幾處膠原纖維輕度增生；較多的血管之間膠原纖維相互延伸、連接，形成纖維橋接；肝組織脂肪變性明顯，大量的肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見數(shù)量不等、體積大小不一的圓形空泡。干預(yù)第14天，組織邊緣局部可見膠原纖維增生；肝組織脂肪變性明顯，大量的肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見數(shù)量不等、體積大小不一的圓形空泡，相較于第1天，肝臟病理可見明顯改善。

HFE+CCl₄組干預(yù)第1天，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，廣泛膠原纖維明顯增生；增生的膠原纖維將肝細(xì)胞分割包繞成大小不等的圓形或橢圓形的肝細(xì)胞團(tuán)，廣泛可見假小葉形成；肝組織脂肪變性明顯，大量的肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見數(shù)量不等、體積大小不一的圓形空泡。干預(yù)第7、14天，肝臟病理未見明顯改善。

2.3PF-543對SphK1及肝纖維化相關(guān)基因表達(dá)的影響Real-time PCR結(jié)果顯示，與正常組相比，HFE組、CCl₄組和HFE+CCl₄組的SphK1表達(dá)水平均明顯降低（P值均＜0.01）。經(jīng)PF-543干預(yù)7天后，HFE組與CCl₄組SphK1表達(dá)水平仍低于正常組（P值均＜0.01）。與正常組相比，CCl₄組α平滑肌肌動蛋白（α-SMA）表達(dá)水平升高（P＜0.01），干預(yù)后其表達(dá)水平仍高于正常組（P＜0.05）。TGF-β表達(dá)水平隨著纖維化程度加重而逐步增高，其中HFE+CCl₄組表達(dá)水平最高，與正常組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。干預(yù)前后TGF-β表達(dá)水平無明顯變化（P＞0.05）。Col1a1表達(dá)水平隨著纖維化程度加重而逐步增高，CCl₄組、HFE+CCl₄組與正常組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜0.01），干預(yù)前后其表達(dá)水平無明顯變化。Fn1表達(dá)水平隨著纖維化程度加重而逐步增高（P值均＜0.01），經(jīng)PF-543干預(yù)后，2個纖維化組表達(dá)水平仍低于正常組（P＜0.01）（圖4）。

2.4自噬相關(guān)基因表達(dá)與肝纖維化面積的相關(guān)性分析如圖5所示，Atg5、Atg12、Becn1的表達(dá)與Masson陽性面積均呈負(fù)相關(guān)（P值均＜0.01）。Map1lc3a的表達(dá)與Masson面積無相關(guān)性（P＞0.05）。SphK1表達(dá)水平與Atg5、Atg12、Becn1、Map1lc3a 的mRNA表達(dá)均呈正相關(guān)（P值均＜0.01）。

2.5SphK1抑制劑PF-543對纖維化肝組織自噬結(jié)構(gòu)的影響電鏡下觀察正常組可見少量脂滴微自噬結(jié)構(gòu)，未見典型自噬結(jié)構(gòu)。HFE組脂滴局部分布，少量輕度融合，脂滴微自噬結(jié)構(gòu)少量可見。初級溶酶體局部分布，未見典型自噬結(jié)構(gòu)。正常組與HFE組給予PF-543后無明顯變化（視野無或可見1個自噬溶酶體）。CCl₄組肝組織輕微水腫，膜完整、結(jié)構(gòu)清晰，胞內(nèi)基質(zhì)電子密度均勻，細(xì)胞器豐富，均勻分布，輕度腫脹，以粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張為主。該視野可見9個自噬溶酶體結(jié)構(gòu)。在給予PF-543 第7天后，未見典型自噬結(jié)構(gòu)。HFE+CCl₄組肝組織輕度水腫，膜完整、結(jié)構(gòu)不清晰，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量豐富，明顯擴(kuò)張，表面附著核糖體顆粒較少。脂滴數(shù)量較少，局部融合、體積增大。該視野可見6個自噬溶酶體結(jié)構(gòu)。在給予PF-543第7天后，該視野未見典型自噬結(jié)構(gòu)（圖6）。

3討論

已有證據(jù)表明，SphK1/S1P信號在小鼠肺纖維化的病理生物學(xué)過程中具有重要作用［11］，但其在肝纖維化中的具體分子機(jī)制尚不清楚，阻斷SphK1的活化是否對肝纖維化具有保護(hù)作用。在本研究中，使用兩種肝纖維化模型來評估SphK1抑制劑的保護(hù)作用。分別用CCl₄和高脂乳劑聯(lián)合CCl₄造模，在暴露于兩種不同的造模方式后，SphK1的抑制作用顯著地減少了肝纖維化。但這種對肝纖維化的保護(hù)作用，隨著肝纖維化病變程度的加重，不再顯現(xiàn)。

SphK1靶向藥物的設(shè)計和開發(fā)已成為國內(nèi)外的研究熱點?；赟phK1在炎性免疫相關(guān)疾病和腫瘤病理中的過度表達(dá)，大多數(shù)研究集中在SphK1選擇性抑制劑的開發(fā)上。PF-543是目前應(yīng)用最廣泛的SphK1抑制劑，參與不同的細(xì)胞功能以改善疾病。既往一些研究［12-13］中，表明PF-543可以減少肺上皮細(xì)胞線粒體DNA損傷、募集單核細(xì)胞、降低活性氧的產(chǎn)生，以改善肺纖維化和肺損傷。對乳腺癌和炎癥性腸病，包括胃腸道腫瘤的研究［14-15］表明，PF-543減少腫瘤微環(huán)境中各種免疫抑制因子的表達(dá)，以克服對免疫檢查點抑制劑的耐藥性。

本研究中，造模12周結(jié)束后肝臟病理結(jié)果顯示造模成功，脂肪肝肝纖維化模型的纖維化程度明顯重于CCl₄組，達(dá)到肝硬化病理標(biāo)準(zhǔn)。第13周二次分組后各疾病階段分別給予生理鹽水或PF-543，共干預(yù)14天。干預(yù)第7天時，CCl₄組、HFE+CCl₄組纖維化面積均較模型組有改善。在干預(yù)第14天時，2組纖維化面積較第7天升高，與模型組相比無差異。Masson染色顯示，PF-543對CCl₄組病理改善程度更佳。HFE+ CCl₄組由于纖維化程度更重，在干預(yù)前后病理未見明顯差異（圖4），提示PF-543在肝纖維化早期有一定治療作用，但隨著疾病程度加重，PF-543治療效力逐漸減弱。運用Real-time PCR同時檢測第1、7天SphK1及TGF-β、α-SMA等纖維化相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)水平，模型組中SphK1隨著纖維化程度加重，表達(dá)水平逐步降低；TGF-β、α-SMA等表達(dá)水平隨著纖維化程度加重，表達(dá)水平逐步升高，干預(yù)后，上述指標(biāo)未發(fā)生顯著變化。表明在肝纖維化、肝硬化進(jìn)程中，由SphK1主導(dǎo)的SphK/S1P信號處于抑制狀態(tài)。有研究［16］表明，SphK1的活力和肝血竇的微循環(huán)狀態(tài)密切相關(guān)，其活力增強(qiáng)時，肝竇微循環(huán)明顯改善。其主要產(chǎn)物SIP可不同程度保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、改善微循環(huán)、減少白細(xì)胞的黏附以及抑制炎癥誘導(dǎo)的血管通透性增加等病理學(xué)改變［17］。2020年開展的一項研究［4］表明，脂肪細(xì)胞特異性缺失SphK1導(dǎo)致糖耐量增加、脂肪細(xì)胞肥大和脂解受損，這意味著SphK1在脂肪細(xì)胞功能和維持器官整體代謝穩(wěn)態(tài)中具有特定的作用。此外，在不同類型的細(xì)胞中，SphK1可能發(fā)揮截然相反的作用。在小鼠成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞中特異性敲除SphK1基因，小鼠的肺纖維化程度明顯緩解，膠原沉積量明顯降低，纖維化相關(guān)指標(biāo)TGF-β、Fn等蛋白水平明顯降低。表明成纖維細(xì)胞中特異性敲除SphK1基因能夠緩解肺纖維化進(jìn)程。在上皮細(xì)胞中特異性敲除SphK1基因，發(fā)現(xiàn)上皮細(xì)胞中SphK1基因缺失后，小鼠的肺纖維化程度減輕，膠原沉積也明顯減少。肺泡灌洗液中蛋白含量以及細(xì)胞數(shù)量也明顯減少。纖維化相關(guān)指標(biāo)Fn、α-SMA、Col1A2、TGF-β表達(dá)水平均下降。而在肺內(nèi)皮細(xì)胞中SphK1則表現(xiàn)為具有抗炎和抗纖維化的作用［18］。這也表明SphK1/S1P信號在纖維化形成中可能具有雙重作用［19-20］，SphK1在上述細(xì)胞類型中的不同作用機(jī)制尚不清楚。

鑒于既往文獻(xiàn)［21-22］對自噬與脂肪性肝病及纖維化關(guān)系相關(guān)性的探討，本研究還檢測了3種疾病模型中自噬標(biāo)志物及自噬小體，發(fā)現(xiàn)SphK1與Atg5、Atg12、Becn1、Map1lc3a mRNA的表達(dá)均呈正相關(guān)，且Atg5、Atg12、Becn1的表達(dá)與肝纖維化面積呈負(fù)相關(guān)。提示SphK1可能調(diào)控細(xì)胞自噬，并影響了肝纖維化的狀態(tài)。具體作用機(jī)制尚需功能驗證實驗。Atg蛋白是自噬的主要參與者，構(gòu)成最重要的分子平臺。Atg12-Atg5是自噬體膜上的標(biāo)志性蛋白，這些蛋白正確連接可形成一種稱作自噬體的細(xì)胞器。自噬體可像垃圾袋一樣移除有毒物質(zhì)。已知Atg5對脂肪細(xì)胞的自噬和脂肪生成具有重要功能［23］。本研究中，可以發(fā)現(xiàn)隨著肝纖維化程度的加重，Atg5表達(dá)水平逐漸降低。Atg12與之變化趨勢一致。同樣，Becn1的水平與肝纖維化面積呈負(fù)相關(guān)。研究［24］表明，Becn1基因敲除小鼠血清脂聯(lián)素水平降低，反之，Becn1自噬活躍可增強(qiáng)循環(huán)中具有生物活性脂聯(lián)素水平，增強(qiáng)胰島素敏感性，發(fā)揮非降解作用調(diào)節(jié)代謝穩(wěn)態(tài)。Alexaki等［25］在2014年時即發(fā)現(xiàn)自噬與鞘脂代謝相關(guān)，鞘脂從頭合成活躍可誘導(dǎo)自噬。同時，自噬控制著活體中鞘脂的水平，并表明在許多病理條件下，功能失調(diào)的自噬可能會導(dǎo)致鞘脂穩(wěn)態(tài)的改變。本研究發(fā)現(xiàn)在肝纖維化與脂肪肝合并肝纖維化兩種模型中，自噬活動均明顯加強(qiáng)，而PF-543則對自噬有顯著抑制作用。并同時伴有纖維化面積的減少。提示靶向SphK1可影響到肝臟的自噬水平，并進(jìn)而緩解肝纖維化或代謝相關(guān)脂肪性肝病合并肝纖維化的狀態(tài)。同時，本研究提示，無論對于肝纖維化還是脂肪肝合并肝纖維化，在疾病早期階段，SphK1抑制劑均具有一定治療作用，而如果肝纖維化程度過重，則治療效應(yīng)減弱，而用藥療程的問題也是今后值得探討的一個方向。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2020年12月11日經(jīng)由新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會審批，批號：IACUC-20201211-13，符合實驗室動物管理與使用準(zhǔn)則。利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。作者貢獻(xiàn)聲明：王燕負(fù)責(zé)課題設(shè)計，資料分析，撰寫論文；馬麗負(fù)責(zé)動物實驗；肖雄、雷冬梅、趙奉茹、郭力源參與收集數(shù)據(jù)，整理資料；王曉忠參與實驗指導(dǎo)。

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收稿日期：2022-11-25；錄用日期：2023-01-19

本文編輯：王瑩

引證本文：WANG Y， MA L， XIAO X，? et al. Mechanism of action of sphingosine kinase 1 inhibitor in a rat model of liver fibrosis［J］. J Clin Hepatol， 2023， 39（8）： 1886-1894.