混合分離分析法在水產(chǎn)動物基因定位中的應(yīng)用

郭亞東，王文權(quán)，孟乾，徐大鳳，李雪燕，于雯雯*

（1.如東縣漁政監(jiān)督大隊(duì)，江蘇 南通 226241；2.江蘇省海洋水產(chǎn)研究所，江蘇省魚類遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南通 226007；3.煙臺市芝罘區(qū)現(xiàn)代海洋產(chǎn)業(yè)發(fā)展促進(jìn)中心，山東 煙臺 264001）

對目標(biāo)性狀關(guān)聯(lián)基因進(jìn)行篩選和定位，是水產(chǎn)動物遺傳育種研究的前提和基礎(chǔ)。傳統(tǒng)的基因定位方法，需要對整個遺傳群體進(jìn)行多態(tài)性標(biāo)記分析，成本較高?；旌戏蛛x分析法（Bulked segregant analysis, BSA），是根據(jù)研究的目的性狀，從子代分離群體中，選取2 組表型差異的極端個體，分別等量混合構(gòu)建DNA 池，進(jìn)行標(biāo)記差異分析，2 池間的DNA 差異片段即為候選區(qū)域。該方法可以相對較低的成本，快速檢測分子標(biāo)記與目標(biāo)性狀的關(guān)聯(lián)，常被用于生物體極端性狀相關(guān)基因的定位與挖掘[1]。

BSA 技術(shù)最早由Michelmore 等[2]，于1991年應(yīng)用于萵苣抗霜霉病基因相關(guān)標(biāo)記的篩選，成功獲得3 個與霜霉病抗性基因Dm5/8 緊密連鎖的RAPD標(biāo)記。BSA 法在農(nóng)作物基因篩選與定位中應(yīng)用最為普遍[3]，在畜禽[4]、林木[5]、水產(chǎn)動物[6]研究中，也顯示出巨大的應(yīng)用潛力和發(fā)展前景。隨著分子標(biāo)記技術(shù)和近10年來新一代測序（NGS）技術(shù)的發(fā)展，BSA 方法和技術(shù)體系也逐漸得到發(fā)展和完善。與此同時，不斷降低的測序成本加速了基于NGS 的BSA 在水產(chǎn)中的應(yīng)用?，F(xiàn)對BSA 技術(shù)在水產(chǎn)動物方面的應(yīng)用研究，特別是基于測序的BSA 方法在基因定位上最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 基于傳統(tǒng)分子標(biāo)記的BSA 法

BSA 技術(shù)的進(jìn)步，依賴于分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展。在測序成本大幅降低之前，BSA 方法主要采用傳統(tǒng)分子標(biāo)記技術(shù)，如限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）、簡單序列重復(fù)（SSR）、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）等。

1999年，Palti 等[7]首次將BSA 方法用于水產(chǎn)動物目標(biāo)基因篩選，利用抗傳染性造血器官壞死?。↖HN）的切喉鱒（Oncorhynchus clarki）與虹鱒（Oncorhynchus mykiss），雜交獲得16 個全同胞雜交家系，這些家系在受IHN 病毒攻擊后，收集易感群體和耐受群體，采用RFLP 標(biāo)記技術(shù)和BSA 方法，獲得33 個差異性位點(diǎn)。此后，BSA 被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動物目標(biāo)基因的篩選與定位研究，尤其是在性別研究領(lǐng)域。Felip 等[8]利用BSA-AFLP 法，在虹鱒中篩選出19 對與性別相關(guān)的AFLP 引物，并將其中15 個轉(zhuǎn)化為特異性序列擴(kuò)增（SCAR）標(biāo)記，其中1個標(biāo)記被成功定位于Y 染色體的性位點(diǎn)附近。Lee等[9-10]采用BSA 方法，從尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）中分別獲得了與性別相關(guān)的8 個SSR 標(biāo)記和3 個AFLP 標(biāo)記。此外，BSA 法結(jié)合傳統(tǒng)分子標(biāo)記技術(shù)，還被應(yīng)用于日本對蝦（Penaeus japonicus）[11]、斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）[12]、巨骨舌魚（Arapaima gigas）[13]性別基因相關(guān)研究中。BSA 法在貝類殼色和魚類耐溫、蝦類生長相關(guān)研究中，也取得一些進(jìn)展。Qin 等[14]通過將橙殼色與白殼色海灣扇貝（Argopecten irradians）雜交，獲得F1 代分離群體，采用BSAAFLP 方法，篩選出6 個與殼色顯著相關(guān)的標(biāo)記，這6 個標(biāo)記全部位于同一個連鎖群，且其中一個標(biāo)記（F1f335）與橙殼基因完全連鎖。Ge 等[15]采用BSA法，在太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）中篩選出7 個與殼色緊密相關(guān)的多態(tài)性AFLP 片段，成功開發(fā)了1 個共顯性SCAR 標(biāo)記，并將其整合到先前構(gòu)建的連鎖圖譜中。Chen 等[16]使用BSA 方法，篩選和鑒定了與大黃魚（Larimichthys crocea）耐熱性相關(guān)的4 個SSR 擴(kuò)增片段，這些片段被克隆和測序后，顯示核心序列都是“AC”重復(fù)。袁晨浩[17]也采用BSA-SSR 技術(shù)，在紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）耐低溫和不耐低溫群體間，篩選出3 個有顯著差異的擴(kuò)增片段。在生長性狀相關(guān)基因的研究方面，He 等[18]采用BSA方法，結(jié)合RAPD 技術(shù)，篩選與中國對蝦（Fenneropenaeus chinensis）生長性狀相關(guān)的候選標(biāo)記，獲得了9 個與生長性狀相關(guān)的RAPD 標(biāo)記，其中包括7 個正相關(guān)和2 個負(fù)相關(guān)，并最終轉(zhuǎn)化獲得2 個差異性的SCAR 標(biāo)記。隨著NGS 技術(shù)的發(fā)展，傳統(tǒng)分子標(biāo)記技術(shù)逐漸被邊緣化，基于傳統(tǒng)分子標(biāo)記技術(shù)BSA在水產(chǎn)動物基因定位中，也逐漸被淘汰。

2 基于轉(zhuǎn)錄組測序的BSA 法

隨著NGS 技術(shù)的研究進(jìn)展，使得通過轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）分析，可以在轉(zhuǎn)錄組水平上快速、全面的了解變異，將BSA 與RNA-seq 相結(jié)合的綜合技術(shù)方案又被稱為BSR（Bulked segregant RNAseq），將對基因表達(dá)和基因定位的研究相結(jié)合，通過檢測單核苷酸多態(tài)性（SNP）和計算基因頻率，尋找控制不同性狀的關(guān)鍵基因[19]。

BSR 技術(shù)于2012年在植物研究中被較早報道[20-21]。2013年，Wang 等[22]較早將BSR 技術(shù)應(yīng)用于水產(chǎn)動物基因研究，篩選（Ictalurus sp.）腸道敗血癥（ESC）抗病相關(guān)基因，在易感魚和抗性魚中，分別鑒定出1 240 和224 個基因于ESC 感染后差異表達(dá)，獲得17 個可能與抗病相關(guān)的候選基因。該研究認(rèn)為，BSR 技術(shù)較基因芯片分析技術(shù)更加靈敏、成本更低，尤其適用于對各種表型性狀相關(guān)基因進(jìn)行分析。Dai 等[23]使用剩余采食量（RFI）作為飼料效率的衡量標(biāo)準(zhǔn)，通過BSR 分析，獲得11 026 個在凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）高效和低效集群之間表現(xiàn)出顯著等位基因失衡的SNP 標(biāo)記，其中568 個標(biāo)記位于差異表達(dá)基因中。Wang 等[24]在凡納濱對蝦Zoea I 幼體階段，獲得了60 個雌性和雄性之間的差異表達(dá)基因，注釋了其中41 個基因，并最終獲得了2 個與性別完全連鎖的基因，這2 個基因可能位于凡納濱對蝦的性別決定區(qū)域。Liu 等[25]利用基于基因組和遺傳連鎖群的BSR 分析，將卵形鯧鲹（Trachinotus blochii）的耐缺氧相關(guān)SNPs，定位于18 和22 號連鎖群，并在肝臟中獲得17 個差異表達(dá)基因。對這些基因的注釋分析表明，葡萄糖和脂質(zhì)代謝的平衡，在魚類缺氧耐受性中起著關(guān)鍵作用。2019年，Wan 等[26]將BSR 與GWAS 分析方法相結(jié)合，在大黃魚中發(fā)現(xiàn)了IL10、THBS1、IGSF21 等9 個抗香魚假單胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）感染的基因，獲得了5 個可以解釋56.6%的遺傳變異的SNP 標(biāo)記。上述研究表明，借助BSR 與GWAS 方法，分別在轉(zhuǎn)錄組和基因組水平鑒定候選基因，可以有效提高候選基因篩選的準(zhǔn)確性。

3 基于基因組測序的BSA 法

隨著NGS 成本的不斷降低以及第三代測序（PacBio 或Nanopore 測序）和Hi-C 技術(shù)的廣泛應(yīng)用，主要水產(chǎn)養(yǎng)殖動物全基因組測序均已完成[27]，為表型性狀相關(guān)基因的篩選和定位提供了極大的便利。盡管測序成本大幅下降，但在種群規(guī)模上，對每個個體的基因組重測序進(jìn)行遺傳分析，仍然局限于少數(shù)模式物種。采用BSA 方法，從2 個具有相對性狀的群體中，構(gòu)建DNA 混合池，進(jìn)行混池測序（Poolseq），可大幅降低測序成本，且可無偏地從大量個體中確定全基因組等位基因頻率[28]，快速檢測和注釋與性狀相關(guān)的基因位點(diǎn)，是一種經(jīng)濟(jì)高效的方法，適合在表型性狀明顯分離的群體中定位相關(guān)基因。

2019年，Wan 等[29]采用全基因組重測序和BSA方法，鑒定了與團(tuán)頭魴（Megalobrama amblycephala）肌間刺（IB）數(shù)相關(guān)的SNP。分別在6 號和11 號染色體，獲得了2 個SNP 富集區(qū)域，使用52 個SNP 進(jìn)行數(shù)據(jù)可靠性驗(yàn)證，其中5 個SNP 與IB 數(shù)性狀顯著相關(guān)。Cui 等[6]也采用此方法獲得了3 個與IB 數(shù)量顯著相關(guān)的SNP，這些標(biāo)記有效提高了IB 性狀的表型解釋率，對鯉標(biāo)記輔助選擇育種具有重要意義。在基因組數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，將BSA 法與其他基因定位方法相結(jié)合或采用多種BSA 算法聯(lián)合分析，可有效提高基因定位精度。Luo 等[30]在基因組重測序基礎(chǔ)上，通過BSA 結(jié)合全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS），在轉(zhuǎn)基因黃河鯉（Cyprinus carpio L）中，從最初篩選出的含48 個SNP 標(biāo)記的23 個生長相關(guān)候選基因中，成功鑒定了2 個生長相關(guān)基因。Zhang 等[31]收集了37 個黃姑魚（Nibea albiflora）紅頭病易感和抗病群體的樣本，進(jìn)行Pool-seq 測序后，采用χ2檢驗(yàn)、logit 回歸分析和G'值算法3 種BSA 算法聯(lián)合分析，將抗紅頭病基因定位在22 號染色體上10.90~13.11 Mb。通過功能基因注釋，在該區(qū)域發(fā)現(xiàn)了12 個參與免疫反應(yīng)的基因，主要基因均存在于NF-κB 信號通路，提示該信號通路可能在紅頭病抗性中起重要作用。

4 討論

隨著NGS 技術(shù)的發(fā)展，基于測序的BSA 技術(shù)，在許多物種檢測中得以應(yīng)用，大大減少了整體測序量和數(shù)據(jù)分析的工作量，該技術(shù)不僅提高了性狀相關(guān)基因的檢測效率，而且降低了測序成本，成為目前較為流行的基因定位方法。該技術(shù)也存在不足之處，如無法精細(xì)定位基因的區(qū)間，比較適合于質(zhì)量性狀基因定位。對于數(shù)量性狀位點(diǎn)（QTL）來說，只能對其主效的QTL 進(jìn)行標(biāo)記定位，對于微效QTL 則無能為力，而且靈敏度和精確度要低于其他的QTL 定位方法。所以在數(shù)量性狀基因定位方面，BSA 法應(yīng)用較少，主要集中在抗性性狀相關(guān)基因方面。目前大多數(shù)與BSA 相關(guān)的報告，僅提供性狀的初始定位結(jié)果，通常具有幾兆的堿基的分辨率。因此，如何在BSA 作圖的基礎(chǔ)上精細(xì)作圖，尤其是提高數(shù)量性狀相關(guān)基因定位精度，可采取以下策略進(jìn)一步提高定位精度。

（1）增加具有極端表型的分離群體的大小，水產(chǎn)動物一般繁殖能力較強(qiáng)，適當(dāng)擴(kuò)大群體規(guī)模，可以覆蓋更多的重組體，從而提高重組熱點(diǎn)區(qū)域的定位分辨率。

（2）采用BSA 方法進(jìn)行初級作圖，得到一個峰相對較高（可靠性高）的作圖區(qū)間，設(shè)計一個均勻分布的基于SNP 的競爭性等位基因特異性PCR（KASP）標(biāo)記，或裂解擴(kuò)增多態(tài)性序列（CAPS），從不包含在極端池中個體的分離群體中，隨機(jī)選擇數(shù)百個體進(jìn)行基因分型，構(gòu)建目標(biāo)區(qū)間的遺傳圖譜和QTL 圖譜[32]。

（3）將BSA 與多組學(xué)相結(jié)合，也是實(shí)現(xiàn)精細(xì)定位和候選基因篩選的有力策略。例如，BSA 和轉(zhuǎn)錄組分析聯(lián)合，進(jìn)行共定位，在定位區(qū)間內(nèi)的差異表達(dá)分析，有利于候選基因篩選[33]；BSA 結(jié)合自然種群的GWAS 分析，能提高定位精度[34]。

（4）采用合適的算法或多種算法聯(lián)合分析。歐氏距離法（ED）、SNP-index 法和G' 值法是目前常用的幾種定位算法。ED 法無須雙親基因信息，但高度依賴遺傳分離群體（如，雙親雜合度高的F1 群體），適合對水產(chǎn)動物進(jìn)行基因定位，但易產(chǎn)生假陽性；SNP-index 法得到的定位區(qū)間較大，但顯著性較低，對數(shù)量性狀基因定位的敏感度較低；G'值法具有較低的假陽性率，定位精度也更高，但不具備校正其他干擾因素的能力[35]。綜合采用多種算法進(jìn)行基因定位，也可有效提高定位精度[31]。

隨著越來越多的水產(chǎn)動物全基因組測序完成，以及相關(guān)算法和軟件的逐步完善，采用BSA 方法進(jìn)行基因定位的精度和準(zhǔn)確性，都會有很大提高，在水產(chǎn)動物性別、體色、抗性、生長等性狀相關(guān)基因精細(xì)定位中的重要性，將日益凸顯，成為水產(chǎn)動物遺傳育種研究的重要工具。