慢病毒介導(dǎo)穩(wěn)定表達(dá)Cas9 蛋白的雞成纖維細(xì)胞系構(gòu)建及其活性驗(yàn)證

李曉嬌，朱新宇，鄒 嫻，嚴(yán) 霞，何燕華，羅成龍

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，廣東 廣州 510225；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所/畜禽育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省畜禽育種與營(yíng)養(yǎng)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640）

【研究意義】基因編輯技術(shù)對(duì)高效獲得特定表型的畜禽新品種具有重要意義，而畜禽功能基因的挖掘和開(kāi)發(fā)是選育新品種的重要手段。成簇的規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列（CRISPR/Cas9）是當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的基因編輯技術(shù)［1-2］。近年來(lái)，通過(guò)應(yīng)用CRISPR/Cas9 技術(shù)對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞、活體進(jìn)行精確基因編輯和基因功能研究，顯著加快了生物學(xué)、醫(yī)學(xué)相關(guān)研究的效率?；贑RISPR/Cas9 的基因工程技術(shù)與細(xì)胞工程技術(shù)相結(jié)合，可以不斷挖掘動(dòng)物的功能基因，豐富動(dòng)物遺傳資源，推進(jìn)動(dòng)物育種進(jìn)程。本研究建立穩(wěn)定表達(dá)Cas9 蛋白的雞成纖維細(xì)胞系（DF-1）將有利于推進(jìn)雞功能基因的挖掘工作，對(duì)加快明確雞育種進(jìn)程的主效基因具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】CRISPR/Cas9 系統(tǒng)中sgRNA 引導(dǎo)Cas9 蛋白造 成DNA 雙鏈斷裂（Double-Strand Breakage，DSB），并誘導(dǎo)DNA 自我修復(fù)，包括同源重組修復(fù)（Homology Directed Repair，HDR）、非同源末端鏈接（Non-homologous End Joining，NHEJ）和單鏈退火（Single-stranded Annealing,SSA）3 種方式［3-4］。利用DNA 自我修復(fù)的特性，可在DSB時(shí)精確敲除、插入或替換特定的堿基。CRISPR/Cas9 技術(shù)具有高效、應(yīng)用簡(jiǎn)單且成本低的優(yōu)點(diǎn)，因此在動(dòng)物和植物的遺傳育種研究中發(fā)揮重要作用［5-7］。為了快速確認(rèn)CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的編輯能力，一般采用報(bào)告系統(tǒng)便于結(jié)果的觀察［8-9］。SSA 修復(fù)機(jī)制是一種重要的DNA 重組方式，雙鏈DNA 斷裂產(chǎn)生3'ss DNA 懸臂末端，當(dāng)兩端存在同向的同源序列時(shí)，同源序列與懸臂末端通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)擬合在一起，再經(jīng)過(guò)核酸內(nèi)切酶切除多余的3'末端、聚合酶補(bǔ)齊雙鏈缺口、連接酶連接最終完成修復(fù)。近年來(lái)基于SSA 修復(fù)機(jī)制的報(bào)告系統(tǒng)相繼被報(bào)道［9-13］，其修復(fù)效率比NHEJ高10 倍［14］。Oishi 等［15］在禽細(xì)胞上利用SSA 報(bào)告載體判斷sgRNA 活性，針對(duì)卵清蛋白（OVA）和卵胞漿樣蛋白（OVM）分別設(shè)計(jì)4 條sgRNA，將Cas9 蛋白和sgRNA 共表達(dá)載體與SSA 報(bào)告載體共同轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，快速篩選出活性最好的sgRNA 序列，在后續(xù)研究中用于產(chǎn)生基因編輯雞，且無(wú)出現(xiàn)脫靶效應(yīng)。黃思嘉等［16］通過(guò)雙熒光報(bào)告載體試驗(yàn)證明了成對(duì)敲除載體的工作效率遠(yuǎn)高于單敲除載體，采用成對(duì)的AMHR2敲除載體共轉(zhuǎn)染DF-1 細(xì)胞，結(jié)果顯示AMHR2基因的突變率達(dá)到60%?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】應(yīng)用SSA 報(bào)告系統(tǒng)是快速檢測(cè)sgRNA 活性的有效手段，而在雞細(xì)胞上利用SSA 報(bào)告載體檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)Cas9 細(xì)胞系活性還未見(jiàn)報(bào)道。獲得有穩(wěn)定切割活性的穩(wěn)轉(zhuǎn)Cas9蛋白細(xì)胞系非常重要，在穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中同時(shí)引入SSA 報(bào)告載體系統(tǒng)和sgRNA 表達(dá)載體，sgRNA 能快速引導(dǎo)Cas9 蛋白切割SSA 報(bào)告載體中的靶片段，從而快速判斷Cas9 核酸酶活性，得到具有活性的穩(wěn)轉(zhuǎn)Cas9 蛋白的細(xì)胞系?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】與哺乳動(dòng)物細(xì)胞系相比，雞DF-1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較低，通過(guò)慢病毒感染DF-1 細(xì)胞篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)Cas9 的陽(yáng)性細(xì)胞，并結(jié)合SSA 報(bào)告載體驗(yàn)證其活性，可為后續(xù)在DF-1 細(xì)胞上開(kāi)展高通量篩選以及功能基因驗(yàn)證奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

DF-1、293T、DF-1-EGFP-Cas9 細(xì)胞和DH5α感受態(tài)細(xì)胞由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所保存；Lenti-Blast-Cas9、psPAX2、PMD2.G由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院贈(zèng)送，pYP152、pCMV-SSA-mCherry-HindⅢ由中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院神經(jīng)科學(xué)研究所贈(zèng)送。轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM3000、殺稻瘟菌素（Blasticidin，下文簡(jiǎn)寫為Blast）、限制性內(nèi)切酶BbsⅠ、Hind Ⅲ以及細(xì)胞培養(yǎng)用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM、PBS 緩沖液和細(xì)胞培養(yǎng)胎牛血清（FBS）購(gòu)于賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司，慢病毒感染增強(qiáng)試劑聚凝胺Polybrene 購(gòu)于西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；AG 高保真DNA 聚合酶購(gòu)于湖南艾科瑞生物工程有限公司，In fusion 同源重組酶和DNA Ligation Mix 購(gòu)于寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司，質(zhì)粒中量提取試劑盒購(gòu)于Omega Bio-tek廣州飛揚(yáng)生物工程有限公司，血液/細(xì)胞/組織基因組DNA 提取試劑盒和瓊脂糖凝膠核酸純化回收試劑盒購(gòu)于天根生化（北京）科技有限公司，LB 肉湯購(gòu)于環(huán)凱微生物有限公司，氨芐青霉素購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司，Cas9 蛋白抗體購(gòu)于艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司，HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 購(gòu)于賽信通（上海）生物試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 293T 細(xì)胞和DF-1 細(xì)胞均以含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基為完全培養(yǎng)基，分別置于37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱和39 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 Blast 工作濃度篩選 在6 孔板上接種DF-1 細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至密度為80%～90%時(shí)加入含有Blast 的完全培養(yǎng)基（DMEM+10%FBS），將1 mg/mL 的Blast 溶液用不加抗生素的完全培養(yǎng)基分別稀釋為0、2、4、6、8、10 μg/mL，每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，每隔48 h 更換1 次新鮮的篩選培養(yǎng)基。

1.2.3 穩(wěn)轉(zhuǎn)Cas9 的DF-1 細(xì)胞構(gòu)建 將293T細(xì)胞鋪板在10 cm 培養(yǎng)皿上，生長(zhǎng)至密度為70%～80% 時(shí)轉(zhuǎn)染。按 照LipofectamineTM3000 轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書轉(zhuǎn)染慢病毒三質(zhì)粒系統(tǒng)，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的總量為24 μg，3 種質(zhì)粒的比例為L(zhǎng)enti -Blast-Cas9 ∶psPAX2 ∶PMD2.G=3 ∶2 ∶1，轉(zhuǎn)染前更換新鮮的完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染6 h 后換液，并分別在轉(zhuǎn)染48、72 h 后收集慢病毒上清液，-80℃保存。之后將DF-1 細(xì)胞接種于6 孔板，生長(zhǎng)至密度為40%左右用慢病毒感染細(xì)胞，慢病毒∶完全培養(yǎng)基=1 ∶1，加入終濃度為8 μg/mL 的Polybrene 進(jìn)行培養(yǎng)，以不加入慢病毒為對(duì)照。感染24 h 后換為完全培養(yǎng)基，48 h 后加入最適工作濃度Blast 的完全培養(yǎng)基，隔天換液，直至對(duì)照處理細(xì)胞全部死亡。之后更換為含最適抗生素濃度1/2 的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。

1.2.4 單克隆細(xì)胞株的篩選 采用有限稀釋法篩選單克隆細(xì)胞株。用0.1%胰蛋白酶消化單層DF-1 細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，用完全培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋成1 000 cell/mL 后，取200 μL 細(xì)胞懸液加入96 孔板的A1 孔，其他孔加入100 μL 含2 μg/mL Blast 的篩選培養(yǎng)基，吸取100 μL A1 孔的細(xì)胞加至A2 孔，以此類推稀釋到A8 孔。再向A1～A8 孔各加入100 μL 培養(yǎng)基，混勻后分別取100 μL 加入B1～B8 孔，逐步稀釋至L1～L8 孔。觀察選擇只有單個(gè)細(xì)胞的孔，繼續(xù)培養(yǎng)2～3 周，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿后在48 孔板擴(kuò)大培養(yǎng)，依次傳代到12孔板、6 cm 皿、10 cm 皿并凍存細(xì)胞。

1.2.5 PCR 擴(kuò) 增Cas9 核酸酶DNA 片段用SnapGene 軟件分析Lenti-Blast-Cas9 慢病毒載體圖譜和序列（圖1），針對(duì)載體中的Cas9 蛋白設(shè)計(jì)引物（Lenti Cas9-F：5'ATGGACAAGAAGTAC AGCATCGGC3'；Lenti Cas9-R：5'ACAGGTC GATCCGTGTCTCGTA3'），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。提取單克隆細(xì)胞株的基因組DNA，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增Cas9 片段，PCR 反應(yīng)體系參考AG 高保真DNA 聚合酶說(shuō)明書，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸4 min，共35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

圖1 Lenti-Blast-Cas9 載體圖譜Fig.1 Lenti-Blast-Cas9 vector map

1.2.6 Western blot 驗(yàn) 證Cas9 蛋白表達(dá)將陽(yáng)性單克隆細(xì)胞在6 孔板中傳代，同時(shí)設(shè)置陰性和陽(yáng)性對(duì)照，其中陰性對(duì)照為沒(méi)有做任何處理的DF-1 細(xì)胞，陽(yáng)性對(duì)照為DF-1-EGFP-Cas9 細(xì)胞，培養(yǎng)48 h 后棄去培養(yǎng)基，用PBS 清洗2 次，然后分別在細(xì)胞中加入配制好的RIPA 蛋白裂解液，在冰上裂解20 min 后加入5×上樣緩沖液，在100 ℃金屬浴中變性10 min。之后用8% SDSPAGE 分離膠于90 V 下恒壓電泳2 h 分離蛋白樣品，300 mA 恒流轉(zhuǎn)膜2 h，室溫下用含5%BSA的TBST 封閉1 h，一抗在4℃下過(guò)夜孵育（一抗稀釋比例為1 ∶20 000），用1× TBST 洗膜3 次后在常溫下孵育二抗（二抗稀釋比例為1 ∶5 000），洗膜3 次后顯影觀察結(jié)果，用Image J軟件分析目的蛋白和內(nèi)參蛋白灰度值，計(jì)算Cas9蛋白相對(duì)表達(dá)量，用GraphPad Prism 9 軟件繪制散點(diǎn)圖。

1.2.7 sgRNA 表達(dá)載體構(gòu)建在 線（http://crispor.tefor.net/）設(shè)計(jì)靶向OVA基因的sgRNA序列，引物（OVAsgRNA top：5'caccGCCATGCCAAT GAGAACATCT3'，OVAsgRNA bottom：5'aaacAGA TGTTCTCATTGGCATGGC3'，小寫字母 為BbsⅠ粘性末端）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，純化方式為PAGE。用ddH2O 將引物稀釋到100 nmol/mL，在PCR 管中加入引物對(duì)各5 μL，在PCR 儀中退火形成寡聚核苷酸鏈，退火程序?yàn)?5℃ 5 min、65℃ 1 h。sgRNA 表達(dá)載體以pYP152 為骨架，在U6 啟動(dòng)子后帶有BbsⅠ酶切位點(diǎn)，用于插入sgRNA 序列。將pYP152 載體用BbsⅠ在37℃下酶切1 h，線性化后用5 μL DNA Ligation Mix 連接sgRNA 退火產(chǎn)物，反應(yīng)條件為16℃ 1 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α、涂板，第2 天挑菌送出測(cè)序。

1.2.8 SSA 報(bào)告載體構(gòu)建 SSA 修復(fù)機(jī)制可以快速靈敏地檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)Cas9 細(xì)胞株的切割活性，依賴于同源重組的SSA 修復(fù)機(jī)制如圖2 所示。

圖2 SSA 修復(fù)過(guò)程示意圖Fig.2 SSA repair process schematic diagram

SSA報(bào)告載體以pCMV-SSA-mCherry-HindⅢ為骨架，用軟件snapGene 設(shè)計(jì)OVA靶片段引物，該片段需要包含OVAsgRNA 序列，并添加報(bào)告載體pCMV-SSA-mCherry-Hind Ⅲ 的酶切位點(diǎn)兩端15 bp 同源臂（OVASSA F：5'caggactcctccctgA TCCTTACATTTTCACTGTTCTGCTG3'，OVASSA R：5'ccttggtcaccttcaCCTCTGAGCTATGCAGTTTCC AA3'，小寫字母為Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)兩端15 bp 同源臂）。PCR 擴(kuò)增OVA靶片段，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共35 個(gè)循環(huán)。對(duì)報(bào)告載體用Hind Ⅲ在37℃下酶切15 min，用天根DNA 回收試劑盒純化靶片段PCR 產(chǎn)物和報(bào)告載體酶切產(chǎn)物，之后用In fusion 酶連接，連接體系為：PCR純化產(chǎn)物200 ng、酶切產(chǎn)物50 ng、5× In-fusion HD Enzyme Premix 2 μL，補(bǔ)水至10 μL，在50℃下反應(yīng)15 min，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，涂板，第2 天挑選單克隆菌送出測(cè)序。

1.2.9 DF-1 穩(wěn)轉(zhuǎn)Cas9 蛋白細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 對(duì)穩(wěn)轉(zhuǎn)Cas9 蛋白的DF-1 細(xì)胞用含2 μg/mL Blast 的篩選培養(yǎng)基在39℃下培養(yǎng)，細(xì)胞長(zhǎng)滿后將細(xì)胞接種到24 孔板，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染試驗(yàn)，轉(zhuǎn)染試劑為L(zhǎng)ipfectamineTM3000，按照說(shuō)明書操作，sgRNA 表達(dá)載體和SSA 報(bào)告載體比例為1 ∶1，總量為1 μg。設(shè)置DF-1 僅轉(zhuǎn)染pCMV-OVA-SSA-mCherry-Hind Ⅲ的陰性對(duì)照，DF-1 共轉(zhuǎn)Lenti -Blast-Cas9、pYP152-OVAsgRNA 以 及pCMV-OVA-SSA-mCherry-Hind Ⅲ的陽(yáng)性，其他4 株單克隆細(xì)胞株共轉(zhuǎn)pYP152-OVAsgRNA 和pCMV-OVA-SSA-mCherry-Hind Ⅲ，轉(zhuǎn)染48 h 后在熒光顯微鏡下觀察熒光。

2 結(jié)果與分析

2.1 Blast 最佳工作濃度

用含有不同濃度Blast 的培養(yǎng)基培養(yǎng)DF-1 細(xì)胞，以培養(yǎng)7 d 后細(xì)胞全部死亡的Blast 濃度為DF-1 穩(wěn)轉(zhuǎn)Cas9 細(xì)胞株篩選的最適工作濃度，結(jié)果（圖3）表明，Blast 濃度為4 μg/mL 時(shí)，培養(yǎng)7 d 后細(xì)胞全部死亡，因此，選擇4 μg/mL 為Blast的最適工作濃度。

圖3 不同濃度Blast 培養(yǎng)DF-1 細(xì)胞7 d 后的細(xì)胞狀態(tài)（4×）Fig.3 Cell status of DF-1 cells after 7 days of culture with different concentrations of Blast (4×)

2.2 單克隆細(xì)胞株的篩選

利用含4 μg/mL Blast 的培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d 后陰性對(duì)照細(xì)胞全部死亡，慢病毒感染組還有少量存活細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)3 d 后，換為含2 μg/mL Blast 的培養(yǎng)基維持篩選，再培養(yǎng)1 周后明顯觀察到慢病毒感染組形成多個(gè)單克隆細(xì)胞（圖4）。用有限稀釋法以10 個(gè)96 孔板將這些單克隆細(xì)胞進(jìn)行稀釋，最終獲得27 株單克隆細(xì)胞株。

圖4 穩(wěn)定表達(dá)Cas9 蛋白的DF-1 陽(yáng)性細(xì)胞Fig.4 DF-1 positive cells of stably expressing Cas9 protein

2.3 單克隆細(xì)胞株Cas9 蛋白表達(dá)驗(yàn)證

提取單克隆細(xì)胞株的DNA，PCR 擴(kuò)增Cas9核酸酶DNA 片段，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，單克隆細(xì)胞株在4 140 bp 處均有明顯的目的條帶，而陰性的DF-1 細(xì)胞未檢測(cè)到任何條帶（圖5A）。提取細(xì)胞總蛋白，Western blot 結(jié)果表明，挑選的DF-1 穩(wěn)轉(zhuǎn)株均表達(dá)Cas9 蛋白，且DF-1細(xì)胞不表達(dá)（圖5B）。用Image J 分析灰度值后，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白的比值并做歸一化處理，使用GraphPad Prism 9 得到穩(wěn)轉(zhuǎn)Cas9 蛋白細(xì)胞系的Cas9 蛋白表達(dá)量散點(diǎn)圖（圖5C），這些穩(wěn)轉(zhuǎn)株的Cas9 表達(dá)水平均不一致，選擇其中幾株表達(dá)較高的細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，用于后續(xù)的SSA 修復(fù)活性檢測(cè)。

圖5 單克隆細(xì)胞株Cas9 蛋白表達(dá)驗(yàn)證Fig.5 Validation of Cas9 protein expression in a monoclonal cell line

2.4 sgRNA 表達(dá)載體與SSA 報(bào)告載體的構(gòu)建

為了構(gòu)建sgRNA 表達(dá)載體，用BbsⅠ酶切pYP152 線性化載體（圖6A），與退火的OVAsgRNA 序列相連，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α 后在氨芐抗性固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑取單克隆菌落，由天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司測(cè)序，結(jié)果顯示OVAsgRNA 序列插入pYP152 載體的位置、方向和序列均正確，成功構(gòu)建OVAsgRNA 表達(dá)載體。PCR擴(kuò)增OVA靶片段，瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證條帶正確，切膠，用試劑盒回收DNA 片段（圖6C），與線性化的pCMV-mCherry-SSA-Hind Ⅲ載體連接，轉(zhuǎn)化后挑取單克隆菌落，菌液測(cè)序結(jié)果與克隆載體進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果（圖6D）顯示有408 bp 插入，該OVA靶片段包含正確的sgRNA 序列和對(duì)應(yīng)的PAM 位點(diǎn)，成功構(gòu)建SSA 報(bào)告載體。所構(gòu)建的pYP152-OVAsgRNA 表達(dá)載體和pCMV-OVASSA-mCherry-Hind Ⅲ報(bào)告載體用于后續(xù)共轉(zhuǎn)檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)Cas9 蛋白細(xì)胞的切割活性。

圖6 sgRNA 表達(dá)載體和SSA 報(bào)告載體構(gòu)建結(jié)果Fig.6 Construction results of sgRNA expression vector and SSA reporter vector

2.5 基于SSA 報(bào)告載體檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株活性

將構(gòu)建好的sgRNA 表達(dá)載體和SSA 報(bào)告載體共轉(zhuǎn)穩(wěn)定表達(dá)Cas9 蛋白的DF-1 細(xì)胞系，轉(zhuǎn)染48 h 后通過(guò)熒光顯微鏡觀察每株細(xì)胞的SSA 修復(fù)情況。由圖7 可見(jiàn)，單轉(zhuǎn)報(bào)告載體的細(xì)胞不表達(dá)紅色熒光，說(shuō)明SSA 報(bào)告載體在插入一段外源序列后不表達(dá)紅色熒光，而瞬時(shí)轉(zhuǎn)染慢病毒載體Lenti-Blast-Cas9、sgRNA 表達(dá)載體、SSA 報(bào)告載體以及其他DF-1 穩(wěn)轉(zhuǎn)株均有不同程度的紅色熒光，表明篩選到的穩(wěn)轉(zhuǎn)Cas9 蛋白的DF-1 細(xì)胞系均可表達(dá)Cas9 蛋白，且在sgRNA 的引導(dǎo)下發(fā)揮切割DNA 的作用，并誘發(fā)細(xì)胞的SSA 修復(fù)機(jī)制，恢復(fù)紅色熒光。

圖7 穩(wěn)定表達(dá)Cas9 蛋白細(xì)胞株轉(zhuǎn)染結(jié)果(10×) Fig.7 Transfection results of cell lines of stably expressing Cas9 protein (10×)

3 討論

慢病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒，可以感染處于分裂期和非分裂期的多種類型細(xì)胞，常被用于攜帶大片段的外源基因，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下高效整合到目的細(xì)胞基因組中［17］，構(gòu)成穩(wěn)定表達(dá)外源基因的細(xì)胞系。DF-1 細(xì)胞作為大多數(shù)禽類病毒易感細(xì)胞，常被用于研究禽病產(chǎn)生經(jīng)過(guò)和發(fā)病機(jī)制［18］。本研究使用慢病毒載體Lenti-Blast-Cas9 與其他兩個(gè)慢病毒輔助質(zhì)粒，在293T 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染包裝產(chǎn)生Cas9慢病毒，該慢病毒載體攜帶Blast抗性標(biāo)簽，感染DF-1 細(xì)胞后篩選出具有Blast 抗性的穩(wěn)定表達(dá)Cas9 蛋白的細(xì)胞，結(jié)合SSA 報(bào)告載體證明該細(xì)胞具有產(chǎn)生DSB 的能力，表明成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)Cas9 蛋白的DF-1 細(xì)胞，這為今后研究雞的功能基因以及構(gòu)建雞全基因組CRISPR/Cas9 敲除細(xì)胞庫(kù)奠定基礎(chǔ)。

近年來(lái)，基于報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)基因編輯系統(tǒng)中核酸酶、sgRNA 活性的方式逐漸興起。報(bào)告系統(tǒng)通常包括報(bào)告細(xì)胞和報(bào)告載體，其工作原理是利用基因編輯系統(tǒng)在報(bào)告基因編碼區(qū)引起DSB，之后通過(guò)NHEJ、HDR 或SSA 修復(fù)抑制或者恢復(fù)報(bào)告基因表達(dá)，報(bào)告基因可選抗生素抗性基因、熒光蛋白等，可以直觀、快速并靈敏地觀察結(jié)果［14,19］。SSA 修復(fù)由同源重組介導(dǎo)且不需要額外引入模板鏈，在DSB 位點(diǎn)存在重復(fù)序列時(shí)，雙鏈斷裂的末端會(huì)暴露單鏈DNA，這些單鏈DNA 上的反向重復(fù)序列會(huì)通過(guò)互補(bǔ)配對(duì)形成環(huán)狀DNA 結(jié)構(gòu)，再由內(nèi)切酶和DNA 聚合酶發(fā)揮作用使DNA雙鏈斷裂得到修復(fù)［20-21］，從而恢復(fù)SSA 載體中報(bào)告基因的表達(dá)［22］。本研究篩選到Blast 陽(yáng)性單克隆細(xì)胞后，為了快速檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)Cas9 蛋白細(xì)胞的活性，采用SSA 報(bào)告系統(tǒng)，實(shí)驗(yàn)流程簡(jiǎn)單，只需將已確定有活性的OVAsgRNA 序列和構(gòu)建含有OVA靶片段的SSA 報(bào)告載體共轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)Cas9蛋白的細(xì)胞，48 h 后即可直接觀察到mCherry 恢復(fù)表達(dá)的情況，SSA 報(bào)告載體系統(tǒng)應(yīng)用于檢測(cè)核酸酶活性，避免了復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)過(guò)程，從而節(jié)約時(shí)間和成本。

通過(guò)基因敲除或插入研究基因功能是必不可少的生物技術(shù)手段。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)適用于編輯任何細(xì)胞類型的基因，目前在人和小鼠方面已經(jīng)建立了較為成熟的應(yīng)用體系［23-25］，采用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)研究豬的功能基因（如CD163、MSTN等）也已經(jīng)有突破性進(jìn)展［26-29］，相關(guān)功能基因的敲除均產(chǎn)生了具有特定表型的豬。近年也有利用CRISPR/Cas9 技術(shù)進(jìn)行雞已知功能基因的研究，研究表明，W38純合敲除雞可以抵抗禽白血病侵襲［30］；DMRT1的敲除證明該基因與雞睪丸發(fā)育至關(guān)重要［31-32］。目前已知的雞生長(zhǎng)性能、器官發(fā)育以及抗病性等相關(guān)功能基因還較少。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在禽類研究方面的應(yīng)用近幾年才開(kāi)始，且面臨sgRNA 脫靶、編輯效率低以及CRISPR 遞送方式困難等問(wèn)題［33］。本研究結(jié)果表明，SSA 報(bào)告載體系統(tǒng)在檢測(cè)Cas9核酸酶活性方面發(fā)揮重要作用。在應(yīng)用CRISPR/Cas9 進(jìn)行基因編輯時(shí)，往往需要設(shè)計(jì)多條sgRNA進(jìn)行驗(yàn)證，最終選擇1 條活性最高的sgRNA 進(jìn)行后續(xù)研究［34］，因此后續(xù)可以利用SSA 報(bào)告載體系統(tǒng)并結(jié)合穩(wěn)轉(zhuǎn)Cas9 蛋白的DF-1 細(xì)胞來(lái)快速篩選切割效率高的sgRNA。本研究中穩(wěn)轉(zhuǎn)Cas9 蛋白的DF-1 細(xì)胞不僅可以用于功能基因驗(yàn)證，還可用于高通量篩選功能基因。

4 結(jié)論

本研究利用慢病毒載體系統(tǒng)獲得長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)Cas9 蛋白的雞DF-1 細(xì)胞系。鑒于SSA 報(bào)告載體系統(tǒng)的高效性，本研究構(gòu)建了SSA 報(bào)告載體，結(jié)合CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的作用快速檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的修復(fù)活性。SSA 報(bào)告系統(tǒng)結(jié)果顯示，上述建立的穩(wěn)定表達(dá)Cas9 蛋白的DF-1 細(xì)胞具有不同水平的SSA 修復(fù)能力，表明本研究得到了穩(wěn)定表達(dá)Cas9 蛋白且具有Cas9 核酸酶活性的DF-1 細(xì)胞系，可為后續(xù)在雞細(xì)胞水平上進(jìn)行功能基因篩選及鑒定等相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。