連 聰,溫肖會,呂殿紅,高小鵬,賈春玲,周秀蓉,常 琦,羅勝軍
(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所/廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測實驗站/嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實驗室肇慶分中心,廣東 廣州 510640)
新城疫(Newcastle Disease,ND)是一種由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)引起的禽類急性、接觸性傳染?。?],是嚴重損害養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的疾病之一,世界動物衛(wèi)生組織將其劃為A 類傳染病,我國將其列為一類傳染病。自然條件下,NDV 經(jīng)受傷皮膚、消化道、呼吸道黏膜等部位侵入機體,也可通過垂直傳播導(dǎo)致幼禽感染。新城疫可引起雞、鴨、鵝、鴿子、鵪鶉等禽類感染,尤其雞受感染后通常會導(dǎo)致死亡,其他動物的癥狀一般比雞輕[2]。ND一年四季均可發(fā)生,春秋季多發(fā),臨床上可根據(jù)發(fā)病速度、癥狀及死亡率將其分為最急性、急性、慢性3 種類型,其中急性ND 普遍流行,死亡率高(可達90%以上)。NDV 存在于病禽的所有組織器官、體液及分泌物中,腦、脾、肺含毒量最高,故病禽會出現(xiàn)轉(zhuǎn)脖、站立不穩(wěn)等神經(jīng)癥狀,脾臟充血、出血,亦可見明顯的呼吸困難、咳嗽和氣喘等呼吸道癥狀[3]。
ND 自1926 年在印度尼西亞被首次發(fā)現(xiàn),至今已引發(fā)4 次全球性大規(guī)模流行[4],從病毒流行史上看,ND 一直是家禽的毀滅性疾病,目前該疾病在許多國家仍然是影響家禽養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要問題之一。即使在ND 已經(jīng)得到控制的國家,依然有較重的經(jīng)濟負擔(dān),主要用于疫苗接種和維持嚴格的生物安全措施[5]。目前市場上存在多種活疫苗和滅活疫苗,包括易于保存、運輸?shù)哪蜔酦DV 疫苗[6],國內(nèi)普遍使用滅活疫苗防控ND。ND 經(jīng)常被誤診為沙門氏菌病、螺旋體病、喉氣管炎和某些出血性疾病,故對其診斷需要密切的監(jiān)測,以迅速、特異性地識別病原。血清學(xué)檢測和分子生物學(xué)檢測是NDV 檢測的標準方法,血清學(xué)檢測可短時間內(nèi)檢測到NDV 的存在,從而可迅速采取行動控制疫情傳播;分子生物學(xué)檢測則確定其基因分型,為后續(xù)疫苗研發(fā)提供方向。血清學(xué)檢測主要采用血凝抑制試驗與ELISA 檢測。血凝抑制試驗主要測量NDV 特異性抗體抑制NDV顆粒對紅細胞凝集的能力,因其成本較低及操作簡便而成為目前主要的檢測方法。ELISA 檢測高度敏感,產(chǎn)生的結(jié)果與血凝抑制試驗結(jié)果基本一致,也是常用的檢測方法。近年來,分子生物學(xué)檢測方法迅速發(fā)展,各新型技術(shù)的研發(fā)取得了重大成果,其中微陣列雜交技術(shù)、生物傳感器和下一代測序最受關(guān)注,但因成本高、技術(shù)復(fù)雜等原因尚未被廣泛使用,而普遍使用的技術(shù)是逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)和熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(qPCR)。qPCR 技術(shù)使用最廣,相較于傳統(tǒng)檢測技術(shù),該技術(shù)更便捷且具有更高的病毒檢測靈敏度。分子生物學(xué)技術(shù)的進步對分子流行病學(xué)的研究提供了有利條件,本文就NDV 流行病學(xué)及其基因型的遺傳進化等方面研究進展進行綜述,以期為NDV 的防控和疫苗研發(fā)提供參考。
NDV 對外界抵抗力較強,在自然環(huán)境中可生存較長時間;對低溫抵抗力強,低溫下可存活數(shù)月;60 ℃環(huán)境下經(jīng)45 min 可滅活,紫外線照射30 min 被滅活[7];對乙醚等有機溶劑敏感。
NDV 是單股負鏈RNA 病毒,為副黏病毒科新城疫樣病毒屬的禽副黏病毒Ⅰ型[8]。NDV 多為圓形,直徑100~250 nm,有囊膜,單鏈不分節(jié)。NDV 基因組有3 種長度,分別為15 186、15 192、15 198 nt[9],結(jié)構(gòu)為3'-NP-P-M-F-HN-L-5'(圖1),編碼6 種特異性結(jié)構(gòu)蛋白[10],分別為核衣殼蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白(HN)和大蛋白(L)。每個特異性結(jié)構(gòu)蛋白的基因都存在起始因子和終止因子序列,各蛋白基因之間通過基因間序列將彼此分隔開,保證其表達的準確性。
圖1 新城疫病毒結(jié)構(gòu)示意圖[3]Fig.1 Schematic diagram of the structure of Newcastle disease[3]
HN 蛋白和F 蛋白為刺突糖蛋白,刺突長度約為8 nm,分別以三聚體和四聚體的形式存在,位于囊膜表面,在病毒感染過程中參與病毒的入侵,可誘導(dǎo)保護性免疫[11],它們均為病毒熱穩(wěn)定性的決定因素[12]。HN 是一種Ⅱ型整合膜蛋白,蛋白分子量為74 kD,可使病毒吸附在細胞表面的唾液酸受體,并通過血凝素、神經(jīng)氨酸酶的生物學(xué)活性破壞受體功能,參與病毒入侵。HN的受體識別位點和神經(jīng)氨酸酶活性位點均位于球狀頭部,并且高度保守,球狀頭部區(qū)域也被認為是抗體結(jié)合位點[13]。由于終止密碼子位置不同,自然界中存在不同長度的HN 蛋白,最短的HN蛋白含571 個氨基酸,存在于速發(fā)菌株中;最長的HN 蛋白含616 個氨基酸,存在于緩發(fā)菌株中。HN 蛋白中擴展羧基末端的長度和序列可影響蛋白功能,但尚未明確其對NDV 毒力的作用[5]。
F 蛋白是存在于NDV 包膜上的表面糖蛋白,參與病毒穿入、細胞融合等過程。其基因組序列用于對NDV 毒株基因型進行分類,切割位點處序列是世界動物衛(wèi)生組織(OIE)公認的毒力指標。NDV 系統(tǒng)性傳播及其毒力大小取決于F 蛋白在組織中的裂解。根據(jù)OIE 相關(guān)標準,位于112~116位氨基酸之間的F 蛋白切割位點具有多個堿性氨基酸殘基,并在117 位具有苯丙氨酸殘基的毒株被認為是強毒株;在117 位具有一元F 切割位點和亮氨酸殘基的毒株被認為是弱毒株[2]。
M 蛋白本質(zhì)為疏水蛋白,位于核衣殼和脂質(zhì)膜之間,分子量約為40 kD,由364 個氨基酸組成。M 蛋白是一種堿性蛋白質(zhì),具有與病毒核酸相互作用的區(qū)域(17 bp),包括9 個堿性氨基酸[14],其在RNA 合成及病毒自身裝配中起關(guān)鍵作用[15]。M 蛋白在副粘病毒中高度保守,群體發(fā)生突變后其存在極少的非同義堿基替代,這可作為對不同地域NDV 分離株進行分類的依據(jù)[16]。
L 蛋白是NDV 基因組中最大的蛋白質(zhì),由2 204 個氨基酸組成,分子量為250 kD[9]。L 蛋白屬于RNA 依賴性RNA 聚合酶,與病毒組裝、合成相關(guān),在病毒感染過程中充當病毒復(fù)制酶和轉(zhuǎn)錄酶,其合成病毒mRNA 并協(xié)助基因組RNA復(fù)制,還對新形成的mRNA 進行5'端加帽、甲基化及激活多聚A 聚合酶活性[17]。L 蛋白可調(diào)節(jié)NDV 的毒力,可能通過增加復(fù)制期間病毒RNA的合成速率而發(fā)揮有效作用[18]。
P 蛋白連接L 蛋白與NP 蛋白,是聚合酶的輔助因子。P 蛋白由395 個氨基酸組成,在特定的絲氨酸和蘇氨酸殘基處被磷酸化,并作為同源寡聚體發(fā)揮作用,其在病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄中也具有至關(guān)重要的作用[5]。P 蛋白的四聚體介導(dǎo)L 蛋白和N-RNA 模板之間的相互作用,以防止NP 蛋白隨機包裹非病毒 RNA。此外,P 蛋白與未組裝的NP 蛋白形成復(fù)合物,調(diào)節(jié)逆轉(zhuǎn)錄過程。在病毒復(fù)制過程中,P 蛋白的不同結(jié)構(gòu)域與NP 蛋白相互作用時發(fā)揮不同功能。NDV 的6 個結(jié)構(gòu)蛋白基因中有5 個蛋白基因編碼單一的蛋白質(zhì),只有P 蛋白基因通過RNA 編輯編碼3 個蛋白質(zhì),即P 蛋白、V 蛋白和W 蛋白[9]。V 蛋白和W 蛋白是輔助蛋白,僅存在于病毒感染的細胞中,其中V 蛋白屬于干擾素(IFN)拮抗劑,對NDV 毒力大小起重要作用[19]。
NP 蛋白含489 個氨基酸,分子量為55 kD,覆蓋整個病毒核酸形成核糖核蛋白(RNP),以保護RNA 免受核酸酶的侵害[16]。NP 蛋白是病毒顆粒中最豐富的蛋白質(zhì),電子顯微鏡下可見“人”字形結(jié)構(gòu),是病毒復(fù)制和mRNA 生物合成所需的最小模板,與N 蛋白、P 蛋白、L 蛋白及基因組RNA 結(jié)合形成RNP。
F 蛋白是主要的特異性結(jié)構(gòu)蛋白,根據(jù)其核苷酸序列劃分NDV 的基因型,其基因全長1 792 nt,ORF 長1 662 nt,編碼553 個氨基酸,分子量約55 kD[20-21]。根據(jù)其基因編碼可將NDV 分為I 和Ⅱ兩類。若F 蛋白裂解位點的氨基酸組成為112R/K-R-Q-K/R-R-F117,則其為I 類毒株;若裂解位點的氨基酸組成為112G/EK/R-Q-G/E-R-L117,則其為Ⅱ類毒株[22]。I 類毒株主要來源于野生鳥類,大多毒株為低毒力[23],家禽中主要感染鴨、鵝等水禽,雞群中偶爾出現(xiàn),但概率較小。Ⅱ類毒株是可引起禽類明顯癥狀的強毒株,具有多種基因型,分為I 型、Ⅱ型、Ⅲ型等,遺傳進化距離大于0.1 就被判定為不同基因型[3]。巴基斯坦和孟加拉國曾從鴿子中分離出基因型XXI.1.2 毒株[24-25]。因此,Ⅱ類毒株至少分為Ⅰ~XXI 達20 多種。Ⅱ類毒株在野生鳥類中具有某些特定的基因型,例如基因型Ⅵ型毒株為鴿子、鸕鶿等野生鳥類的特有毒株[26],而至今并無證據(jù)表明該型毒株無感染家禽的風(fēng)險。
我國曾分離出多種基因型NDV毒株。1946年,我國分離到特有的Ⅱ類Ⅸ基因型F48E9 毒株[27],為嗜神經(jīng)型強毒株,家禽表現(xiàn)出以神經(jīng)癥狀為主導(dǎo)的臨床特征[28],即出現(xiàn)翅麻痹、跛行、站立不穩(wěn)、頭頸向后側(cè)扭轉(zhuǎn)、伏地旋轉(zhuǎn)等癥狀;在新城疫第3 次大流行時,主要流行株為Ⅱ類Ⅵ型毒株;20世紀90 年代NDV 的Ⅱ類Ⅶd 型成為我國主要優(yōu)勢基因型[29];2010 年,廣東首次監(jiān)測到Ⅱ類XII型,并證實為強毒株[30]。這些毒株的成功分離為新城疫的診斷與防控提供了巨大幫助。進入21世紀以來,NDV Ⅰ類毒株的致病性有增強趨勢,從而引起人們的關(guān)注,2008 年首次分離出Ⅰ類病毒Duck China/08-004/2008[31],自此逐漸加強對NDV Ⅰ類病毒的研究,而高致病性的Ⅱ類毒株始終是人們研究新城疫疾病的重點。到目前為止,NDV 的基因型仍在不斷改變,掌握其所有基因型并研究有針對性的防治方法才有可能凈化NDV。
2.2.1 我國NDV 不同基因型流行情況 為了解我國部分地區(qū)NDV 流行毒株的基因型情況,本文統(tǒng)計整理了中國知網(wǎng)和PubMed 報道的NDV分子流行病學(xué)數(shù)據(jù),結(jié)果(表1)發(fā)現(xiàn),2008—2020 年間在各地區(qū)收集的14 062 份樣本中共分離到234 株毒株,其中166 株鑒定出具體基因型,涉及基因 型Ⅰ類1 型(4/166,2.41%)、2 型(3/166,1.81%)、3 型(60/166,36.14%),基因型Ⅱ類Ⅰ型(26/166,15.66%)、Ⅱ型(23/166,13.86%)、Ⅵ型(2/166,1.2%)、Ⅶ型(37/166,22.29%)、Ⅷ型(3/166,1.81%)、Ⅸ(7/166,4.22%)、Ⅻ(1/166,0.6%)。
表1 我國各地區(qū)NDV 毒株的基因型統(tǒng)計Table 1 Genotype statistics of NDV strains in various regions of China
由圖2 可知,NDV 在雞流行毒株中,Ⅰ類3 型(37/93,39.78%)占比最高,其次為Ⅱ類Ⅶ型(27/93,29.03%),Ⅱ類Ⅱ型(21/93,22.58%)則占比較少;在鴨流行毒株中,Ⅰ類3型(18/43,41.86%)占比最高,其次為Ⅱ類Ⅰ型(15/43,34.88%),Ⅱ類Ⅶ(7/43,16.28%)占比較低;在鵝流行毒株中,Ⅱ類Ⅰ型(7/16,43.75%)占比最高,其次為Ⅰ類3 型(5/16,31.25%)、Ⅰ類1 型(1/16,6.25%),此外還發(fā)現(xiàn)了1 株Ⅱ類Ⅻ型毒株,未發(fā)現(xiàn)Ⅱ類Ⅶ型病毒,推測其可能在鵝中感染率不高。Ⅰ類3 型毒株在雞、鴨、鵝中均有較強感染力,為保證家禽健康,加強對該型毒株研究具有重大意義。
圖2 不同家禽的NDV 毒株基因型統(tǒng)計Fig.2 Genotype statistics of NDV strains in different poultry species
2.2.2 遺傳進化分析 在我國分離出的NDV 多種基因型毒株中,Ⅱ類Ⅸ型是我國特有的毒株,而Ⅱ類Ⅶ型病毒現(xiàn)已成為我國NDV 流行的主要優(yōu)勢基因型[24]。我國西藏、廣西、河北、寧夏及山東、江蘇等華東地區(qū)都曾分離出Ⅱ類Ⅶ型毒株,其中山東、江蘇、河北分離到Ⅶd 亞型。由此表明,在基因Ⅶ型毒株中,Ⅶd 亞型更為流行。
ND 感染病例中,雞感染最多,以雛雞尤甚。其影響雞的消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng),有時亦影響生殖系統(tǒng)。疾病表現(xiàn)受個體的易感性、病毒依賴性及其他壓力因素的影響。感染后所呈現(xiàn)的癥狀因基因型不同而異。感染Ⅰ類中的弱毒株,多表現(xiàn)為輕型癥狀,甚至不引起任何臨床癥狀。若感染Ⅱ類中的強毒株,則會引起機體明顯的臨床癥狀,甚至導(dǎo)致大批量死亡,故Ⅱ類毒株是研究和預(yù)防的主要方向。F 蛋白切割位點是病毒毒力的決定因素。本文選取了NCBI 中15 株不同基因型NDV 的F基因序列,用MEGAX 軟件的最大似然法對這些毒株的F基因序列進行分析,構(gòu)建了基于F基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。當前,基因Ⅱ型與基因Ⅶ型NDV 在雞群中較為流行,根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹可知,基因Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅸ型與基因Ⅶ型、Ⅷ型相距甚遠,針對基因Ⅱ型毒株的疫苗對基因Ⅶ型毒株的預(yù)防效果不佳,因此,在疫苗接種時,結(jié)合當?shù)丶梆B(yǎng)殖場內(nèi)實際情況,應(yīng)選擇最完善的接種方案。
圖3 NDV 基于F 基因的系統(tǒng)遺傳進化樹Fig.3 Phylogenetic evolutionary tree of NDV based on F gene
將Ⅱ類Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅶ型、Ⅷ型和Ⅸ型毒株的核苷酸序列進行比對(圖4),Ⅰ型病毒之間同源性為90.7%~93.8%,與其他基因型病毒的同源性為 85.6%~99.8%;Ⅱ型病毒之間同源性為89.5%~99.6%,與其他基因型病毒的同源性為85.1%~99.8%;Ⅶ型病毒之間同源性為85.2%~99.1%,與其他病毒的同源性為84.5%~95.6%;Ⅷ型病毒之間同源性為95.3%,與其他病毒的同源性為84.0%~94.4%;Ⅸ型病毒之間同源性為84.8%~95.6%,與其他病毒之間的同源性為84.0%~91.3%。各基因型病毒之間同源性相差不大,相比之下,Ⅶ型與Ⅷ型病毒與其他病毒之間同源性較小,Ⅸ型病毒與其他毒株同源性更小。
圖4 NDV 中F 基因核苷酸序列同源性分析結(jié)果Fig.4 Results of nucleotide sequence homology analysis of F gene in NDV
為了解我國部分地區(qū)新城疫流行情況,本文整理2010—2020 年間的相關(guān)文獻,得到不同省區(qū)的NDV 陽性情況。由表2 可知,抗體檢測共45 534 份,陽性樣本41 698 份,陽性率為91.58%;抗原檢測共37 568 份,陽性樣本789 份,陽性率為2.10%??贵w檢測顯示疫苗接種率良好,各地區(qū)間抗原陽性率在11.00%以下,具有較大差異,在具有NDV 疫情的地區(qū)需結(jié)合該地區(qū)的流行毒株來篩選疫苗,從而更科學(xué)、精準地防控NDV。
表2 NDV 抗原抗體檢測結(jié)果Table 2 Detection results of antibodies to NDV antigens
我國新城疫目前多為地方性散發(fā)流行,NDV中的外源基因具有穩(wěn)定性[51],故疫苗的廣泛使用可有效減少NDV 的傳播,使疾病發(fā)生率顯著下降。目前,常見新城疫疫苗主要為B1、LaSota 和V4 等毒株的減毒活疫苗[52],以及LaSota 和VH等毒株的滅活疫苗[53]。疫苗是預(yù)防NDV 發(fā)生、傳播的有效手段,但由于NDV 的F 基因具有較高變異率,基因型種類也不斷增多,疫苗免疫后并不能完全阻止流行毒株的侵襲[54]。因此,臨床上NDV 防控中疫苗(種類和基因型)的選擇至關(guān)重要,免疫方案的制定需要結(jié)合本地NDV 的實際流行情況,滅活疫苗和減毒活疫苗聯(lián)合使用有助于NDV 陽性場的控制,而選擇與NDV 流行毒株同源性較高的疫苗株進行免疫,對本場NDV 的凈化具有重要意義。此外,我們依然要做好傳染源的防控,定期對場內(nèi)環(huán)境進行檢疫,提高人員防疫意識,從根源上預(yù)防疾病暴發(fā)與傳播[55]。
Ⅰ類NDV 主要分離自野生鳥類,且大部分是低毒力甚至無毒力的毒株[56],因此,我國NDV的防控措施主要針對Ⅱ類毒株。若能加強對Ⅱ類Ⅱ型和Ⅶ型這兩種主要流行毒株的研究,則能使防控工作取得更好成效。掌握主要感染的NDV 基因型有助于了解疾病的流行特征,這為我國NDV防控和新型疫苗研發(fā)提供依據(jù)。
本文通過文獻對我國不同地區(qū)NDV 流行情況進行統(tǒng)計,發(fā)現(xiàn)NDV 主要分布于華南地區(qū)、華東地區(qū)及部分西北地區(qū),各地區(qū)暴發(fā)程度具有較大差異,候鳥遷徙區(qū)域感染更為明顯。2010—2020年間,感染較嚴重地區(qū)的陽性率在11.0%左右,有些地區(qū)無陽性記錄,針對NDV 防控需結(jié)合當?shù)貙嶋H情況制定策略。對流行地區(qū)的NDV 基因型進行整理,發(fā)現(xiàn)Ⅰ類3 型、Ⅱ類Ⅱ型和Ⅱ類Ⅶ型是我國雞群中NDV 的主要流行基因型,Ⅰ類3 型和Ⅱ類Ⅰ型基因型是水禽(如鴨、鵝)的主要流行株。Ⅰ類毒株為弱毒株,臨床表現(xiàn)癥狀較輕,近年來其癥狀有加重趨勢,而目前對NDV 的研究依然以Ⅱ類毒株為主。Ⅰ類3 型毒株對雞、鴨、鵝均有較強感染性,且其更易通過野生鳥類進行傳播,故加強對Ⅰ類毒株的研究很有必要。通過對不同Ⅱ類毒株的F 基因序列進行比對,發(fā)現(xiàn)Ⅱ類Ⅰ型毒株與Ⅱ型毒株間同源性為89.7%~99.8%,Ⅰ型毒株與Ⅶ型毒株間同源性為86.6%~90.9%,Ⅱ型毒株與Ⅶ型毒株間同源性為85.4%~95.6%。
ND 是全球家禽業(yè)的主要威脅因素,不同程度毒力的NDV 毒株在禽類中廣泛傳播。ND 與其他疾病相比傳播率更高,傳播范圍更廣。衛(wèi)生條件差、營養(yǎng)缺乏、疫苗接種不完善、與其他禽類接觸等均能促進ND 的傳播。在疾病暴發(fā)前切斷可能感染的途徑,進行免疫保護是預(yù)防ND 的有效措施[57]。加強對病毒的監(jiān)測,即使對Ⅰ類中的弱毒株也不能掉以輕心,病毒入侵可使機體防御力顯著降低,極可能發(fā)生繼發(fā)性感染。繼發(fā)性細菌感染是病毒感染的常見后遺癥,相比輕型NDV 更具有破壞性。不斷完善防御策略是控制NDV 傳播的必要手段,由于NDV 傳播途徑多樣,野生鳥類、商業(yè)鳥類、寵物鳥類均有病毒傳播風(fēng)險,人們以往對其并無過多關(guān)注,這是ND 預(yù)防策略中較為薄弱的點,加強對這些鳥類的控制,嚴格依照生物安全標準進行飼養(yǎng)、檢疫,加固對NDV 的防御墻。一種優(yōu)秀的NDV 疫苗可以有效預(yù)防臨床疾病,目前可用的滅活和減毒活疫苗只能預(yù)防相應(yīng)的病毒感染,不能避免異源病毒入侵。研制新型疫苗及優(yōu)化防治策略的工作仍須繼續(xù),以期在不久的將來找到有針對性、更簡捷精確控制NDV 的方法。