鈣對鋁脅迫下油茶生長及生理特性的影響

黃麗媛，劉 珍，賈勝波，鄧思穎，盛玉香，王 瓊

（湖南工業(yè)大學城市與環(huán)境學院/城鎮(zhèn)水安全排放及資源化湖南省重點實驗室，湖南 株洲 412007）

【研究意義】鋁是地殼中含量最多的金屬元素，當其以鋁硅酸鹽和鋁氧化物等形式存在時，對植物和土壤無毒害［1］。隨著全球范圍內(nèi)酸雨危害的加重，大量可溶性鋁積累增多，并轉(zhuǎn)變?yōu)閷χ参镉卸镜腁l3+形態(tài)。鋁毒害最先作用于植物根系，抑制其生長，引起根系損傷，從而影響植物對水分和營養(yǎng)的吸收［2］。隨著鋁脅迫時間的延長，植物的光合作用也會受到影響，葉綠體被膜遭到破壞，碳水化合物合成受到抑制［3］，能夠有效清除自由基的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）和抗壞血酸過氧化物酶（APX）等抗氧化酶活性降低，導致大量積累活性氧，引發(fā)膜脂過氧化，降低H+泵活性和Ca2+-ATP 的活性等，最終導致植物細胞死亡［4］，因此，鋁毒也被認為是酸性紅壤地區(qū)限制植物生長和發(fā)育的主要因素之一。研究表明，鋁毒害機制可能與破壞植物根部細胞膜的結(jié)構(gòu)與功能有關(guān)［5］，而植物體內(nèi)的Ca2+可以穩(wěn)定細胞膜，調(diào)控細胞內(nèi)生化過程，起到與Al3+相反的作用［6-8］。因此，施鈣被眾多學者認為是緩解鋁毒的一個重要途徑［9-10］。同時，Ca2+作為細胞內(nèi)的第二信使，參與多種生理生化過程及酶活性的調(diào)節(jié)［11-12］，這對植物在逆境中的應答反應有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】伍志權(quán)等［13］研究表明，外源鈣可以顯著提高鋁脅迫下水稻根系的抗氧化酶活性，減少丙二醛（MDA）的積累，降低鋁對水稻根伸長的抑制；李清華等［14］對甘薯的研究表明，施鈣可以顯著促進甘薯根系的生長發(fā)育，提高葉片葉綠素含量，有效緩解鋁脅迫；段小華等［15］對茶樹的研究也表明，鈣添加可以有效降低茶樹對鋁的吸收和積累，促進鈣、鉀、鎂、鐵和鋅等營養(yǎng)元素的積累?！颈狙芯壳腥朦c】油茶（Camellia oleiferaL.）是我國重要的木本油料樹種，廣泛分布在長江以南的酸性紅壤區(qū)，該區(qū)域是典型的富鋁化環(huán)境。雖然油茶是鋁富集植物，但是前期研究表明，高濃度鋁也會顯著限制油茶的正常生長發(fā)育［16］。土壤酸化導致土壤中Al3+濃度升高，嚴重影響油茶的產(chǎn)量和品質(zhì)。由前人研究可知，鈣在緩解植物鋁脅迫方面具有重要作用，但鈣能否緩解油茶鋁脅迫還未見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本試驗通過研究外源鈣對鋁脅迫處理下油茶幼苗生長、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和抗氧化酶活性等的影響，以期為揭示鈣緩解油茶鋁脅迫的生理機制提供理論依據(jù)，同時也為生產(chǎn)中鈣的施用量提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設(shè)計

試驗于2021 年5—10 月在湖南工業(yè)大學校園內(nèi)的油茶試驗大棚開展（113°11' E、27°82' N），該區(qū)域?qū)儆趤啛釒Ъ撅L性濕潤氣候，年平均降雨量1 471 mm，年平均氣溫16～18 ℃。供試材料是普通油茶品種湘林 XCL 15（Camellia oleifera‘XCL 15’）的扦插苗。扦插枝條選自5～10 年生、長勢良好、無病蟲害的優(yōu)良母樹，選取當年生、半木質(zhì)化的春梢，將其修剪為約10 cm 長的插穗，扦插于河沙苗床上，進行常規(guī)管理。90 d 后，挑選長勢基本一致、根系良好的扦插苗（地徑3.0±0.5 mm、苗高16.0±1.0 cm），將根系用清水沖洗干凈，移植到15 cm × 22 cm 塑料盆中，每盆裝細沙3 kg，移植后置于大棚中，保持通風狀態(tài)，白天氣溫高時進行適當遮蔭處理。在試驗開始前進行14 d 預培養(yǎng)，每隔3 d 澆1 次營養(yǎng)液，每盆400 mL，營養(yǎng)液采用 Hoagland 配方（pH 4.2）［17］。待油茶幼苗適應14 d 后，在Hoagland 營養(yǎng)液基礎(chǔ)上加入AlCl3作為鋁源，加入CaO 作為鈣源，進行鈣、鋁組合處理。根據(jù)前期試驗結(jié)果，油茶幼苗在4 mmol/L 的鋁處理下受到鋁毒害，因此本試驗鋁濃度設(shè)置為4 mmol/L，同時添加4 個不同濃度鈣進行處理，組合成為6 個處理（表1）。每個處理20 盆，每盆2 株。鈣、鋁處理60 d 后，開始測定油茶植株各項生長和生理指標。

表1 試驗處理Table 1 Experimental treatments

1.2 測定指標及方法

生長指標：用游標卡尺和卷尺分別測定油茶幼苗的地徑、株高，同時記錄葉片數(shù)。幼苗收獲后，每個處理隨機選擇5 株油茶幼苗，用純水沖洗干凈，置于烘箱內(nèi)105 ℃殺青30 min，然后置于烘箱中60℃烘至恒重，記錄植株干質(zhì)量［18］。

光合參數(shù)：每個處理選擇 5 盆油茶苗，隨機挑選其中5 株，每株選擇3 片成熟葉，于上午9：00—11：00 采用Li-6400XT 光合儀測定凈光合速率（Pn）、氣孔導度（Gs）、蒸騰速率（Tr）和胞間CO2濃度（Ci）。

生理指標：每個處理隨機選取15～20 株，將根系和葉片用蒸餾水洗凈并用濾紙擦干水分，測定生理指標。根系活力采用TTC 法［19］測定；葉綠素a、葉綠素 b 和類胡蘿卜素含量采用丙酮浸提法［20］測定；可溶性糖含量采用蒽酮比色法［21］測定；可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍法［22］測定；游離氨基酸和游離脯氨酸含量分別采用蒸餾水和3%磺基水楊酸提取，均用茚三酮顯色法［23］測定；MDA 含量采用硫代巴比妥酸法［24］測定；質(zhì)膜透性采用電導率法［25］測定，以相對電導率（前后兩次電導的比值）表示；SOD 活性采用氯化硝基氮藍四唑法［26］測定；POD 活性采用愈創(chuàng)木酚法［27］測定；CAT 活性采用紫外分光光度法［28］測定；APX 活性以抗壞血酸為底物，采用分光光度計測定［17］。

采用Excel 2013 整理數(shù)據(jù)和制圖，SPSS 22.0軟件進行均值、標準差計算及方差分析，其中方差分析采用Duncan 法。

2 結(jié)果與分析

2.1 鈣對鋁脅迫下油茶幼苗生長狀況的影響

不同濃度鈣對鋁脅迫下油茶幼苗生長的影響如表2 所示。鋁脅迫（CK+Al）處理下，油茶幼苗的地徑、株高、植株干質(zhì)量、葉片數(shù)及根系活力均顯著下降，分別比對照（CK）下降21.81%、32.32%、34.15%、50.77%和40.92%。添加不同濃度鈣處理后，油茶幼苗各項生長指標均呈先上升后下降的變化，在Al+Ca 3.0 處理下緩解鋁脅迫的效果最好，地徑、株高、植株干質(zhì)量、葉片數(shù)及根系活力分別比鋁脅迫（CK+Al）處理提高21.43%、40.69%、40.58%、68.75% 和54.17%，除葉片數(shù)外，其余各指標與對照（CK）無顯著差異。而在高濃度鈣處理（Al+Ca 5.0）下，各生長指標與鋁脅迫處理相比無顯著差異；低濃度鈣處理（Al+Ca 0.5）除植株干質(zhì)量外，其他生長指標均與鋁脅迫處理（CK+Al）無顯著差異。

表2 鈣對鋁脅迫下油茶幼苗生長狀況的影響Table 2 Effect of Ca on growth condition of Camellia oleifera seedlings under aluminum stress

2.2 鈣對鋁脅迫下油茶葉片光合色素含量的影響

由表3 可知，與對照（CK）相比，鋁脅迫（CK+Al）處理下油茶葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素和總?cè)~綠素含量分別下降55.49%、58.82%、65.85%和55.74%，下降幅度最大的是類胡蘿卜素含量，由此可見鋁脅迫對油茶葉片光合色素含量有明顯的抑制作用。隨著外源鈣的施入，油茶葉片光合色素含量均有不同程度的提高，尤其是當鈣濃度達到1.5～3 mmol/L 時，葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素和總?cè)~綠素含量均顯著高于鋁脅迫（CK+Al）處理。當鈣濃度達到5 mmol/L時，油茶葉片光合色素含量與Al+Ca 3.0 處理相比明顯下降，表明該濃度鈣處理對油茶光合作用產(chǎn)生一定的抑制作用。

表3 鈣對鋁脅迫下油茶葉片光合色素含量的影響Table 3 Effect of Ca on photosynthetic pigment content of Camellia oleifera leaves under Al stress

2.3 鈣對鋁脅迫下油茶葉片光合參數(shù)的影響

由圖1 可知，與對照（CK）相比，鋁脅迫（CK+Al）處理下油茶葉片Pn、Gs、Tr 分別下降32.28%、51.02%和53.91%，表明鋁脅迫抑制了油茶的光合作用。適量外源鈣的施入均能促進Pn、Gs 和Tr 的上升，尤其是Al+Ca 3.0 處理下，油茶葉片Pn、Gs 和Tr 分別比鋁脅迫（CK+Al）上升41.55%、93.75%和76.42%，差異顯著。與Pn、Gs 和Tr 相反，油茶葉片Ci 值在鋁脅迫下顯著提高，較對照（CK）提高20%，施外源鈣后Ci反而降低，不同鈣濃度處理下Ci 差異不顯著。

圖1 鈣對鋁脅迫下油茶葉片光合參數(shù)的影響Fig.1 Effect of Ca on photosynthesis parameters of Camellia oleifera leaves under Al stress

2.4 鈣對鋁脅迫下油茶根系滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

由表4 可知，鋁脅迫（CK+Al）處理顯著抑制了油茶根系對可溶性糖和可溶性蛋白的積累，與對照（CK）相比分別下降24.88%和27.06%。添加適量濃度外源鈣，可溶性糖含量顯著上升，Al+Ca 1.5 和Al+Ca 3.0 處理分別較鋁脅迫（CK+Al）提高17.72%和23.00%。外源鈣的添加并未緩解鋁脅迫對可溶性蛋白的抑制作用，反而降低可溶性蛋白含量，尤其是鈣濃度達到3 mmol/L 時，可溶性蛋白含量顯著低于鋁脅迫（CK+Al）處理。游離脯氨酸和游離氨基酸含量在鋁脅迫（CK+Al）下顯著提高，其含量是對照（CK）的2 倍和1.2 倍。隨著外源鈣的施入，游離脯氨酸含量呈先下降后上升的趨勢，當鈣濃度達到1.5 和3 mmol/L 時，其含量顯著降低，分別比鋁脅迫（CK+Al）處理下降19.40%和27.03%，而高鈣（5 mmol/L）處理下游離脯氨酸含量上升，與鋁脅迫（CK+Al）相比差異不顯著。外源鈣的施入促進了游離氨基酸的積累，當鈣濃度達到1.5 和3 mmol/L 時，其含量較對照（CK）分別上升35.81%和38.60%，較鋁脅迫（CK+Al）處理上升13.62%和15.95%。

表4 鈣對鋁脅迫下油茶根系滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響Table 4 Effect of Ca on root osmoregulatory substances of Camellia oleifera roots under Al stress

2.5 鈣對鋁脅迫下油茶根系MDA 含量和質(zhì)膜透性的影響

鈣鋁處理對油茶根系MDA 含量和質(zhì)膜透性的影響如圖2 所示，在受到鋁脅迫（CK+Al）后，與對照（CK）相比，MDA 含量和質(zhì)膜透性分別提高39.25%和29.26%，差異顯著，表明油茶根系質(zhì)膜受到傷害。添加外源鈣后，MDA 含量呈現(xiàn)出先下降后上升的變化趨勢，與鋁脅迫（CK+Al）處理相比，Al+Ca 0.5、Al+Ca 1.5 和Al+Ca 3.0 處理分別下降15.87%、19.52%和31.40%，且差異顯著；而Al+Ca 5.0 處理下MDA 含量與鋁脅迫（CK+Al）處理無顯著差異。油茶根系質(zhì)膜透性在Al+Ca 0.5、Al+Ca 1.5 和Al+Ca 3.0 處理下呈下降趨勢，尤其Al+Ca 1.5 處理下質(zhì)膜透性值最低，較鋁脅迫（CK+Al）下降27.86%；Al+Ca 5.0 處理下油茶根系質(zhì)膜透性升高，與鋁脅迫（CK+Al）處理無顯著差異。

圖2 鈣對鋁脅迫下油茶根系MDA 含量和質(zhì)膜透性的影響Fig.2 Effect of Ca on malondialdehyde content and plasma membrane permeability of Camellia oleifera roots under Al stress

2.6 鈣對鋁脅迫下油茶抗氧化酶活性的影響

由圖3 可知，鋁脅迫（CK+Al）處理下油茶根系SOD、POD、CAT 和葉片AXP 活性均顯著低于對照（CK），分別下降19.44%、29.85%、50.22%和27.92%。在添加外源鈣后，隨著鈣濃度的升高，油茶根系SOD、POD、CAT 和葉片AXP 活性表現(xiàn)為先上升后下降的變化趨勢。在Al+Ca 3.0 處理下SOD 和CAT 活性最高，分別比鋁脅迫（CK+Al）提高53.16%和136.77%；在Al+Ca 1.5 處理下，POD 和AXP 活性最高，與鋁脅迫（CK+Al）處理相比分別提高36.16%和64.08%；而Al+Ca 5.0 處理下，SOD、POD、CAT 和AXP 活性降低，表明高濃度鈣鋁處理會抑制油茶抗氧化酶活性。

圖3 鈣對鋁脅迫下油茶抗氧化酶活性的影響Fig.3 Effect t of Ca on antioxidant enzymes activity of Camellia oleifera under Al stress

3 討論

在強烈的淋溶作用下，酸性紅壤地區(qū)土壤中大量活性鋁被釋放，過量活性鋁會對植物產(chǎn)生毒害作用［29］，抑制植物根尖細胞的分裂伸長，降低根系活力，阻礙其對養(yǎng)分和水分的吸收積累，甚至使得根系畸形壞死，從而影響植株生長［30］。研究表明，外源鈣的施入可以有效緩解鋁毒對植物根系的破壞［31］。本試驗中，鋁脅迫下顯著抑制了油茶幼苗的地徑、株高、植株干質(zhì)量、葉片數(shù)及根系活力，在添加適當濃度（3 mmol/L）外源鈣后，油茶根系活力顯著提高，地徑、株高、植株干質(zhì)量等明顯增加，表明鈣能有效緩解鋁脅迫對油茶幼苗生長的抑制作用，這可能是因為Ca2+和 Al3+能夠同時被油茶幼苗的根系吸收，存在競爭關(guān)系，施鈣可以增強Ca2+與Al3+的拮抗作用，提高鈣在細胞膜結(jié)合位點的競爭力，降低根系對Al3+的吸收和積累，從而起到緩解鋁毒的作用［32］。然而當外源鈣濃度達到5 mmol/L 時，與鋁脅迫相比，油茶幼苗各項生長指標無顯著差異，表明外源鈣濃度并非越高越好，高濃度鈣處理對緩解油茶耐鋁毒的作用不大，甚至可能與鋁協(xié)同產(chǎn)生抑制作用。

光合作用是為植物生長發(fā)育提供能量的過程，同時有助于植物積累有機物［33］。光合色素主要參與光能的吸收、轉(zhuǎn)化與傳遞，是反映植物光合作用的重要指標。葉綠素是最主要的光合色素，其含量高低直接決定光合作用的強弱［34］，類胡蘿卜素可以快速淬滅吸收過量光子，產(chǎn)生激發(fā)態(tài)葉綠素，實現(xiàn)保護功能。鄭陽霞等［35］研究發(fā)現(xiàn)，Al3+會破壞植物的光合系統(tǒng)，降低葉片葉綠素和類胡蘿卜素的含量。當葉綠素含量降低時，天線色素和反應色素捕獲、轉(zhuǎn)化光能下降，導致光合速率下降，從而抑制植物的光合作用［36］。在本研究中，鋁脅迫下油茶葉片葉綠素和類胡蘿卜素含量均顯著減少，Pn、Gs 和Tr 明顯降低，可見鋁脅迫抑制了油茶光合作用。在Pn、Gs、Tr下降的同時，Ci 顯著上升，表明非氣孔因素是鋁脅迫抑制油茶光合速率的主要因素，鋁脅迫導致進入葉肉細胞的CO2不能被及時同化，這與渠心靜等［17］研究結(jié)果一致。施加一定濃度的外源鈣（1.5～3.0 mmol/L）可以抑制油茶葉綠素、類胡蘿卜素的含量的下降，表明Ca2+有助于維持葉綠體膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和完整性，從而使葉片保持較高的光合色素。與此同時，隨著鈣的添加，與鋁脅迫處理相比，Pn、Gs 和Tr 升高，而Ci 下降，表明鈣的添加可以增強油茶幼苗的光合作用，促進對光能的吸收和利用，這也是油茶植株生物量增加的原因。當鈣濃度達到5 mmol/L 時，葉綠素含量、Pn、Gs、Tr 均降低，且與鋁脅迫處理無顯著差異，表明高鈣高鋁處理會抑制油茶葉片光合色素合成，降低光合速率，這與王玉鳳等［37］研究結(jié)果一致。

植物為適應逆境，會通過調(diào)節(jié)體內(nèi)的游離脯氨酸、游離氨基酸、可溶性蛋白和可溶性糖等物質(zhì)來提高其抗逆性?？扇苄蕴呛涂扇苄缘鞍撞粌H可以為植物提供能量，還可以調(diào)節(jié)植物體內(nèi)細胞液濃度以改變滲透勢［38］。在逆境中，游離脯氨酸會大量積累，通過降低細胞滲透勢來減少細胞液外滲［39］。本研究中，鋁脅迫顯著降低了油茶根系的可溶性糖和可溶性蛋白含量，而游離脯氨酸和游離氨基酸含量明顯上升，在添加1.5～3 mmol/L 鈣處理后，可溶性糖和游離氨基酸含量顯著提高，游離脯氨酸含量明顯下降，可溶性蛋白含量與鋁脅迫處理無顯著差異。隨著外源鈣的施加，可溶性糖含量升高可以有效降低油茶根系的滲透勢，維持膨壓，增強吸水功能，而游離脯氨酸含量的下降也表明此時油茶幼苗所受鋁脅迫得到緩解。增加營養(yǎng)液中外源鈣濃度，可溶性蛋白、游離氨基酸含量的變化趨勢相反，這可能與鈣在氮的代謝、合成中所起的作用有關(guān)，其具體機制有待進一步研究。

植物在逆境脅迫中細胞膜容易受到破壞，影響其調(diào)節(jié)和控制胞內(nèi)和胞外物質(zhì)運輸、交換的功能。研究表明，鋁脅迫會導致植物體內(nèi)產(chǎn)生過多的活性氧自由基（ROS），打破ROS 與抗氧化酶之間的平衡，加快植物體內(nèi)膜脂過氧化進程，損傷細胞膜系統(tǒng)，導致質(zhì)膜過氧化，產(chǎn)生MDA，因此，通常用MDA 含量來衡量植物受害程度［40］。本研究結(jié)果表明，鋁脅迫處理使油茶幼苗根系的MDA 含量和細胞質(zhì)膜透性增大，而加入1.5～3.0 mmol/L 鈣能明顯緩解MDA 和質(zhì)膜透性的增加，表明適量外源鈣能抑制膜脂過氧化、降低質(zhì)膜透性，其原因可能是Ca2+與膜磷脂的極性頭部結(jié)合發(fā)生交聯(lián)作用，從而使得膜脂上的蛋白質(zhì)分子和磷脂分子結(jié)合緊密，降低細胞膜的透性［41］。由于鋁脅迫產(chǎn)生大量ROS，會激發(fā)植物自身的保護系統(tǒng)來清除過量ROS，而SOD、POD、CAT 和APX 等抗氧化保護酶可以在植物體內(nèi)協(xié)同作用抵御逆境脅迫。SOD 可以催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應，POD、CAT 和APX 負責清除歧化過程中產(chǎn)生的H2O2，起到清除和阻止自由基形成的作用，從而維持細胞正常功能［42-44］。有研究表明，施鈣有助于提高植物的抗氧化酶活性，增強ROS 的清除能力，防御活性氧或其他過氧化物自由基對細胞膜系統(tǒng)的傷害［45］，這與本研究結(jié)果一致，施鈣水平在1.5～3 mmol/L 范圍內(nèi)，SOD、POD、CAT 和APX 活性顯著高于鋁脅迫處理，并維持在較高水平。但是，鋁脅迫的緩解作用與鈣濃度有關(guān)，低濃度（0.5 mmol/L）效果不大，而鈣濃度過高則表現(xiàn)出抑制作用，當其濃度達到5 mmol/L 時，SOD、POD、CAT 和APX 活性呈下降趨勢，這可能是高濃度鈣鋁處理對植物組織細胞產(chǎn)生新的離子傷害，使毒害作用加重，具體原因還需要深入研究。

4 結(jié)論

鋁脅迫處理顯著抑制了油茶幼苗的生長和光合色素合成，減弱光合效率，積累大量的游離脯氨酸和游離氨基酸，MDA 含量和細胞膜透性增大，從而引起氧化脅迫。通過外施3 mmol/L 鈣，油茶幼苗的植株干質(zhì)量和根系活力分別提高40.58%和54.17%，光合色素含量顯著提高，Pn、Gs 和Tr 分別上升41.55%、93.75%和76.42%，表明施鈣增強了葉片細胞捕獲光的能力。同時，鈣的施入還提高了可溶性糖含量，降低MDA 含量，促進 SOD、POD、CAT 和APX 活性的提高，從而減輕質(zhì)膜過氧化程度和活性氧的積累。適宜濃度鈣可以有效緩解鋁脅迫對油茶的傷害，提高油茶對鋁脅迫的耐性，保證油茶正常生長。