白皮和江屯青皮佛手瓜嫩梢的代謝組比較分析

史紹琪，陳金甜，林毓娥，謝國源，黃美華，王 敏

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所/廣東省蔬菜新技術(shù)研究重點實驗室，廣東 廣州 510640；2.廣寧縣江屯鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，廣東 廣寧 526334；3.廣寧縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，廣東 廣寧 526300；4.肇慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，廣東 肇慶 526000）

【 研究意義】 佛手瓜（Sechium eduleSwartz）為葫蘆科佛手瓜屬多年生宿根性攀援植物，廣泛分布于熱帶及溫帶地區(qū)，是一種常見的瓜類蔬菜［1］。佛手瓜原產(chǎn)于墨西哥，19 世紀(jì)初傳入我國臺灣地區(qū)，目前在廣東、云南、浙江、福建、臺灣等地廣泛種植［2-3］。佛手瓜是一種營養(yǎng)豐富的珍稀蔬果，具有舒肝理氣、和胃止痛、美容養(yǎng)顏和擴(kuò)張血管、降壓的功效［4-5］。龍須菜是佛手瓜的嫩梢，20 世紀(jì)80 年代末，廣東肇慶廣寧縣開始種植［6-7］，其口感爽脆、風(fēng)味獨特，兼具助消化、清熱解毒等保健作用，富含維生素B、維生素C、胡蘿卜素、總黃酮和礦質(zhì)元素［8-10］，龍須菜鮮苗中含有豐富的蛋白質(zhì)以及鈣、鐵、硒等元素，其含量均高于其他蔬菜［11］。雖然龍須菜營養(yǎng)價值較高，但有關(guān)其代謝組學(xué)研究方面尚未見報道。【前人研究進(jìn)展】代謝組學(xué)（Metabonomics）可用于代謝途徑或代謝網(wǎng)絡(luò)解析，是定量評價果蔬品質(zhì)的有效途徑之一［12-14］。目前，代謝組學(xué)已在水稻［15-16］、玉米［17］、擬南芥［18］、番茄［19］、萵苣［20］、大豆［21］和甜瓜［22］等作物得到應(yīng)用，并為其他物種代謝物積累模式和遺傳基礎(chǔ)研究提供參考。研究者從表型與脂質(zhì)分子層面對不同花生品種進(jìn)行品質(zhì)鑒評，最終篩選到3類31 種核心差異脂質(zhì)分子，在花生品種鑒定中發(fā)揮關(guān)鍵作用［23］。赤霞珠是釀酒葡萄的主要栽培品種，研究者對赤霞珠果皮不同砧穗組合進(jìn)行代謝組分析，成功鑒定出赤霞珠葡萄6 種砧穗組合特征標(biāo)志物，為葡萄砧木良種選育提供方向［24］。研究發(fā)現(xiàn)，蔗糖、葫蘆素、脂質(zhì)等差異代謝物可作為標(biāo)記性物質(zhì)區(qū)分不同類型西瓜品種，為西瓜育種奠定基礎(chǔ)［25］。不同瓠瓜果實間存在較大的代謝物差異，脂質(zhì)、氨基酸、黃酮類物質(zhì)綜合影響?zhàn)瞎麑嶕r味［26］?！颈狙芯壳腥朦c】白皮和江屯青皮佛手瓜的果實皮色差異明顯，但其嫩梢表型差異肉眼無法辨別，且嫩梢的代謝物組成和含量尚未見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以白皮和江屯青皮佛手瓜嫩梢為材料，鑒定不同龍須菜品種中差異代謝物質(zhì)，為佛手瓜嫩梢的品質(zhì)改良和有效利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為成熟期白皮和江屯青皮佛手瓜，由肇慶市廣寧縣江屯鎮(zhèn)富竹莊園生態(tài)農(nóng)場提供。2021 年春季，種植于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所白云試驗基地。首先將成熟期白皮和江屯青皮佛手瓜整瓜分別種植于營養(yǎng)缽中，常規(guī)栽培管理，發(fā)芽后移栽至大田；主莖長至15 節(jié)左右時，分別摘取約3 cm 左右頂端新鮮嫩梢置于液氮中，每個品種選取9 個單株，摘取嫩梢，3 次重復(fù)，保存在-80℃冰箱。江屯青皮佛手瓜嫩梢（LXCB）作為對照，白皮佛手瓜嫩梢（LXCW）作為試驗組進(jìn)行差異代謝物等數(shù)據(jù)分析。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備 將樣品置于凍干機(jī)（Scientz-100F）中真空冷凍干燥；利用研磨儀（MM 400、Retsch）研磨（30 Hz，1.5 min）至粉末狀；稱取100 mg 粉末，在1.2 mL 70%甲醇提取液中溶解；每30 min 渦旋一次，每次持續(xù)30 s，6 次重復(fù)，樣本置于4℃冰箱過夜；12 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心10 min，吸取上清液，用微孔濾膜（0.22 μm）過濾樣品，將樣品保存至進(jìn)樣瓶中，用于UPLC-MS/MS 分析。樣品（名稱分別為LXCW1、LXCW2、LXCW3 以及LXCB1、LXCB2、LXCB3）送至武漢邁維維爾生物科技有限公司進(jìn)行廣泛靶向代謝組檢測。

1.2.2 色譜質(zhì)譜 數(shù)據(jù)采集儀器系統(tǒng)包括超高效液相色譜（Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC）超高性能液相色譜分析儀（SHIMADZU Nexera X2）和串聯(lián)質(zhì)譜（Tandem mass spectrometry，MS/MS）、4500 QTRAP 串 聯(lián)質(zhì)譜儀（Applied Biosystems 4500 QTRAP）。

液相條件：色譜柱為Agilent SB-C18 柱（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）；流動相A 為0.1%甲酸超純水溶液，流動相B 為加入0.1%甲酸的乙腈溶液；洗脫梯度為0 min 時，B 相比例為5%，9 min 內(nèi)B 相比例線性增加到95%，持續(xù)1 min，10～11 min B 相比例降為5%，并平衡至14 min；柱溫40 ℃；流速0.35 mL/min；進(jìn)樣量4 μL。

質(zhì)譜條件主要包括：使用三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀（QTRAP），AB4500 Q TRAP UPLC/MS/MS 系統(tǒng)，該系統(tǒng)配備了ESI Turbo 離子噴霧接口，采用正負(fù)兩種離子模式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。ESI源操作參數(shù)如下：離子噴霧電壓（IS）5 500 V（正離子模式）/-4500 V（負(fù)離子模式）；離子源，渦輪噴霧；源溫度550 ℃；離子源氣體I（GSI），氣體Ⅱ（GS Ⅱ）和氣簾氣（CUR）分別設(shè)置為50、60、25.0 psi，碰撞誘導(dǎo)電離參數(shù)設(shè)置為高。三重四極桿掃描使用MRM模式，并將碰撞氣體（氮氣）設(shè)置為中等。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用軟件Analyst 1.6.3 處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)，再進(jìn)行主成分（PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA），利用R 軟件中的MetaboAnalystR包OPLSR.Anal 函數(shù)進(jìn)行分析；代謝物含量數(shù)據(jù)采用歸一化處理（Unit Variance Scaling，UV Scaling），通過R 軟件ComplexHeatmap 包繪制熱圖，對代謝物在不同樣本間的積累模式進(jìn)行層次聚類分析（Hierarchical Cluster Analysis，HCA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩個佛手瓜品種嫩梢代謝組輪廓

利用MRM（三重四級桿質(zhì)譜的多反應(yīng)檢測模式）和MultiaQuant 軟件對白皮和江屯青皮佛手瓜嫩梢混合樣本進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析。結(jié)果表明，總離子流曲線重疊性高，即保留時間和峰強度一致，表明質(zhì)譜對同一樣品的不同時間檢測信號穩(wěn)定性較好。

通過對白皮和江屯青皮佛手瓜嫩梢進(jìn)行廣泛靶向代謝組學(xué)檢測，共檢測到787 種代謝物，采用主成分分析建模方法對所鑒定代謝物進(jìn)行分析。結(jié)果表明，當(dāng)PC1為51.49%、PC2為19.75%時，不同品種能夠明顯分開，同一品系樣本沒有明顯分離，3 次重復(fù)數(shù)據(jù)能較好地集中，白皮和江屯青皮佛手瓜嫩梢代謝物明顯分離（圖1）。

圖1 兩個佛手瓜品種嫩梢PCA 得分Fig.1 Score plot of PCA analysis of the tender tips of two varieties of Sechium edule

2.2 兩個佛手瓜品種嫩梢差異代謝物篩選和鑒定

基于OPLS-DA 結(jié)果和差異倍數(shù)值（Fold Change，F(xiàn)C）分析，發(fā)現(xiàn)白皮和江屯青皮佛手瓜嫩梢中差異顯著代謝物共有135 種。與江屯青皮佛手瓜嫩梢相比，白皮佛手瓜嫩梢中顯著上調(diào)53種，包括脂質(zhì)18 種、酚酸類11 種、黃酮7 種、核苷酸及其衍生物6 種、氨基酸及其衍生物4 種和其他7 種代謝物；顯著下調(diào)代謝物為82 種，包括黃酮29 種、脂質(zhì)31 種、生物堿7 種、酚酸類5 種和其他10 種代謝物（表1）。

表1 白皮佛手瓜與江屯青皮佛手瓜嫩梢部分顯著差異的代謝物 Table 1 Metabolites with significant differences between the tender tips of white Sechium edule and Jiangtun cyan Sechium edule

2.3 兩個佛手瓜品種嫩梢差異代謝物聚類分析

采用聚類分析方法對兩個佛手瓜品種嫩梢進(jìn)行差異代謝物分析。結(jié)果表明，白皮佛手瓜嫩梢中的芥子醛、松柏醇、苜蓿素-7-O-（2''-芥子酰）葡萄糖苷、5-羥基-7,8,2'，6'-四甲氧基黃酮、二氫雙去甲氧基姜黃素、十八碳二烯-6-炔酸、9-羥基過氧-10E,12,15Z-十八碳三烯酸、1-O-葡萄9 糖基芥子酸、香草醛;4-羥基-3-甲氧基苯甲醛、9-羥基-13-氧代-10-十八碳烯酸等代謝物含量比江屯青皮嫩梢高。江屯青皮佛手瓜嫩梢中的溶血磷脂酰乙醇胺16 ∶3、溶血磷脂酰膽堿16 ∶1、N',N''-二阿魏酰亞精胺、日當(dāng)藥黃素、吲哚-3-氰基-2-O-葡萄糖苷、3-O-對香豆?？鼘幩?O-葡萄糖苷、腺嘌呤核苷三磷酸、溶血磷脂酰乙醇胺18 ∶1、山奈酚-3,7-O-二鼠李糖苷（山奈苷）、溶血磷脂酰膽堿18 ∶1 含量較高（圖2）。

圖2 兩個佛手瓜品種嫩梢差異代謝物聚類分析Fig.2 Cluster analysis of differential metabolites in tender tips of two varieties of Sechium edule

2.4 兩個佛手瓜品種嫩梢差異代謝物代謝途徑分析

根據(jù)差異代謝物聚類分析結(jié)果，開展KEGG通路富集分析。結(jié)果顯示，差異代謝物主要顯著富集在嘌呤代謝、亞油酸新陳代謝、類黃酮生物合成、各種次生代謝產(chǎn)物生物合成和亞麻酸新陳代謝5 條途徑中（圖3）。嘌呤代謝富集6 種物質(zhì)，包含3'-腺嘌呤核苷酸、次黃嘌呤、腺嘌呤核苷三磷酸、腺苷-5'-單磷酸、腺苷和鳥苷 5'-單磷酸，占比16.22%；亞油酸新陳代謝富集7 種物質(zhì)，包括9S-羥基-10E,12Z-十八碳二烯酸、13-羥基十八烷基-9,11-二烯酸、9(S),12(S),13(S)-三羥基-10(E)-十八烯酸、13-氫過氧化-9,11-十八碳二烯酸、9,10-環(huán)氧十八烯酸、9S-氫過氧-10E,12Z-十八碳二烯酸和9,10,13-三羥基-11-十八碳烯酸，占比18.92%；類黃酮生物合成富集5 種物質(zhì)，包含3-O-乙酰短葉松黃烷酮、3,4,2',4',6'-五羥基查耳酮-4'-O-葡萄糖苷、圣草酚、5-O-對香豆?？鼘幩岷投倘~松素，占比13.51%；各種次生代謝產(chǎn)物生物合成富集5種，包含松脂醇、腺嘌呤核苷三磷酸、香草醛；4-羥基-3-甲氧基苯甲醛、松柏醇和鄰氨基苯甲酸，占比13.51%；α-亞麻酸新陳代謝富集3 種，包含13S-羥基-9Z,11E,15Z-十八碳三烯酸、9-羥基過氧-10E,12,15Z-十八碳三烯酸和9-羥基-12-氧代-10(E),15(Z)-十八碳二烯酸，占比8.11%。

圖3 兩個佛手瓜品種嫩梢差異代謝物KEGG 富集Fig.3 Differential metabolite KEGG enrichment of tender tips of the two varieties Sechium edule

3 討論

代謝組學(xué)在植物學(xué)、醫(yī)學(xué)、食品科學(xué)、農(nóng)業(yè)害蟲防治等領(lǐng)域都得到廣泛應(yīng)用［27-29］，利用代謝組學(xué)方法可以將代謝物的種類與含量、生物表型變化建立更直接的聯(lián)系［30］。伍海航等［31］利用多組學(xué)技術(shù)研究了藥用植物中次生代謝調(diào)控，分析了多組學(xué)聯(lián)用與黃酮類、生物堿類等成分間的次生代謝物差異，進(jìn)一步解析了藥用植物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。杜尚廣［32］利用代謝組學(xué)分析兩種水稻在寒冷條件下代謝物差異，發(fā)現(xiàn)糖類和氨基酸類物質(zhì)響應(yīng)兩種水稻的低溫脅迫，并為水稻抗寒品種選育提供理論依據(jù)。袁平麗［33］對不同西瓜果實代謝物進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)西瓜栽培種和野生種的代謝輪廓存在明顯差異，在馴化過程中糖類物質(zhì)和類胡蘿卜素含量逐漸升高，抗?fàn)I養(yǎng)類物質(zhì)含量逐漸減少，為優(yōu)質(zhì)西瓜新品種選育提供了思路。

研究表明，脂質(zhì)類溶血磷脂酰乙醇胺可以緩解腸道炎癥，通過增加腸道上皮屏障的穩(wěn)定性，緩解或治療腸炎和炎癥性腸?。?4］；生物堿亞精胺類物質(zhì)具有鎮(zhèn)痛、降血壓以及抗抑郁等作用［35］；酚酸類腺嘌呤核苷三磷酸可以保護(hù)心肌細(xì)胞［36］，這些物質(zhì)可能是佛手瓜具有降血壓等藥用價值的關(guān)鍵。與白皮佛手瓜嫩梢相比，青皮佛手瓜嫩梢中含有豐富的溶血磷脂酰乙醇胺、阿魏酰亞精胺以及腺嘌呤核苷三磷酸，藥用價值更高。

黃酮類是果實鮮味的關(guān)鍵物質(zhì)，具有抗菌、抗氧化活性功能［37］。研究表明，淡竹葉中日當(dāng)藥黃素含量較高，可以抑制黑色素積累，具有較強的抗氧化活性［38-39］，本研究發(fā)現(xiàn)江屯青皮與白皮佛手瓜嫩梢山奈苷、日當(dāng)藥黃素均有顯著性差異，二者皆屬于黃酮類，推測其具有一定的抗氧化能力，可能參與調(diào)控佛手瓜的鮮味，影響其營養(yǎng)品質(zhì)。江屯青皮佛手瓜嫩梢含有更為豐富的黃酮類物質(zhì)，在鮮味、抗氧化等品質(zhì)方面更好。

4 結(jié)論

本研究通過代謝組學(xué)比較白皮和江屯青皮佛手瓜嫩梢的差異代謝物，共篩選到135 種顯著差異物質(zhì)，差異倍數(shù)log2處理后，溶血磷脂酰乙醇胺和日當(dāng)藥黃素log2FC 值分別為-19.21 和-14.31，表明江屯青皮龍須菜富含脂質(zhì)和黃酮類物質(zhì)，特別是溶血磷脂酰乙醇胺、日當(dāng)藥黃素等，為解析青皮龍須菜代謝組學(xué)的營養(yǎng)價值以及輔助龍須菜的品種選育提供理論基礎(chǔ)。