基于eDNA 技術(shù)的珠海外伶仃海洋牧場(chǎng)細(xì)菌多樣性研究

臧能瑋，朱愛(ài)意，陳丕茂，袁華榮，張紅會(huì)，魏文迪，3

（1.浙江海洋大學(xué)國(guó)家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，浙江 舟山 316022；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)院南海水產(chǎn)科學(xué)研究所，廣東 廣州 510300；3.上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院，上海 201306）

【研究意義】海洋微生物是海洋初級(jí)生產(chǎn)力的代表，約占全球海洋初級(jí)生產(chǎn)力的一半［1］，是海洋生態(tài)系統(tǒng)中生物要素的重要組成，在物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)中發(fā)揮著重要作用。海洋微生物個(gè)體或群落變化可以客觀地反映水體變化［2］，在生態(tài)監(jiān)測(cè)實(shí)踐中廣泛應(yīng)用［3］。海洋微生物還在環(huán)境污染的生物修復(fù)、全球氣候變化調(diào)節(jié)等方面具有舉足輕重的作用。研究珠海外伶仃海洋牧場(chǎng)微生物多樣性，對(duì)于加強(qiáng)海洋牧場(chǎng)管理和維護(hù)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】環(huán)境DNA（environmental DNA,eDNA）是采用非直接接觸的方式提取環(huán)境中有機(jī)體遺留的DNA，即直接從環(huán)境樣品 (土壤、沉積物、水等)獲得遺傳物質(zhì)，是一種有效、無(wú)創(chuàng)且易于標(biāo)準(zhǔn)化的取樣方法［4］。1990 年宏基因組編碼（DNA metabarcoding）由Giovannoni 等［5］首次提出。1998 年Handelsman 等［6］提取了湖底沉積微生物的DNA 片段。2000 年Rondon 等［7］提出“eDNA 技術(shù)”概念，直到2005 年Martellini等［8］從水樣中提取 DNA 尋找地表水污染源，開(kāi)啟了該技術(shù)運(yùn)用于水生生態(tài)系統(tǒng)的篇章。2008 年Ficetola 等［9］利用eDNA 技術(shù)追蹤入侵物種美國(guó)牛蛙，使eDNA 技術(shù)首次應(yīng)用在水生生物的監(jiān)測(cè)上［10］。在2010 年前后，有研究者逐漸將eDNA技術(shù)引入海洋調(diào)查中。結(jié)合海水中各種復(fù)雜的化學(xué)和物理變化過(guò)程，構(gòu)建eDNA 研究相關(guān)計(jì)算模型，將eDNA 技術(shù)發(fā)揮更大的作用。目前，eDNA與DNA 技術(shù)相結(jié)合，已成為生物多樣性監(jiān)測(cè)有力的新型工具。近年來(lái)，eDNA 的應(yīng)用經(jīng)歷了巨大的發(fā)展，已廣泛應(yīng)用于群落生態(tài)學(xué)、古環(huán)境研究、生物監(jiān)測(cè)、生物保護(hù)學(xué)和入侵生態(tài)學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域。珠海外伶仃國(guó)家級(jí)海洋牧場(chǎng)位于珠江口萬(wàn)山群島中北部，海域面積9.83 km2，于2018 年入選第四批國(guó)家級(jí)海洋牧場(chǎng)示范區(qū)［11］。目前對(duì)珠海外伶仃海洋牧場(chǎng)的調(diào)查研究主要集中在生物資源種類組成［12］、數(shù)量分布［13］、時(shí)空變化［14］等方面，而有關(guān)微生物研究只涉及到吖啶橙染色直接鏡檢計(jì)數(shù)法［15］，尚未見(jiàn)到采用eDNA 技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)研究的報(bào)道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】為解決珠海外伶仃海洋牧場(chǎng)微生物檢測(cè)方法的單一性，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性，運(yùn)用eDNA 技術(shù)檢測(cè)珠海外伶仃海洋牧場(chǎng)的微生物多樣性，并與傳統(tǒng)檢測(cè)方法進(jìn)行對(duì)比驗(yàn)證，為珠海外伶仃海洋牧場(chǎng)的微生物檢測(cè)提供一條新的途徑。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】基于eDNA 技術(shù)的檢測(cè)結(jié)果，分析珠海外伶仃海洋牧場(chǎng)的微生物群落組成、生物多樣性等特征，以期為珠海外伶仃海洋牧場(chǎng)生態(tài)系統(tǒng)管理維護(hù)提供參考。

1 材料與方法

1 站位點(diǎn)設(shè)置

為了解微生物多樣性，本研究在廣東省珠海外伶仃海域國(guó)家級(jí)海洋牧場(chǎng)示范區(qū)設(shè)立了S1～S9（22°05'25.107″～22°07'55.272″N、113°59'50.170″～114°03'35.238″E）9 個(gè)站位點(diǎn)，站位點(diǎn)位置分布見(jiàn)圖1。

圖1 9 個(gè)站位點(diǎn)位置Fig.1 Location of 9 stations

1.2 采樣及樣品預(yù)處理

為防止樣品間出現(xiàn)交叉污染，在采樣前對(duì)采樣器皿進(jìn)行消毒，以10%次氯酸鈉溶液［16-17］浸泡10 min，蒸餾水沖洗3 遍，采樣人員佩戴手套并及時(shí)更換。本研究于2021 年9 月13 日在9 個(gè)站位點(diǎn)進(jìn)行樣品采集，每個(gè)站位點(diǎn)設(shè)6 個(gè)平行試驗(yàn)，共采集54份水樣。每份水樣采集2 L表層水（在水面以下約2 m 處采集）［16-17］，用0.45 μm 孔徑的混合纖維濾膜過(guò)濾［18-19］，加入5 mL 95%無(wú)水乙醇滅活，將過(guò)濾后的濾膜放置于無(wú)菌吸水紙，對(duì)折，使濾膜干燥，同一站位點(diǎn)的樣品袋折疊放入2 mL 的離心管，貼上標(biāo)簽紙，最后放入液氮內(nèi)保存。

1.3 DNA 提取

DNA 提取采用DNA Clean &Concentrator-25 試劑盒（購(gòu)于北京天漠科技開(kāi)發(fā)有限公司），參考Martin-Laurent［20］的方法：洗滌后的樣品加入400 μL Cell 裂解液,旋渦振蕩1 min，65℃水浴30 min，每5 min 振蕩1 次，冷卻到室溫。以12 000 r/min、4℃離心10 min，取上清，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇（25 ∶24 ∶1）混合溶液，上下顛倒、混勻；繼續(xù)以12 000 r/min、4℃離心10 min 后取上清，加入等體積的氯仿/異戊醇（24 ∶1）混合溶液，上下顛倒、混勻；再以12 000 r/min、4℃離心10 min，取上清于新離心管中，加入0.6 倍體積的異丙醇，室溫靜置1 h 后，12 000 r/min、4℃離心10 min，棄上清，用70%冰乙醇溶液洗滌沉淀，倒置，于無(wú)菌干燥沉淀中加入100 μL 含20 μg/mL RNaesA 的無(wú)菌TE buffer溶解DNA 沉淀，于30℃水浴30 min 后取出置于-20℃冰箱保存。

1.4 PCR 擴(kuò)增及高通量測(cè)序

將提取好的DNA 樣品寄到生工生物工程（上海）股份有限公司，使用引物MF-F：5'-GTCGGTAAAACTCGTGCCAGC-3'進(jìn)行PCR 擴(kuò)增［21］，使用Cutadapt 軟件［22-23］去除Read1 3'端測(cè)序引物接頭：AGATCGGAAGAGCACACGTCTG AACTCCAGTCA 和Read2 3'端測(cè)序引物接頭：AG ATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT，使用Prinseq 軟件［24-25］切除Reads 尾部質(zhì)量值20以下的堿基，設(shè)置10 bp 的窗口，若窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于20，則從窗口開(kāi)始截去后端堿基，過(guò)濾質(zhì)控后的含N 序列和短序列，最終過(guò)濾掉低復(fù)雜度的序列（圖2）。

圖2 原始序列數(shù)據(jù)（A）和有效序列數(shù)據(jù)（B）長(zhǎng)度分布Fig.2 Length distributions of raw sequence data (A) and valid sequence data (B)

1.5 數(shù)據(jù)分析

1.5.1 微生物種類鑒定 序列比對(duì)使用 QIIME 軟件中的UCLUST［26］，在默認(rèn)參數(shù)中將序列與Silva、NCBI、FGR 數(shù)據(jù)庫(kù)的模板序列相比對(duì)，利用高通量測(cè)序技術(shù)，將經(jīng)過(guò)處理的序列進(jìn)行OTU 聚類，然后對(duì)OTU 進(jìn)行注釋，完成物種分類。

1.5.2 多樣性指數(shù)分析（1）Chao 指數(shù)［27］: 估計(jì)微生物群落中含OTU 數(shù)目的指數(shù)，計(jì)算公式如下：

式中，Schao是估計(jì)的OTU 數(shù)，Sobs是實(shí)際觀測(cè)到的OTU 數(shù)，n1是只含有1 條序列的OTU 數(shù)目，n2是只含有2 條序列的OTU 數(shù)目 。

（2）Shannon 多樣性指數(shù)［28］: 用于估算樣品中微生物多樣性指數(shù)之一。Shannon 值越大，說(shuō)明群落多樣性越高。計(jì)算公式如下：

式中，Sobs是實(shí)際觀測(cè)到的OTU 數(shù)，ni是第i個(gè)OTU 包含的序列數(shù)，N是所有個(gè)體數(shù)目，此處為序列總數(shù)。

（3）Simpson 指數(shù): 用于估算樣品中微生物多樣性指數(shù)之一，Simpson 指數(shù)值越大，說(shuō)明群落多樣性越低。計(jì)算公式如下：

式中，Sobs是實(shí)際觀測(cè)到的OTU 數(shù)，ni是第i個(gè)OTU 包含的序列數(shù)，N是所有個(gè)體數(shù)目，此處為序列總數(shù)。

（4）物種優(yōu)勢(shì)度（Y）：表示微生物物種所占的優(yōu)勢(shì)程度，計(jì)算公式為：

式中，ni是第i個(gè)OTU 包含的序列數(shù)，N是所有個(gè)體數(shù)目，fi為第i個(gè)OTU 在各采樣點(diǎn)出現(xiàn)的頻率［31］。本文將Y＞ 0.02 的微生物確定為優(yōu)勢(shì)種。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序所得OTU

測(cè)序所得有效數(shù)據(jù)見(jiàn)表1，9 個(gè)站位點(diǎn)的樣品共產(chǎn)生779 706 個(gè)OTU，平均長(zhǎng)度255 bp，其中S9 站位點(diǎn)樣品的OTU 最多、為95 914 個(gè)，S1 站位點(diǎn)的OTU 最少、為77 448 個(gè)。測(cè)序所得有效數(shù)據(jù)每個(gè)樣品平均獲得96 141 條原始序列，經(jīng)過(guò)拼接和質(zhì)量過(guò)濾［32-33］，每個(gè)樣品平均得到86 634 條序列，高質(zhì)量數(shù)據(jù)占90.1%。

表1 樣本有效序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 1 Statistics of valid sequence data of samples

2.2 珠海外伶仃海洋牧場(chǎng)微生物α 多樣性

本次高通量測(cè)序有效數(shù)據(jù)與OUT 數(shù)量關(guān)系如圖3，各個(gè)樣本的稀釋性曲線趨于平緩。其中S1-2、S4-1、S8-2 等3 個(gè)位點(diǎn)的稀釋曲線趨于平緩前的斜率明顯比其他曲線更高，表明3 個(gè)位點(diǎn)的OTU 數(shù)目少于其他位點(diǎn)，即這3 個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)出的物種數(shù)量少于其他位點(diǎn)。由表2 可知，S1 站位點(diǎn)無(wú)論是Shannon 指數(shù)還是Chao 指數(shù)均最低、分別為2.89 和508.49，S9 站位點(diǎn)最高、分別是3.37和660.37，表明S1 站位點(diǎn)的微生物多樣性最低，S9 站位點(diǎn)的微生物多樣性最高。

表2 α 多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistics of α diversity index

圖3 α 指數(shù)稀釋性曲線Fig.3 α index dilution curve

Pan/Core OTU 用于描述隨著樣本量加大物種總量和核心物種量變化的情況。Pan OTU 為泛OTU，是所有樣本包含的OTU 總和；Core OTU 為核心OTU，是所有樣本共有的OTU 數(shù)目。Pan/Core 曲線反映了持續(xù)抽樣下新OTU 出現(xiàn)的速率。利用物種累積曲線可以判斷樣品量是否充分，如圖4 所示，隨著樣品量的加大，Pan/Core 曲線趨于平緩，表示此環(huán)境中的物種并不會(huì)隨樣品量的增加而顯著增多，證明本研究樣品準(zhǔn)備較好，準(zhǔn)確性較高［34］。

圖4 Pan/Core 曲線Fig.4 Pan/Core curve

2.3 珠海外伶仃海洋牧場(chǎng)微生物β 多樣性

通過(guò)PCA 分析不同樣本群落組成可以反映樣本間的差異和距離，PCA 運(yùn)用方差分解，將多組數(shù)據(jù)的差異反映在二維坐標(biāo)圖上，表示物種OTU在主成分上的貢獻(xiàn)度，如樣本物種組成越相似，反映在PCA 圖中的距離越近。圖5 顯示，樣本分散程度較大，距離較遠(yuǎn)，說(shuō)明各站位點(diǎn)之間的微生物物種差異較大。

圖5 各站位點(diǎn)樣本的PCA 圖Fig.5 PCA figure of samples from various staions

2.4 珠海外伶仃海洋牧場(chǎng)微生物物種

利用eDNA 技術(shù)從珠海外伶仃海洋牧場(chǎng)9 個(gè)站位點(diǎn)的樣本中檢測(cè)到779 706 個(gè)OTU，進(jìn)行注釋后得到的微生物物種共30 種，（表3）隸屬于5 門7 綱14 目19 科26 屬，分為變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、浮霉菌門（Planctomycetes）、厚壁菌門（Firmicutes），其中放線菌門僅有兩種微生物分別是放線桿菌（Actinobacterium）和微酸菌（Ilumatobacter），在擬桿菌門中只檢測(cè)到鞘氨醇桿菌（Sphingobacterium）。

表3 9 個(gè)站位點(diǎn)的微生物物種統(tǒng)計(jì)Table 3 Microbial species statistics of 9 stations

2.5 珠海外伶仃海洋牧場(chǎng)微生物相對(duì)豐度

在珠海外伶仃海洋牧場(chǎng)各個(gè)站位點(diǎn)中變形菌門至少占61%以上，遠(yuǎn)高于其他門，是絕對(duì)優(yōu)勢(shì)門（圖6）。放線菌門在各站位點(diǎn)分布最少，且在S1、S3、S8 中未被檢測(cè)到，并且各站位點(diǎn)有少量檢測(cè)到的序列未被標(biāo)注。

圖6 各站位點(diǎn)微生物相對(duì)豐度Fig.6 Relative abundance of microorganisms from various stations

基于eDNA 技術(shù)對(duì)珠海外伶仃海洋牧場(chǎng)9 個(gè)站位點(diǎn)的樣本檢測(cè)到的微生物物種分為5 門，其中放線菌門最少，只占總檢測(cè)物種的1.06%，而變形菌門是絕對(duì)優(yōu)勢(shì)門，占總檢測(cè)物種的75.06%，其中γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）最多，共5 目8 科11 屬17 種；其余為α-變形菌綱（Alphaproteobacteria），共4 目4 科6 屬6 種。此外，擬桿菌門占比11.35%，厚壁菌門占比5.28%，浮霉菌門占比1.91%。優(yōu)勢(shì)種共有7 種（表3），包含交替假單胞菌（Pseudoalteromonas）、海桿菌（Marinobacter）、莫拉克氏菌（Moraxella）、嗜冷菌（Psychrobacter）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）、嗜鹽單胞菌（Halomonas）、鞘氨醇桿菌，其中溶藻弧菌優(yōu)勢(shì)度最高（0.191），為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)種，其次是莫拉克氏菌和交替假單胞菌優(yōu)勢(shì)度分別達(dá)到0.14 和0.127，為主要優(yōu)勢(shì)種。

3 討論

3.1 eDNA 方法的準(zhǔn)確性

本研究中每個(gè)樣品的高質(zhì)量數(shù)據(jù)占90.1%。宋倫等［35］研究表明，DNA 高質(zhì)量數(shù)據(jù)達(dá)到90%以上，則測(cè)得OTU 數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。當(dāng)各個(gè)樣本的α 指數(shù)稀釋性曲線趨于平緩，表明測(cè)序數(shù)據(jù)趨于飽和，測(cè)序深度已足夠反映樣品中的所有OTU 信息，也就可以認(rèn)為測(cè)序深度已經(jīng)基本覆蓋到樣品中所有物種［36］。且Pan/Core 曲線趨于平緩，表示此環(huán)境中的物種并不會(huì)隨樣品量的增加而顯著增多。

深入研究海洋微生物群落組成、分布及其形成機(jī)制有助于監(jiān)測(cè)海洋牧場(chǎng)生態(tài)系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)變化、預(yù)測(cè)人類活動(dòng)、理解氣候變化等自然現(xiàn)象對(duì)珠海外伶仃海洋牧場(chǎng)的影響。eDNA 技術(shù)與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方式相比，在微生物調(diào)查中更加省時(shí)省力、節(jié)約成本，并且對(duì)環(huán)境無(wú)損傷，對(duì)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法監(jiān)測(cè)結(jié)果有較高的還原性，并可檢測(cè)到一些傳統(tǒng)方法無(wú)法識(shí)別的稀有物種和隱匿物種，說(shuō)明 eDNA 技術(shù)在生物多樣性監(jiān)測(cè)中具有重要應(yīng)用潛力。

3.2 eDNA 技術(shù)應(yīng)用于珠海外伶仃海洋牧場(chǎng)微生物檢測(cè)的不足與建議

在珠海外伶仃海洋牧場(chǎng)的微生物多樣性研究中，因受疫情影響，本研究只有2021 年秋季（9 月）的數(shù)據(jù)，尚未開(kāi)展其他季度的調(diào)查研究，并且采集樣品單一，無(wú)法較全面地掌握珠海外伶仃海洋牧場(chǎng)微生物群落的空間分布規(guī)律和時(shí)空變化，為提高數(shù)據(jù)結(jié)果的準(zhǔn)確性、了解微生物群落在珠海外伶仃海洋牧場(chǎng)的變化趨勢(shì)，應(yīng)長(zhǎng)期、定期地開(kāi)展不同水深的采樣研究。

本研究也揭示了eDNA 技術(shù)的一些不足之處，自然界中有大量未被發(fā)現(xiàn)、培養(yǎng)和測(cè)序的物種，其基因序列在數(shù)據(jù)庫(kù)中不存在，導(dǎo)致數(shù)據(jù)庫(kù)信息與自然界實(shí)際存在的物種不對(duì)等，無(wú)法將檢測(cè)到的所有OTU 注釋到種水平。同時(shí)，受引物的偏好性影響，有些物種無(wú)法準(zhǔn)確定量地檢測(cè)出。此外，季節(jié)、水溫、流速等自然條件變化導(dǎo)致樣品成分變化，從而影響物種的檢測(cè)和相對(duì)豐度。因此，eDNA 技術(shù)仍需要與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定方法緊密結(jié)合，才能構(gòu)建可靠的多維生物監(jiān)測(cè)系統(tǒng)。

4 結(jié)論

本研究運(yùn)用eDNA 檢測(cè)數(shù)據(jù)和海洋生物數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)微生物特征條形碼序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，檢測(cè)到珠海外伶仃海洋牧場(chǎng)30 種微生物。通過(guò)種類組成和優(yōu)勢(shì)種的對(duì)比分析，確定了變形菌門為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)門，以及交替假單胞菌、海桿菌、莫拉克氏菌、嗜冷菌、溶藻弧菌、嗜鹽單胞菌、鞘氨醇桿菌7 種優(yōu)勢(shì)菌，推進(jìn)了廣東省珠海外伶仃海域國(guó)家級(jí)海洋牧場(chǎng)示范區(qū)海洋生物多樣性研究，為后續(xù)海洋牧場(chǎng)微生物方面的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和科學(xué)參考。隨著eDNA 技術(shù)的不斷完善和發(fā)展，該方法不僅會(huì)用于大規(guī)模的生物監(jiān)測(cè)，更有望融合到海洋牧場(chǎng)生物多樣性監(jiān)測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)程序中。