二甲基亞砜對(duì)海帶配子體克隆低溫凍存的影響

錢瑞，羅世菊，李曉捷，賽珊，趙聚萍，王利芹

（山東東方海洋科技股份有限公司，國家海藻與海參工程技術(shù)研究中心，山東省海藻與海參技術(shù)創(chuàng)新中心，山東省海藻遺傳育種與栽培技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 煙臺(tái) 264003）

海帶屬（Saccharina）褐藻，具有異型世代交替生活史，包括二倍性孢子體世代和單倍性配子體世代。在自然界中，海帶配子體一般只存活14 d 左右。20 世紀(jì)70年代末，方宗熙等[1]發(fā)現(xiàn)，在人工培養(yǎng)條件下, 雌、雄配子體都能形成無性繁殖系（克隆），并能產(chǎn)生配子。海帶配子體克隆技術(shù)的建立，對(duì)海帶種質(zhì)保存、配子體克隆育苗、育種及遺傳學(xué)研究，具有極其重要的意義。

海帶種質(zhì)保存，通常采用低溫弱光液相保存法，以維持配子體的基礎(chǔ)代謝。若溫度、光照、營養(yǎng)鹽等適宜，配子體則很快進(jìn)入生長狀態(tài)，可滿足育苗、育種及研究需要。但液相保存一般需15 d更新一次培養(yǎng)液，頻繁操作，增加了種質(zhì)污染及混雜的可能[2]，并且隨著海帶保存規(guī)模的擴(kuò)大，種質(zhì)庫需要更大的空間，人力物力成本隨之增加。海帶配子體-196 ℃液氮冷凍保存技術(shù)及-80 ℃冷凍保存技術(shù)的開發(fā)[3-5]，可有效彌補(bǔ)液相保存技術(shù)的一些缺陷，特別是-80 ℃冷凍保存技術(shù)操作簡單，降低克隆污染可能性的同時(shí)，對(duì)保種空間需求更小。-80 ℃凍存海帶配子體克隆，所有克隆系均能成功保存，但每個(gè)克隆系配子體細(xì)胞存活率相對(duì)較低。現(xiàn)開展了不同濃度二甲基亞砜冷凍保護(hù)液對(duì)海帶配子體克隆低溫保存的試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

10 個(gè)品種（系）海帶克隆系（編號(hào)為A—J），每個(gè)品種（系）雌、雄配子體克隆系各取1 個(gè)（雌性編號(hào)1、雄性編號(hào)2），共20 個(gè)克隆系（A1—J1，A2—J2），均來自國家海藻與海參工程技術(shù)研究中心海藻種質(zhì)庫。培養(yǎng)溫度4～10 ℃，光照強(qiáng)度2～5 μmol/（m2·s）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 二甲基亞砜（DMSO）

設(shè)置4 個(gè)體積分?jǐn)?shù)組（5%，10%，15%和20%）的冷凍保護(hù)液，對(duì)海帶配子體于-80 ℃凍存，觀察不同濃度DMSO 對(duì)凍存海帶配子體克隆的影響。

1.2.2 復(fù)蘇后配子體

復(fù)蘇凍存的雌、雄配子體克隆，培養(yǎng)一定量后，按雌、雄質(zhì)量比2∶1[6]進(jìn)行發(fā)育試驗(yàn)，驗(yàn)證凍存配子體的繁育能力。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 克隆細(xì)胞段的獲得

取適量配子體克隆，玻片壓磨后，細(xì)胞濾液經(jīng)篩絹過濾至事先放置蓋玻片小片（蓋玻片剪切成小片，能放入凍存管）的培養(yǎng)皿中，在4～10 ℃、2～5 μmol/（m2·s）條件下培養(yǎng)7 d，使受損細(xì)胞得以修復(fù)并附著在蓋玻小片上（為便于觀察統(tǒng)計(jì)復(fù)蘇后配子體細(xì)胞存活率，將配子體細(xì)胞附著在玻片上）。

1.3.2 克隆簇狀體的預(yù)備

從10 個(gè)品種（系）中選取色素正常、狀態(tài)良好、無污染的克隆簇狀體做凍存材料，每個(gè)克隆系各稱取0.010 g，克隆簇狀體無須打碎，于-80 ℃直接凍存。

1.3.3 冷凍保護(hù)液配制

采用煮沸冷卻的海水為基礎(chǔ)液，配制5%，10%，15%和20%體積分?jǐn)?shù)的二甲基亞砜冷凍保護(hù)液，于0～4 ℃冰箱中存放，備用。

1.3.4 凍存方法

凍存管事先分別加入1 mL 4 種不同體積分?jǐn)?shù)的DMSO 冷凍保護(hù)液，做好標(biāo)記，放入-20 ℃冰柜預(yù)凍24 h 后，取出再分別加入存放于0～4 ℃冰箱相同體積分?jǐn)?shù)保護(hù)液各0.8 mL，凍存管中DMSO處于冰水混合狀態(tài)，保持0 ℃，用鑷子夾取附著克隆細(xì)胞段的蓋玻片小片或無水克隆簇狀體，分別置入不同的凍存管中，擰緊蓋子，放入0～4 ℃冷藏箱平衡30 min。平衡結(jié)束，將凍存管于-80 ℃凍存。

1.3.5 復(fù)蘇方法

將凍存10 d 的凍存管，從-80 ℃低溫冰箱快速取出，于38～39 ℃的水浴鍋解凍。用鑷子將解凍后附有克隆細(xì)胞段的蓋玻片小片及克隆簇狀體取出，分別放入培養(yǎng)皿及錐形瓶中，加低溫培養(yǎng)液，經(jīng)過幾次沖洗，去除冷凍保護(hù)劑。于4～10 ℃、2～5 μmol/（m2·s）條件下培養(yǎng)；7 d 后置于4～10 ℃、8～10 μmol/（m2·s）條件下培養(yǎng)。

1.3.6 凍存的海帶配子體繁育能力

將凍存復(fù)蘇后培養(yǎng)的同品種（系）雌、雄克隆系，按雌、雄質(zhì)量比2∶1 的比例，分別取適量克隆系，磨碎后，于細(xì)胞濾液過濾至培養(yǎng)皿。培養(yǎng)皿放置在光照強(qiáng)度22～25 μmol/（m2·s）、光周期L∶D=10∶14、溫度10～12 ℃條件下培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 凍存克隆細(xì)胞段存活及生長情況

觀察克隆細(xì)胞復(fù)蘇后與冷凍前無變化。復(fù)蘇后培養(yǎng)3 h，克隆細(xì)胞逐漸發(fā)生質(zhì)壁分離。復(fù)蘇后培養(yǎng)第7 天，基本可確定克隆細(xì)胞是否存活。相同克隆系10%和15% DMSO 體積分?jǐn)?shù)組的存活率較5%和20%體積分?jǐn)?shù)組高，見圖1（a）（b）（c）（d）和圖2（a）（b）（c）（d）。觀察10%DMSO 對(duì)克隆系A(chǔ)2 的影響，培養(yǎng)第17 天，可見細(xì)胞新生枝丫，培養(yǎng)第30 天，細(xì)胞生長繁茂，見圖3（a）（b）（c）（d）。復(fù)蘇后培養(yǎng)第62 天，存活的細(xì)胞長成簇狀體，10%和15%體積分?jǐn)?shù)組的克隆簇狀體數(shù)量明顯多于5%和20%體積分?jǐn)?shù)組，見圖4（a）（b）（c）（d）。

圖1 復(fù)蘇后培養(yǎng)第7 天，克隆系A(chǔ)2 細(xì)胞狀態(tài)（100 倍鏡）

2.2 凍存細(xì)胞段存活細(xì)胞統(tǒng)計(jì)

10%和15% DMSO 2 個(gè)體積分?jǐn)?shù)組的20 個(gè)克隆系全部有存活細(xì)胞，10%體積分?jǐn)?shù)組不同克隆系細(xì)胞存活率為0.4%～43.2%；15%體積分?jǐn)?shù)組不同克隆系細(xì)胞存活率為0.3%～32.9%；5%體積分?jǐn)?shù)組14 個(gè)克隆系有存活細(xì)胞，不同克隆系細(xì)胞存活率為0～9.2%；20%體積分?jǐn)?shù)組只有5 個(gè)克隆系有存活細(xì)胞，不同克隆系細(xì)胞成活率為0～0.9%，見表1。

表1 克隆段復(fù)蘇后培養(yǎng)7 d 細(xì)胞存活率 %

采用同一體積分?jǐn)?shù)DMSO 低溫保存海帶配子體克隆，10 個(gè)品種（系）海帶雌配子體存活率均不高于同株雄配子體的存活率（表2），可見海帶雄性配子體較雌性配子體有較高的耐受力。

表2 克隆系存活數(shù)量占比 %

2.3 凍存的克隆簇狀體

2.3.1 10%DMSO 對(duì)克隆系B1 的影響

復(fù)蘇后培養(yǎng)第3 天，在顯微鏡下觀察，海帶配子體克隆色素正常，部分細(xì)胞色素聚縮；培養(yǎng)第14天，克隆色素變綠，大部分死亡，有少量色素正常的細(xì)胞；培養(yǎng)第49 天，存活細(xì)胞無性繁殖形成絲狀體。培養(yǎng)第84 天，形成簇狀體，見圖5（a）（b）（c）（d）。

圖5 10%DMSO 對(duì)克隆系B1 的影響（100 倍鏡）

2.3.2 DMSO 4 種體積分?jǐn)?shù)對(duì)克隆系D2 的影響

復(fù)蘇后培養(yǎng)3 天，在顯微鏡下觀察，各體積分?jǐn)?shù)組海帶配子體克隆色素正常，部分細(xì)胞色素聚縮。5%體積分?jǐn)?shù)組在培養(yǎng)第35 天，發(fā)現(xiàn)存活細(xì)胞，第50 天，細(xì)胞已分裂生長，培養(yǎng)第90 天長，成簇狀團(tuán)，見圖6（a）（b）（c）（d）。10%體積分?jǐn)?shù)組，在復(fù)蘇培養(yǎng)第7 天，發(fā)現(xiàn)有存活細(xì)胞，培養(yǎng)第15 天，細(xì)胞已分裂生長，培養(yǎng)第45 天，大量簇狀團(tuán)出現(xiàn)，見圖7（a）（b）（c）（d）。15%體積分?jǐn)?shù)組在復(fù)蘇后培養(yǎng)第5 天，發(fā)現(xiàn)存活細(xì)胞，第25 天，細(xì)胞分裂生長，培養(yǎng)第50 天，大量簇狀團(tuán)出現(xiàn)，見圖8（a）（b）（c）（d）。20%體積分?jǐn)?shù)組復(fù)蘇后培養(yǎng)第50 天，發(fā)現(xiàn)龐大異常的活細(xì)胞，培養(yǎng)第80 天，細(xì)胞分裂生長，培養(yǎng)第130 天，生長成簇狀團(tuán)，見圖9（a）（b）（c）（d）。

圖6 5%DMSO 對(duì)克隆系D2 的影響（100 倍鏡）

圖7 10% DMSO 對(duì)克隆系D2 的影響（100 倍鏡）

圖8 15% DMSO 對(duì)克隆系D2 的影響（100 倍鏡）

圖9 20% DMSO 對(duì)克隆系D2 的影響（100 倍鏡）

培養(yǎng)觀察發(fā)現(xiàn)，克隆系D2 復(fù)蘇后，10%和15%體積分?jǐn)?shù)組的配子體細(xì)胞，較5%和20%體積分?jǐn)?shù)組的配子體細(xì)胞，恢復(fù)生長速度更快。

2.4 統(tǒng)計(jì)克隆簇狀體存活細(xì)胞系

對(duì)10 個(gè)海帶品種（系）雌、雄共20 個(gè)克隆系進(jìn)行凍存，復(fù)蘇后的克隆系置于溫度、光照相同的條件下培養(yǎng)。跟蹤觀察發(fā)現(xiàn)，5%體積分?jǐn)?shù)組有1 個(gè)雌克隆系未見存活細(xì)胞，10%和15%體積分?jǐn)?shù)組雌、雄所有克隆系均有存活細(xì)胞，20%體積分?jǐn)?shù)組有7個(gè)雌克隆系未見存活，克隆系存活數(shù)量占比見表3。

表3 克隆系存活數(shù)量占比 %

2.5 -80 ℃凍存后海帶配子體發(fā)育試驗(yàn)

對(duì)上述10%DMSO 冷凍保護(hù)液凍存的同株系雌、雄配子體復(fù)蘇后進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)至一定量后，進(jìn)行發(fā)育試驗(yàn)。結(jié)果表明，培養(yǎng)第14 天，少量孢子體出現(xiàn)，第21 天，大量孢子體形成，見圖10（a）（b）（c）。

圖10 凍存復(fù)蘇后海帶配子體發(fā)育能力驗(yàn)證（100 倍鏡）

為了統(tǒng)計(jì)單克隆系的細(xì)胞存活率以及便于肉眼觀察20 個(gè)克隆系的存活情況，采用打碎的細(xì)胞段及未打碎的克隆簇狀體2 種形式進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果稍有不同，5%和20%DMSO 體積分?jǐn)?shù)組，細(xì)胞段克隆系存活比例低于簇狀體克隆系存活比例。5%和20%DMSO 體積分?jǐn)?shù)可能不是海帶配子體細(xì)胞凍存的最適宜體積分?jǐn)?shù)，凍存后細(xì)胞存活率低。本試驗(yàn)采用細(xì)胞段凍存，為便于計(jì)數(shù)，細(xì)胞段不能重疊，細(xì)胞數(shù)量有限，可能會(huì)出現(xiàn)某克隆系所統(tǒng)計(jì)細(xì)胞全部死亡的結(jié)果；而采用簇狀體直接凍存，簇狀體細(xì)胞數(shù)量遠(yuǎn)大于細(xì)胞段細(xì)胞數(shù)量，簇狀體中只要有1 個(gè)細(xì)胞存活并無性繁殖，該克隆系就會(huì)存活，因此，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)簇狀體克隆系存活比例高于細(xì)胞段克隆系存活比例。

3 結(jié)論

采用5%，10%，15%，20% 4 種體積分?jǐn)?shù)的DMSO 冷凍保護(hù)液，進(jìn)行海帶配子體克?。?xì)胞段和克隆團(tuán)），于-80 ℃凍存，經(jīng)復(fù)蘇后培養(yǎng)，DMSO各體積分?jǐn)?shù)組均有海帶配子體細(xì)胞存活，10%和15%體積分?jǐn)?shù)組凍存的所有克隆系均有存活細(xì)胞，5%和20%體積分?jǐn)?shù)組僅部分克隆系有存活細(xì)胞。對(duì)于相同克隆系，10%和15%體積分?jǐn)?shù)組配子體存活率高于5%和20%體積分?jǐn)?shù)組。結(jié)果表明，海帶配子體凍存可用10%和15%DMSO 作為冷凍保護(hù)液。為降低成本，優(yōu)選10%DMSO作為冷凍保護(hù)液，凍存不影響海帶配子體繁育能力，其在-80℃凍存復(fù)蘇后培養(yǎng)，可正常發(fā)育為孢子體。