水產(chǎn)品中孔雀石綠、結(jié)晶紫藥物殘留檢測方法的優(yōu)化

田雪蓮，楊堃，蘭承興，李樹林，李雪林

（福泉市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州 福泉 550500）

孔雀石綠（malachite green, MG）為綠色有金屬光澤的晶體，易溶于水以及乙醇、甲醇和戊醇，水溶液呈藍(lán)綠色，是有毒的三苯甲烷類化學(xué)物，既是染料，也是殺菌和殺寄生蟲的化學(xué)制劑[1]。結(jié)晶紫（crystal violet, CV）是一種帶有金屬光澤的深綠色結(jié)晶性粉末，易溶于水，具有較好的殺菌作用，其結(jié)構(gòu)、性質(zhì)與孔雀石綠相似[2]。由于二者抗菌效果好，價(jià)格便宜，曾被廣泛使用于水產(chǎn)養(yǎng)殖。它們在魚體內(nèi)可分別代謝為隱色孔雀石綠和隱色結(jié)晶紫，且殘留時(shí)間長，具有潛在的致癌、致畸、致突變等副作用，已被列為水產(chǎn)養(yǎng)殖的禁用藥物[3]。因此，準(zhǔn)確快速測定水產(chǎn)品中孔雀石綠、結(jié)晶紫，具有重要意義。

目前，水產(chǎn)品中孔雀石綠、結(jié)晶紫的常用測定方法，主要有液相色譜熒光法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法和膠體金免疫層析法等[4]。《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定 高效液相色譜熒光檢測法》（GB/T 20361—2006）[5]由于前處理時(shí)間長，需多次萃取，多次離心，操作方法煩瑣，有機(jī)溶劑用量大。現(xiàn)從提取、濃縮等方面，對該國標(biāo)中水產(chǎn)品殘留檢測的前處理過程進(jìn)行了優(yōu)化，以此提升水產(chǎn)品中孔雀石綠、結(jié)晶紫的回收率與檢測靈敏度。

1 材料與方法

1.1 材料

供試魚購自農(nóng)貿(mào)市場，經(jīng)檢測，不含孔雀石綠、結(jié)晶紫類藥物。

1.2 試劑與儀器

孔雀石綠、結(jié)晶紫標(biāo)準(zhǔn)溶液由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所提供，質(zhì)量濃度為100 mg/L；酸性氧化鋁固相萃取柱（500 mg, 3 mL），PRS 固相萃取柱（500 mg, 3 mL）；乙腈為色譜純，二氯甲烷、酸性氧化鋁、二甘醇、無水乙酸銨、冰乙酸、氨水、對-甲苯磺酸、乙酸胺、硼氫化鉀、鹽酸羥胺均為分析純；試驗(yàn)用水為去離子水。分別配制0.05 mol/L對-甲苯磺酸溶液（稱取0.95 g 對-甲苯磺酸，用水稀釋至100 mL）、0.1 mol/L 乙酸胺緩沖溶液（稱取1.71 g 無水乙酸胺，溶解于1 000 mL 水中，氨水調(diào)pH 值至10）、0.125 mol/L 乙酸胺緩沖溶液（稱取9.64 g 無水乙酸胺，溶解于1 000 mL 水中，冰乙酸調(diào)pH 值至4.5）。

Agilent 1220 液相色譜儀（配熒光檢測器，美國安捷倫公司）；Scout SE 電子天平（奧豪斯儀器有限公司）；XW-80A 渦旋震蕩混合器（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；TGL 16 M 離心機(jī)（長沙邁佳森儀器設(shè)備有限公司）；0.45 μm 濾膜。

1.3 色譜條件

C18（250 mm×4.6 mm）色譜柱；流動相：乙腈+乙酸胺緩沖溶液（0.125 mol/L，pH 值4.5）=80+20（V∶V）；流量：1.3 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量20 μL；熒光檢測器激發(fā)波長265 nm，發(fā)射波長360 nm。

1.4 提取、凈化與濃縮

按照文獻(xiàn)[5]中前處理過程操作。

1.5 水產(chǎn)品中孔雀石綠、結(jié)晶紫藥物殘留的檢測

取魚肉樣品5.00 g，按照60 μg/kg 的添加量，添加2 種標(biāo)準(zhǔn)品，按照添加不同體積硼氫化鉀溶液、二氯甲烷溶液濃縮至1~2 mL，測定回收率與精密度試驗(yàn)，每個(gè)樣品平行測定3 次，計(jì)算樣品的加標(biāo)回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同體積硼氫化鉀對回收率的影響

硼氫化鉀作為強(qiáng)還原劑，能夠把樣品中殘留的孔雀石綠或結(jié)晶紫，還原為其相應(yīng)的代謝產(chǎn)物隱色孔雀石綠或結(jié)晶紫。以硼氫化鉀3，4 和5 mL進(jìn)行平行試驗(yàn)，結(jié)果見表1。按照文獻(xiàn)[5]，在加標(biāo)質(zhì)量比為60 μg/kg 條件下，孔雀石綠、結(jié)晶紫回收率分別為83.67%和71.33%；當(dāng)硼氫化鉀體積為4 mL 時(shí)，孔雀石綠、結(jié)晶紫回收率分別為91.33%和76.50%；當(dāng)硼氫化鉀體積為5 mL 時(shí)，孔雀石綠、結(jié)晶紫回收率分別為90.83%和76.00%。表明硼氫化鉀體積為4 mL，回收效果最佳，孔雀石綠、結(jié)晶紫回收率分別提升7.66%和5.17%。

表1 不同體積硼氫化鉀對孔雀石綠、結(jié)晶紫回收率的影響

2.2 不同體積二氯甲烷體積對回收率的影響

不同體積二氯甲烷對孔雀石綠、結(jié)晶紫回收率的影響見表2。采用25 和30 mL 二氯甲烷能提高孔雀石綠、結(jié)晶紫的回收率，當(dāng)二氯甲烷體積為25 mL時(shí)，孔雀石綠、結(jié)晶紫回收率分別為93.00%和73.17%，且二氯甲烷不會發(fā)生倒向。因此，二氯甲烷體積為25 mL，回收效果最佳。

表2 不同體積二氯甲烷對孔雀石綠、結(jié)晶紫回收率的影響

2.3 不同旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)最終體積對回收率的影響

不同旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)最終體積對回收率的影響見表3。由表3 可見，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)最終體積約為1 mL時(shí)，回收率最低，孔雀石綠、結(jié)晶紫分別為70.83%和64.33%；而濃縮至近干，以瓶底濕潤為準(zhǔn)，孔雀石綠、結(jié)晶紫回收率最高，分別為91.00%和76.17%。因此在試驗(yàn)中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)最終體積濃縮應(yīng)該近干，以此提升孔雀石綠、結(jié)晶紫回收率。

表3 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)最終體積對回收率的影響

3 結(jié)論

以文獻(xiàn)[5]為藍(lán)本，對魚肉中的孔雀石綠、結(jié)晶紫藥物殘留檢測方法進(jìn)行優(yōu)化及確認(rèn)，發(fā)現(xiàn)強(qiáng)還原劑硼氫化鉀的體積為4 mL、萃取劑二氯甲烷為25 mL、樣品濃縮至近干時(shí)孔雀石綠、結(jié)晶紫回收率均較高。優(yōu)化后的方法具有結(jié)果準(zhǔn)確性高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，適用于水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留的檢測。