殼寡糖和幾丁寡糖的制備方法及其在水產(chǎn)上的應(yīng)用

盧春蘭，王 蓓

（廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院/廣東省水產(chǎn)動物病害防控與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物病害控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524000）

幾丁質(zhì)（又名甲殼質(zhì)、甲殼素），廣泛存在于甲殼動物如蝦、蟹的外殼，是大多數(shù)真菌、藻類和昆蟲細(xì)胞壁的成分，是自然界中除纖維素以外的第二大類天然多糖。幾丁質(zhì)經(jīng)脫乙酰化處理后可得到殼聚糖。幾丁質(zhì)和殼聚糖均不溶于水，故其開發(fā)應(yīng)用受影響。鑒于此，許多學(xué)者致力于降解幾丁質(zhì)或殼聚糖以期得到可溶性低聚糖，其中包括殼寡糖和幾丁寡糖。殼寡糖（Chitosan Oligosaccharide，COS）是由β-1,4 糖苷鍵連接的2-乙酰氨基-2-脫氧-β-D-葡萄糖醛酸糖（GlcNAc）和2-氨基-2-脫氧-β-D-吡喃葡萄糖（GlcN）組成的低聚糖，共有2～10 個氨基葡萄糖單元，聚合度（Degree of Polymerization，DP）小于20%，分子量（Molecular Weight，MW）≤3 200 Da［1-6］。幾丁寡糖，又稱N-乙酰氨基殼寡糖（N-acetyl chito-oligosaccharides，NAc-COS），是由2～10個N-乙酰氨基葡萄糖以β-1,4 糖苷鍵連接而成的糖類總稱（GluNAc2～GluNAc10）［7］。殼寡糖和幾丁寡糖已被證實(shí)具有良好的水溶性以及多種生物活性，在生物醫(yī)藥和功能食品領(lǐng)域表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景，目前在水產(chǎn)的應(yīng)用上已開展了一些試驗(yàn)性探索，多用于促生長以及增強(qiáng)魚類的抗菌性、抗氧化性等，應(yīng)用價值極高。

我國是水產(chǎn)養(yǎng)殖大國，但近幾年來由于盲目擴(kuò)大養(yǎng)殖規(guī)模和養(yǎng)殖密度，導(dǎo)致養(yǎng)殖環(huán)境不斷惡化，發(fā)病率的明顯升高給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。激素、抗生素、化學(xué)合成藥物等對水產(chǎn)動物疾病預(yù)防和控制有一定療效。但由于這些漁藥的不合理使用，尤其是抗生素類藥物的濫用導(dǎo)致出現(xiàn)許多問題，包括耐藥菌株、藥物殘留、微生態(tài)環(huán)境失衡和抑制吞噬細(xì)胞使免疫系統(tǒng)遭受破壞等，致使水產(chǎn)品的品質(zhì)下降，嚴(yán)重威脅水產(chǎn)養(yǎng)殖可持續(xù)發(fā)展、綠色發(fā)展。天然產(chǎn)物及其衍生物，例如殼寡糖和幾丁寡糖，由于安全無毒、無殘留且具有多種生物活性而逐漸引起眾多學(xué)者重視，研究方向主要集中于殼寡糖和幾丁寡糖作為綠色飼料添加劑或疫苗佐劑影響魚類的生理代謝功能上?；诖?，本文綜述了殼寡糖和幾丁寡糖的制備方法，探討了殼寡糖和幾丁寡糖在水產(chǎn)動物飼料添加劑、漁用疫苗佐劑和水產(chǎn)品保水保鮮中的應(yīng)用，以期為殼寡糖和幾丁寡糖在水產(chǎn)漁業(yè)上的深入研究和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供參考。

1 殼寡糖和幾丁寡糖的制備

1.1 酶解法

酶解法是采用幾丁質(zhì)酶使幾丁質(zhì)在生物聚合物的末端或內(nèi)部β-1-4-糖苷鍵處裂解，產(chǎn)生基本上乙酰化的低聚糖。酶制劑可分為特異性酶和非特異性酶，殼聚糖酶、幾丁質(zhì)酶均為特異性酶；纖維素酶、木聚糖酶、α-淀粉酶、果膠酶、木瓜蛋白酶、β-糖苷酶、脂肪酶和胃蛋白酶均為非特異性酶［8-9］。此外，由殼聚糖酶和纖維素酶組成的復(fù)合酶體系比單一使用的酶對底物具有更高的消化效率和更強(qiáng)的親和力。殼聚糖酶和纖維素酶在45 ℃條件下水解幾丁質(zhì)6 h，DP 6～8 的COS 得率為79.84%，能滿足目前工業(yè)化生產(chǎn)的要求［10］。目前對殼聚糖酶和幾丁質(zhì)酶的底物結(jié)合和催化機(jī)制研究較為深入。

殼聚糖酶46A（GsCsn46A）的分子結(jié)構(gòu)包含9 個α-螺旋和2 個β 鏈，可分為2 個結(jié)構(gòu)域，其中上結(jié)構(gòu)域包含4 個α-螺旋（α1～α4），下結(jié)構(gòu)域由α6～α9 螺旋和β1～β2 鏈組成，2 個β 鏈折疊成兩個球狀結(jié)構(gòu)域，底物殼五糖(GlcN)5和殼四糖(GlcN)4位于它們之間（圖1），其中最長的螺旋α5 跨越兩個結(jié)構(gòu)域，構(gòu)成連接兩個結(jié)構(gòu)域的主鏈。殼聚糖酶識別聚合底物的三步反應(yīng)機(jī)理如下：殼聚糖酶首先識別底物并結(jié)合底物；催化位點(diǎn)在與底物結(jié)合后發(fā)生構(gòu)象變化，由開放型變?yōu)榉忾]型；隨后酶可能會繼續(xù)與其他亞位點(diǎn)上的殘基相互作用，以穩(wěn)定底物-酶復(fù)合物（圖2）［11］。

圖1 殼聚糖酶46A 與底物(GlcN)5（A）、(GlcN)4（B）復(fù)合物的整體結(jié)構(gòu)［11］Fig.1 Overall structure of chitosanase 46A in complex with substrate (GlcN)5 (A) and (GlcN)4 (B)［11］

圖2 殼聚糖酶46A 的底物識別機(jī)制［11］Fig.2 A substrate recognition mechanism for chitosanase［11］

而幾丁質(zhì)酶可根據(jù)作用方式分為三大類：（1）外幾丁質(zhì)酶：從還原性端和非還原性端裂解幾丁質(zhì)鏈形成(GlcNAc)2等；（2）內(nèi)幾丁質(zhì)酶：在幾丁質(zhì)的內(nèi)部隨機(jī)裂解糖苷鍵，產(chǎn)生可溶性的低分子量GlcNAc 多聚體，如殼四糖、殼三糖和殼二糖；（3）β-N-乙酰氨基葡萄糖酶：從幾丁質(zhì)鏈主鏈連續(xù)催化非還原端去除GlcNAc 殘基。生產(chǎn)COS 需要內(nèi)幾丁質(zhì)酶，生產(chǎn)NAc-COS 需要外幾丁質(zhì)酶和β-N-乙酰氨基葡萄糖酶。以膠體幾丁質(zhì)為底物時，幾丁質(zhì)酶的降解產(chǎn)物主要為幾丁二糖和單糖；以水溶性殼聚糖為底物時，降解產(chǎn)物除單糖、幾丁二糖外，還存在其他單元結(jié)構(gòu)的COS［12］。細(xì)菌和真菌生產(chǎn)的幾丁質(zhì)酶屬于糖基水解酶18（GH18），而GH19 主要為植物生產(chǎn)的幾丁質(zhì)酶［13］。為了獲得COS 和NAc-COS 的高產(chǎn)率，目前已鑒定、表征和運(yùn)用了大量的幾丁質(zhì)酶，幾丁質(zhì)酶降解幾丁質(zhì)的條件如表1 所示。

表1 幾丁質(zhì)酶降解幾丁質(zhì)的條件Table 1 Conditions for chitin degraded by chitinase

1.2 化學(xué)法

化學(xué)法是通過酸和氧化劑破壞聚合物分子內(nèi)或者分子間的氫鍵以達(dá)到降解的目的。幾丁質(zhì)的化學(xué)轉(zhuǎn)化常用酸有鹽酸、硫酸、乙酸、乳酸、三氯乙酸和甲酸等，常用氧化劑有過氧化氫、臭氧、過硼酸鈉、過硫酸鉀等。采用傳統(tǒng)化學(xué)法制備的具體過程為：將殼聚糖溶于2%（W/V）乙酸中，然后將30%（V/V）過氧化氫加入溶液中，在70 ℃下攪拌反應(yīng)2 h 后，溶液冰浴，使用NaOH 中和至pH=8.0，通過沉淀除去高分子量殼聚糖，再以乙醇進(jìn)行分餾，離心沉淀，洗滌并真空干燥，最終得到COS［1］。由于上述化學(xué)法使用的揮發(fā)性有機(jī)溶劑對于環(huán)境和人體健康有一定危害，因此，亟需開發(fā)一種環(huán)境友好的技術(shù)。溶液等離子體工藝（Solution Plasma Process，SPP）技術(shù)和離子液體克服了傳統(tǒng)揮發(fā)性有機(jī)溶劑的局限性，成為一種新型替代品。SPP 技術(shù)是施加電壓以在液體中產(chǎn)生活性自由基和分子（例如OH-），產(chǎn)生的羥基自由基破壞了氫鍵，破壞了殼聚糖的有序晶體結(jié)構(gòu)。該技術(shù)聯(lián)合注入空氣法，可以加速殼聚糖的降解過程，其原因是注入氣泡可以顯著增加氣體和液體的接觸表面積并產(chǎn)生更高能量的電子，從而產(chǎn)生更多的氧化物質(zhì)。此外，鼓泡氣體可以提高傳質(zhì)速率，提高反應(yīng)性物質(zhì)擴(kuò)散到液體中的效率，從而促進(jìn)氧化反應(yīng)［24-25］。離子液體是一種新興的綠色溶劑，具有蒸氣壓低，穩(wěn)定性、溶解性和再利用性好等特點(diǎn)。它通過破壞多糖（幾丁質(zhì)、殼聚糖和COS）分子內(nèi)和分子間的氫鍵，在多糖的陰離子、液體和羥基之間重新形成新的氫鍵，導(dǎo)致形成具有水合凝膠狀結(jié)構(gòu)的無定形幾丁質(zhì)，結(jié)晶度相對較低，從而可有效進(jìn)行降解［13］。研究表明，殼聚糖在四氟硼酸甘氨酸體系中的降解效果優(yōu)于在乙酸體系中的降解效果。在此條件下，COS 的平均分子量約為1 500 Da，產(chǎn)率為76.36%［26］。

1.3 物理法

物理法也被用于COS 的生產(chǎn)，是通過超聲波、γ 射線、微波輻射或者球磨機(jī)使幾丁質(zhì)分子內(nèi)的化學(xué)鍵斷裂從而得到不同聚合度分子［27］。Hai等［28］通過γ 射線從殼聚糖中分離出COS，最后在甲醇-丙酮溶液中沉淀分離。Hien 等［29］通過γ 射線照射存在于過氧化氫溶液中的殼聚糖獲得COS產(chǎn)品。Margoutidis 等［30］使用球磨機(jī)以受控方式在2 h 內(nèi)使幾丁質(zhì)結(jié)晶度降低50%，結(jié)晶度降低與分子間氫鍵的減少和糖苷鍵的斷裂相關(guān)聯(lián)。此外，在球磨機(jī)中添加天然粘土高嶺石可使幾丁質(zhì)在中性和酸性條件下的溶解度均增加近1 倍，隨著碾磨時間的延長，幾丁質(zhì)裂解形成GlcNAc 和(GlcNAc)2。

2 殼寡糖和幾丁寡糖在水產(chǎn)飼料添加劑中的功能應(yīng)用

目前COS 和NAc-COS 用作水產(chǎn)飼料添加劑的研究最為廣泛、透徹，已被證明可激發(fā)多種生物學(xué)功能，如免疫調(diào)節(jié)功能、促生長功能、抗氧化功能等。

2.1 免疫調(diào)節(jié)功能

COS 和NAc-COS 在調(diào)節(jié)免疫方面有較好的表現(xiàn)，其免疫活性取決于分子大小或聚合程度。DP ≥6 的COS 具有更大的生物活性，COS5 和COS6 與補(bǔ)體Ⅲ受體（CR3）結(jié)合后，均可激活吞噬細(xì)胞，提高吞噬能力，增強(qiáng)抗體傳遞能力，但COS6 引起的促進(jìn)作用強(qiáng)于COS5。這是由于COS6的分子量高于COS5，COS6 暴露的氨基葡萄糖基團(tuán)的量也相對大于COS5，從而COS6 具有更活躍的結(jié)合位點(diǎn)與巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的CR3 結(jié)合。此外COS6 還可以改變CR3 的配置，對CR3 表現(xiàn)出更高的親和力［6］。迄今為止，已知硬骨魚類體液免疫包括特異性免疫和非特異性免疫，其中特異性免疫相關(guān)的3 種免疫球蛋白為IgM、IgD 和IgT。具有非特異性抵抗作用的分子存在于魚類粘液或血液中，包括抗菌肽、細(xì)胞因子（白介素、干擾素、腫瘤壞死因子TNF-α 和TNF-β、生長因子及趨化因子）、溶菌酶、補(bǔ)體（C1～C9）、凝集素等［31-33］。研究表明，COS 可以提高水生動物的特異性免疫和非特異性免疫機(jī)能。殼聚糖在膜水平上誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞（DC）的活化，但不能誘導(dǎo)細(xì)胞因子的分泌。這導(dǎo)致活化的DC 無法刺激T 細(xì)胞增殖［34］。而COS 可以誘導(dǎo)DC 成熟，分泌TNF-α 并促進(jìn)T 淋巴細(xì)胞（CD4T）增殖［35］。在評價COS、黃芪多糖和益生素3 種免疫增強(qiáng)劑對草魚免疫功能的效果，以堿性磷酸酶為考察指標(biāo)，影響程度為COS＞益生素＞黃芪多糖，因此認(rèn)為COS 比較適合用作草魚的免疫增強(qiáng)劑［36］。COS 觸發(fā)魚類體液免疫的細(xì)胞和分子機(jī)制［37］為：COS 誘導(dǎo)魚類脾臟IgM B 細(xì)胞增殖和分化為IgMlo和IgMhi B 細(xì)胞亞群；IgMlo B 細(xì)胞被進(jìn)一步鑒定為短壽命的漿細(xì)胞，分泌天然IgM，具有與脂多糖（LPS）和肽聚糖（PGN）結(jié)合的能力；天然IgM 能與細(xì)菌結(jié)合，增強(qiáng)血清的殺菌活性，由天然IgM 介導(dǎo)COS 觸發(fā)的體液免疫可以建立對細(xì)菌感染的早期免疫防御機(jī)制。此外，甘露糖受體（MR）和凝集素被鑒定為IgMlo 漿細(xì)胞上COS 的結(jié)合受體。MR 與凝集素協(xié)同作用，觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)漿細(xì)胞生成和擴(kuò)增。

血清溶菌酶活性是魚類機(jī)體非特異性免疫反應(yīng)的重要指標(biāo)，其活性的提高表明巨噬細(xì)胞、多型核白細(xì)胞的活性加強(qiáng)［38］。孫夢潔［39］以COS飼料飼喂鱘魚，發(fā)現(xiàn)鱘魚血清中的溶菌酶（LZM）、酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）的活性和補(bǔ)體C3、免疫球蛋白M 的濃度較對照高，腸道中免疫基因（IL-1、IL-2、IL-10）的相對表達(dá)量高于對照，證明COS 作為免疫增強(qiáng)劑可提高魚類的免疫功能及抗病性能等。袁香麗［40］在凡納濱對蝦飼料中添加COS，300 mg/kg 添加處理顯著提高了凡納濱對蝦血清ACP 活力及肝胰腺AKP活力，300、600 mg/kg 添加處理均可使血清LZM活力明顯提高，900 mg/kg 添加處理凡納濱對蝦感染副溶血弧菌后的死亡率降低，發(fā)揮了COS 免疫增強(qiáng)劑的作用。霍圃宇［41］在飼料中添加COS，明顯增加了大菱鲆幼魚的AKP 和ACP 活力；通過攻毒試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，COS 顯著增加了大菱鲆的疾病抵抗力，因此COS 可作為一種免疫增強(qiáng)劑應(yīng)用到水產(chǎn)動物的基礎(chǔ)飼料中，建議添加量為5 000 mg/kg。蘇鵬等［42］研究發(fā)現(xiàn)，COS 能顯著提高紅鰭東方鲀血清中的AKP、LZM 活力和全血中的血小板數(shù)量，明顯提高紅鰭東方鲀對遲緩愛德華氏菌和哈維弧菌的抵抗力，前述各項(xiàng)指標(biāo)隨COS添加量的增加整體呈升高趨勢，因此飼料中添加2 000 mg/kg COS 能夠提高紅鰭東方鲀的非特異性免疫功能。Liu 等［43］研究發(fā)現(xiàn)，COS 可激活團(tuán)頭魴頭腎巨噬細(xì)胞活性氧-活性氮通路，刺激產(chǎn)生和分泌更多的細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α，吞噬細(xì)菌的能力顯著增強(qiáng)。Qin 等［44］研究認(rèn)為，COS（分子量＜1 500 Da）可顯著降低羅非魚腸道中的炎癥反應(yīng)和應(yīng)激反應(yīng)，TNF-α 和熱休克蛋白70（HSP70）mRNA 表達(dá)水平下降，轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）水平較高，這在抑制炎癥和自身免疫性疾病方面起關(guān)鍵作用，表明該COS 可以有效改善魚類的免疫狀態(tài)以及對致病細(xì)菌或病毒的抵抗力。李明波等［45］研究證明了COS 能顯著促進(jìn)雜交黃顙魚“黃優(yōu)1 號”白細(xì)胞吞噬功能及淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并能提高體液免疫水平，建議有效劑量為80～120 mg/kg。以上研究結(jié)果表明，COS 在一定程度上能提高水產(chǎn)動物的免疫相關(guān)酶活性和其他免疫相關(guān)指標(biāo)，但對不同種屬水產(chǎn)動物的作用效果不同，具體COS 添加量還有待深入研究。

相比COS，NAc-COS 的生物活性及其作用機(jī)理報道較少，目前僅在哺乳動物層面有所研究。已知NAc-COS 對RAW264.7 細(xì)胞的免疫增強(qiáng)作用與COS 相似，所有NAc-COS 均能顯著增加吞噬活性，增強(qiáng)非特異性免疫反應(yīng)；NAc-COS 還可通過真核轉(zhuǎn)錄因子（NF-KB）信號通路促進(jìn)促炎細(xì)胞因子（IL-1β、IL-6 和TNF-a）產(chǎn)生。但與COS 和脂多糖（LPS）不同，NAc-COS1 和NAc-COS6 顯著抑制一氧化氮的產(chǎn)生［46］。

2.2 促生長功能

飼料中添加適量的COS 可促進(jìn)水產(chǎn)動物的生長。陳偉軍等［47］在飼料中添加0.6‰的COS 后，凡納濱對蝦的多個生長指標(biāo)明顯提升，飼料系數(shù)的降低效果尤為突出，腸道絨毛長度增加，上皮細(xì)胞排列更加整齊、緊密。孫飛等［48］在飼料中添加0.02%COS，異育銀鯽的特定生長率（Specific Growth Rate，SGR）升高16.20%，腸皺襞高度增加86.84%，腸壁厚度增加20.45%，腸皺襞寬度減少12.18%。胡曉偉等［49］在花鱸（Lateolabrax japonicus）幼魚飼料中添加0.6%和0.8%COS，其增重率、特定生長率、血清總蛋白和高密度脂蛋白膽固醇含量顯著提高，添加0.6%和1.0%COS可顯著提高胰蛋白酶活性，添加0.4%和0.8%COS可顯著提高脂肪酶活性。黃鑫瑋等［50］研究表明，COS 可促進(jìn)幼建鯉的特定生長率和增重率，腸道皺襞密度、腸壁厚度顯著提高。徐貴珠［51］在飼料中添加COS，中華絨螯蟹的增重率、特定生長率極顯著提高，餌料系數(shù)極顯著降低，肝胰臟重量、腸道重量、腸道蛋白含量顯著升高，由此可見在飼料中添加COS 能提高中華絨螯蟹飼料利用率，促進(jìn)機(jī)體和消化器官的生長發(fā)育。李明波等［45］在飼料中添加COS，證明COS 能顯著提升雜交黃顙魚的生長速度，降低飼料系數(shù)。蘇鵬［52］研究指出，隨著COS 添加量的增加，魚體的增重率、特定生長率、腸指數(shù)逐漸增大，餌料系數(shù)逐漸降低，蛋白酶和脂肪酶活性增加。綜上所述，根據(jù)COS 在體內(nèi)作用靶位的不同，將COS 促進(jìn)水產(chǎn)動物生長的機(jī)理概括如下：（1）COS 誘導(dǎo)腸道消化酶的表達(dá)，包括蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶，從而促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收，加速水生動物生長［53］；（2）COS 可以促進(jìn)消化器官的生長和發(fā)育，如肝胰臟、腸等，從而加快食物分解成結(jié)構(gòu)簡單、可被吸收的小分子物質(zhì)，提高水產(chǎn)動物增重率和生長率；（3）COS 可以改善腸道的組織形態(tài)，從而增加腸道吸收營養(yǎng)物質(zhì)的面積，提高機(jī)體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力，有利于生長［54］。

但也有研究認(rèn)為，COS 對促進(jìn)水產(chǎn)動物生長的影響不顯著。袁香麗［40］研究發(fā)現(xiàn)，低魚粉飼料中不同COS 水平對凡納濱對蝦的生長性能無顯著影響，但能改善腸道和肝胰腺組織形態(tài)，緩解腸道炎癥反應(yīng)，從而提高對蝦的營養(yǎng)物質(zhì)利用能力，促進(jìn)對蝦健康生長，建議飼料中COS 添加量為300～900 mg/kg?；羝杂睿?1］研究認(rèn)為，在基礎(chǔ)飼料中添加COS 對大菱鲆幼魚生長無顯著促進(jìn)作用，其中特定生長率、飼料系數(shù)、增重率、肝體比、臟體比差異均不顯著，但通過降低平均紅細(xì)胞體積、增加平均血紅蛋白濃度可提高血液運(yùn)輸氧氣的能力。Qin 等［44］研究認(rèn)為，任何劑量的COS（分子量＜1 500 Da）對羅非魚的生長性能沒有顯著影響。

COS 的促生長功能取決于劑量、分子量、喂養(yǎng)持續(xù)時間、環(huán)境溫度、給藥途徑和物種。與中等劑量的COS 相比，高水平的COS 可降低水產(chǎn)動物體重、生長速率和飼料轉(zhuǎn)化率，高水平的COS可能主要誘導(dǎo)降血脂活性［53］。同時水產(chǎn)動物生長與免疫作用存在競爭，COS 在發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用時，促生長作用不顯著。因此若要發(fā)揮COS 或NAc-COS 的促生長作用，后續(xù)需進(jìn)一步研究以確定合適劑量。

2.3 抗氧化功能

COS 具有較強(qiáng)的抗氧化活性，這主要與COS分子鏈較短因而暴露出更多的活性氨基和羥基有關(guān)［55］。COS 分子上的活性氨基和羥基能有效消除機(jī)體內(nèi)的自由基，減少生物大分子的自由基損傷。此外，COS 的抗氧化活性也受到去乙?；潭群蚆W 的影響，抗氧化活性隨著MW 的減少而增加［56］。COS 發(fā)揮抗氧化功能、緩解機(jī)體氧化應(yīng)激的可能途徑有兩條：（1）COS 提高過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽還原酶、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和超氧化物歧化酶（SOD）活性，促進(jìn)活性氧（ROS）的中和，驅(qū)動抗氧化功能；（2）COS 通過抑制NF-KB 信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，降低促炎細(xì)胞因子的釋放，進(jìn)而細(xì)胞的氧化損傷得到緩解［57-58］。范超杰等［59］研究表明，飼料中添加COS 可以使黃河鯉魚幼魚的攜氧能力顯著提高、代謝能力增強(qiáng)、健康指數(shù)提升，建議添加的最適濃度為0.6%。陳偉軍等［47］研究指出，飼料中添加COS 能夠提高凡納濱對蝦的總抗氧化能力和SOD 活性，降低肌肉組織中的丙二醛（MDA）含量。胡曉偉等［49］在花鱸幼魚飼料中添加0.6%COS能顯著降低MDA 含量，添加0.2%COS 能增強(qiáng)SOD、AKP 和CAT 活性。蘇鵬［52］在飼料中添加COS 后，紅鰭東方鲀肝組織中的CAT、SOD 活性顯著提高，MDA 含量顯著降低。徐貴珠［51］證明在飼料中添加COS 能提高中華絨螯蟹的各項(xiàng)免疫指標(biāo)，降低MDA 含量，減少自由基對機(jī)體損傷，提高抗應(yīng)激、抗氧化能力。董琦［60］研究發(fā)現(xiàn)，餌料中添加COS 可顯著提高刺參腸道銅鋅SOD、HSP70 和TGF-β 活化激酶的表達(dá)量，顯著提高刺參體腔液的一氧化氮合酶（NOS）、CAT、SOD、LZM、總抗氧化能力（T-AOC）、GSH-Px 的活性，顯著降低MDA 含量，表明餌料中添加COS可以在一定程度上提高刺參的免疫能力和抗氧化能力。綜上所述，COS 在一定程度上可提高水生動物的抗氧化酶活性，增強(qiáng)其抗氧化能力。

2.4 對魚類體成分的影響

一般認(rèn)為采食添加了COS 飼料的水生動物，其體內(nèi)的蛋白質(zhì)和總多不飽和脂肪酸含量比較高，水分和脂質(zhì)以及總飽和脂肪酸含量比較低，這種現(xiàn)象可能與COS 的抗氧化和降血脂活性有關(guān)［53］。研究表明，餌料中添加COS 可提高刺參體壁的硬度、咀嚼性和彈性，降低刺參體壁的粘性，改善刺參口感；可使刺參體壁的粗蛋白含量提高22.02%、灰分含量提高6.67%、粗脂肪含量下降13.43%，F(xiàn)e 含量提高21.35%、K 含量提高17.09%、Zn 含量提高7.34%［60］?；羝杂睿?1］研究表明，隨著COS 添加量的增加，大菱鲆幼魚體內(nèi)的粗蛋白含量明顯提高。

3 殼寡糖和幾丁寡糖在水產(chǎn)疫苗和水產(chǎn)品保鮮上的應(yīng)用

3.1 在動物疫苗佐劑中的應(yīng)用

相關(guān)研究表明，COS 能夠作為免疫佐劑增強(qiáng)亞單位疫苗的免疫能力，顯著誘導(dǎo)動物機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫，而且不會產(chǎn)生毒副作用，其具有緩控、釋控的能力，可以延緩抗原成分在體內(nèi)釋放，有效延長疫苗的免疫效果［61-62］。此外，COS 可與機(jī)體特定受體結(jié)合激活免疫系統(tǒng)，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能。相較于簡單的物理混合，將佐劑和抗原化學(xué)偶聯(lián)成一個整體可更大程度地增強(qiáng)疫苗的免疫原性。在對COS 佐劑潛能分析中，以斑馬魚為實(shí)驗(yàn)動物，滅活鰻弧菌接種1 月后的相對免疫保護(hù)力為50%左右；在加入一定量的COS 后，滅活鰻弧菌的相對免疫保護(hù)力達(dá)85%以上，與獸用油佐劑相當(dāng)。以大菱鲆為實(shí)驗(yàn)動物，分析疫苗接種后3 個月內(nèi)的免疫保護(hù)效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入COS 后疫苗的相對免疫保護(hù)力均超過80%，明顯高于滅活鰻弧菌單獨(dú)接種效果；對免疫魚血清抗體水平分析發(fā)現(xiàn)，COS 能在一定程度上增強(qiáng)滅活鰻弧菌的體液免疫效果，而血清中的抗體也能與溶藻弧菌和哈維氏弧菌進(jìn)行反應(yīng)，故COS 是一種較好的佐劑分子［63］。

3.2 在水產(chǎn)品保鮮中的應(yīng)用

COS 對水產(chǎn)品的保鮮功能源于其抗菌能力。研究表明，幾丁質(zhì)和殼聚糖具有抑菌作用而非殺菌作用，與幾丁質(zhì)和殼聚糖不同的是，COS 和NAc-COS 具有殺菌作用。目前對COS 的抑菌機(jī)理有以下5 種解釋：（1）COS 和NAc-COS 帶正電的氨基與細(xì)胞表面帶陰離子的物質(zhì)或者細(xì)胞壁肽聚糖中N-乙酰-胞壁酸等相互結(jié)合，從而在細(xì)胞周圍形成致密層，細(xì)胞膜的通透性改變，進(jìn)而影響了細(xì)菌與外界的營養(yǎng)物質(zhì)交換過程，細(xì)菌的代謝活性受到抑制；（2）COS 和NAc-COS 與某些金屬離子、微量元素或必需營養(yǎng)素螯合，導(dǎo)致細(xì)菌因長期缺乏某種必需離子元素而代謝紊亂，最終死亡［64］；（3）COS 和NAc-COS 分子量較低，其聚合物鏈具有更大的靈活性，可結(jié)合多個細(xì)菌，聚合物鏈迅速黏附細(xì)菌，進(jìn)入細(xì)胞可以結(jié)合到細(xì)菌DNA 分子上，通過阻止細(xì)菌DNA分子的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄起到抑菌作用；（4）N-乙酰氨基葡萄糖是COS 結(jié)構(gòu)的基本成分，也是腸道粘蛋白的成分，當(dāng)細(xì)菌與宿主腸道結(jié)合時，其充當(dāng)受體，有效減少細(xì)菌的粘附作用；（5）COS 和NAc-COS 可以作為有益腸道細(xì)菌的可發(fā)酵底物，誘導(dǎo)有機(jī)酸產(chǎn)生，從而降低腸道pH 值，使腸道病原體的患病率降低［44,65］。劉敏等［55］采用2% COS 溶液涂膜處理的鯽魚在冷藏保鮮過程中的pH值、脂肪氧化腐敗程度（TBA）值及揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）值均明顯低于對照，可見COS 涂膜處理能有效減緩鯽魚中蛋白腐敗和脂肪氧化速率，減少細(xì)菌繁殖，從而延長鯽魚的貨架期。

4 展望

COS 和NAc-COS 無毒副作用，原料來源廣泛豐富，且與幾丁質(zhì)、殼聚糖等相比，具有十分突出的優(yōu)點(diǎn)［66］：易溶于水，無毒性，在宿主體內(nèi)較弱的累積效應(yīng)。目前，COS 和NAc-COS 的適宜添加量依不同物種、不同年齡段和不同目標(biāo)效果而異，添加80～5 000 mg/kg 不等，行業(yè)尚未建立統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，很大程度上限制了COS 和NAc-COS 在水產(chǎn)上的大規(guī)模應(yīng)用。同時，在COS 和NAc-COS 的實(shí)際生產(chǎn)過程中，不同廠家制備工藝千差萬別，導(dǎo)致實(shí)際合成產(chǎn)物中寡糖的比例與設(shè)計(jì)中的目標(biāo)比例存在一定差異，質(zhì)量參差不齊。COS 和NAc-COS 分子大小或聚合程度存在差異，這將產(chǎn)生不同的生理活性，因此若能夠大量獲得合適分子大小和聚合程度的COS 和NAc-COS，將有助于全面深入解析其在各種生物活性中的內(nèi)在相關(guān)機(jī)制。此外，COS 和NAc-COS 具有調(diào)節(jié)水生動物免疫、促進(jìn)生長、抗氧化、改善魚類體成分等活性，對于病原體微生物有很強(qiáng)的抑制效果，例如副溶血弧菌、遲緩愛德華氏菌、哈維弧菌、親水性氣單胞菌和白斑綜合征病毒等，但由于在構(gòu)效關(guān)系方面的研究匱乏，導(dǎo)致對其主要作用靶標(biāo)和作用機(jī)制尚不明確，限制了基于靶標(biāo)相互作用的結(jié)構(gòu)優(yōu)化和進(jìn)一步研發(fā)。目前國內(nèi)外對COS和NAc-COS 的大量研究都暗示其可以作為水生動物的免疫增強(qiáng)劑，可嘗試聯(lián)合其他免疫增強(qiáng)劑，最大限度地發(fā)揮其在水生動物體內(nèi)的協(xié)同效應(yīng)。COS 和NAc-COS 在水生動物疾病防控與治療方面開發(fā)前景十分廣闊。