培養(yǎng)條件對(duì)雪茄煙優(yōu)勢(shì)菌株ZLX10 生長(zhǎng)的影響

潘 勇，張貝貝，周亞彬，胡 捷，景玉輝，李林林，黃友誼，王 劍

（1.湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，湖北 武漢 430040；華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430077；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430077）

【研究意義】近年來(lái)，雪茄煙因自身低害、風(fēng)味特別而備受青睞，進(jìn)入迅速發(fā)展階段，生產(chǎn)規(guī)模不斷擴(kuò)大。而當(dāng)前采收調(diào)制后的雪茄煙葉具有雜氣較多、刺激性較大和燃燒性較差等缺點(diǎn)，不能直接用來(lái)卷制雪茄，需采用堆垛發(fā)酵來(lái)改善其香味、吃味等品質(zhì)［1］。長(zhǎng)期以來(lái)，雪茄煙葉堆垛發(fā)酵完全依賴于傳統(tǒng)自然發(fā)酵，發(fā)酵中的微生物來(lái)源于煙葉和環(huán)境，易受環(huán)境條件的限制，發(fā)酵品質(zhì)不易控制，安全性差，無(wú)法滿足擴(kuò)大生產(chǎn)的需要。為此，人工選育雪茄煙優(yōu)勢(shì)菌株，開展優(yōu)勢(shì)菌株生長(zhǎng)條件等優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)人工接菌發(fā)酵雪茄煙葉，將是雪茄煙產(chǎn)業(yè)發(fā)展的必然方向?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】現(xiàn)階段造成雪茄煙葉品質(zhì)較低的主要原因是煙葉中蛋白質(zhì)、淀粉、纖維素等大分子物質(zhì)的含量過(guò)高，致使煙葉刺激性較強(qiáng)、青雜氣重、吸味辛辣、澀口，并使煙葉的香氣不能顯露［2-3］。在堆垛發(fā)酵中，借助微生物的作用將使這些大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化成各種小分子甚至揮發(fā)性物質(zhì)［4-8］，煙葉品質(zhì)得到提高。研究表明，接種微生物發(fā)酵煙葉能夠降解西柏烯類［9］、類胡蘿卜素［10］等煙草香味前體物，還有一些可以有效降解煙堿、甾醇、香豆素等有害化學(xué)成分，以此改善雪茄煙葉的外觀質(zhì)量［11-12］，并提高抽吸時(shí)的味道和香氣質(zhì)量［9-10］，顯著提升發(fā)酵品質(zhì)［13-14］，降低有害物質(zhì)的含量［15-16］。此外，人工接種微生物發(fā)酵可以有效縮短煙葉發(fā)酵周期，提高工業(yè)化生產(chǎn)效率。微生物應(yīng)用于煙葉發(fā)酵的前提是能夠獲得更多的菌體，其關(guān)鍵是探究適合微生物生長(zhǎng)的環(huán)境。多項(xiàng)研究表明，將微生物應(yīng)用于煙葉發(fā)酵前均會(huì)對(duì)其培養(yǎng)基、接種量、發(fā)酵時(shí)間和pH等因素進(jìn)行優(yōu)化［6,17-18］，在應(yīng)用微生物的其他領(lǐng)域也會(huì)對(duì)微生物的生長(zhǎng)環(huán)境進(jìn)行優(yōu)化，使其處在最佳狀態(tài)或者提高微生物菌株的某種功能［19-24］?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】人工接菌發(fā)酵是煙葉未來(lái)工業(yè)化生產(chǎn)的必然趨勢(shì)，為此我們開展了雪茄煙優(yōu)勢(shì)菌株的選育，從中篩選出1 株具有降解淀粉和蛋白質(zhì)的優(yōu)勢(shì)菌株ZLX10，并進(jìn)行菌株的鑒定和培養(yǎng)條件優(yōu)化，為規(guī)?；臃N發(fā)酵雪茄煙葉提供應(yīng)用基礎(chǔ)?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】實(shí)現(xiàn)人工接菌規(guī)?；l(fā)酵雪茄煙葉，需先大量制備菌種，提前優(yōu)化優(yōu)勢(shì)菌株生長(zhǎng)條件，尤其是培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株為本課題組從成品雪茄煙支中篩選的一株對(duì)淀粉和蛋白質(zhì)具有顯著降解效果的優(yōu)勢(shì)菌ZLX10。采用牛肉膏蛋白胨固體和液體培養(yǎng)基（牛肉膏5 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L、固體瓊脂20 g/L、蒸餾水 1 000 mL、pH 7.0）活化和擴(kuò)大培養(yǎng)菌種。試驗(yàn)于2022 年4 月在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物農(nóng)藥國(guó)家工程研究中心完成。細(xì)菌鑒定試劑盒由青島海博生物有限公司生產(chǎn)，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)化學(xué)純。

1.2 菌株培養(yǎng)

將優(yōu)勢(shì)菌株ZLX10 保存在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基平板上，挑取單菌落，以牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基進(jìn)行振蕩培養(yǎng)8～12 h，培養(yǎng)溫度為37 ℃，獲得菌株培養(yǎng)液。

1.3 菌株鑒定

1.3.1 菌株測(cè)序鑒定 將優(yōu)勢(shì)菌ZLX10 的培養(yǎng)液以4 000 r/min 離心5 min，收集菌體，用苯酚氯仿抽提法提取基因組DNA。以提取的基因組DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增引物為細(xì)菌16S rDNA 基因測(cè)序通用引物27F/1492R，引物由北京擎科生物科技有限公司合成，并由該公司完成測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)分析，選擇同源性最高的物種作為鑒定結(jié)果。

1.3.2 菌株生理生化特性測(cè)定 參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》的方法［25-26］，采用青島海博生化試劑盒檢測(cè)菌株的生理生化指標(biāo)，包括耐鹽性、檸檬酸鹽利用、丙酸利用、氧化酶、接觸酶、甲基紅、V-P 測(cè)定、淀粉水解、葡萄糖氧化培養(yǎng)、硝酸還原、明膠液化、吲哚試驗(yàn)和產(chǎn)H2S 試驗(yàn)，具體測(cè)定方法參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4 菌株培養(yǎng)條件優(yōu)化

1.4.1 培養(yǎng)基成分的種類篩選 以液態(tài)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，對(duì)培養(yǎng)基中原有成分碳源（葡萄糖、牛肉膏、蔗糖、麥芽糖、甘油、可溶性淀粉、乳糖和木糖）［27-28］、氮源（有機(jī)氮源大豆蛋白胨、酵母提取物、蛋白胨、尿素和無(wú)機(jī)氮源硫酸銨、硝酸鉀）［29-30］和無(wú)機(jī)鹽（硫酸鎂、硫酸亞鐵、磷酸氫二鉀、硝酸鉀、磷酸二氫鉀、氯化鈉、碳酸鈣、硫酸銨）的濃度分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)，分析其對(duì)菌株生物量的影響。碳源和氮源的添加濃度均為15 g/L，無(wú)機(jī)鹽的添加濃度為1.5 g/L，以37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)24 h 后測(cè)定培養(yǎng)液的OD600值。

1.4.2 培養(yǎng)基成分的濃度篩選 確定最佳碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽的種類后，分別比較其不同濃度對(duì)菌株生物量的影響。碳源、氮源濃度梯度均為5、10、15、20、25、30、35、40 g/L，無(wú)機(jī)鹽的濃度設(shè)0.05～1.25 g/L 共7 個(gè)梯度，以37 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h 后測(cè)定培養(yǎng)液的OD600值。

1.4.3 培養(yǎng)基優(yōu)化 根據(jù)以上培養(yǎng)基的成分和濃度優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果，選擇氮源、碳源和無(wú)機(jī)鹽開展3 因素3 水平的正交試驗(yàn)［L9(34)］，優(yōu)化篩選出最優(yōu)培養(yǎng)基配方［31-32］。

1.4.4 培養(yǎng)條件優(yōu)化 菌株ZLX10選擇裝液量（每250 mL 裝30、50、70 mL）、接種量（1%、2%、5%，V/V）、種齡（12、18、24 h）進(jìn)行3 因素3 水平正交試驗(yàn)（L9(34)）優(yōu)化［31,33］，篩選最優(yōu)培養(yǎng)條件。

1.4.5 培養(yǎng)條件驗(yàn)證 菌株ZLX10 以優(yōu)化前的培養(yǎng)條件和優(yōu)化后的最佳培養(yǎng)條件進(jìn)行接種培養(yǎng)，將培養(yǎng)液稀釋成系列濃度，涂布計(jì)數(shù)，對(duì)比優(yōu)化前后培養(yǎng)液中的活菌數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)整理和圖表制作使用Excel 2009、GraphPad Prism7.0 進(jìn)行分析與繪制。所有試驗(yàn)均3 次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZLX10 菌株的鑒定

對(duì)從雪茄煙支中篩選出的優(yōu)勢(shì)菌株ZLX10的16S rDNA 進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，顯示菌株ZLX10 與莫海威芽孢桿菌Bacillus mojavensis（MT043920.1）的序列同源性達(dá)到99.86%，據(jù)此初步確定優(yōu)勢(shì)菌株ZLX10 為芽孢桿菌。進(jìn)一步分析其芽孢桿菌生理生化特性，由表1 可知，菌株ZLX10 耐鹽，能利用檸檬酸鹽作為唯一碳源，不含丙酮酸脫羧酶，葡萄糖氧化發(fā)酵為氧化型；該菌株的淀粉水解和明膠液化均為陽(yáng)性，表明該菌株具有較強(qiáng)的多糖和蛋白大分子降解能力；此外，該菌株的丙酸利用、氧化酶、接觸酶、吲哚試驗(yàn)等均為陰性。綜合可知，優(yōu)勢(shì)菌株ZLX10 為莫海威芽孢桿菌Bacillus mojavensis（MT043920.1）。

表1 菌株ZLX10 的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain ZLX10

2.2 培養(yǎng)基對(duì)菌株ZLX10 生長(zhǎng)的影響

2.2.1 不同碳源對(duì)菌株ZLX10 生長(zhǎng)的影響 以牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別選擇葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘油、可溶性淀粉和乳糖作為碳源，添加量均為15 g/L，無(wú)機(jī)鹽和氮源保持不變，進(jìn)行液體振蕩培養(yǎng)。由圖1A 可知，不同種類的碳源對(duì)ZLX10 的生長(zhǎng)有顯著影響；菌株ZLX10 由蔗糖培養(yǎng)的培養(yǎng)液吸光度最大、為6.425，比葡萄糖培養(yǎng)液高45.88%，比麥芽糖培養(yǎng)液高47.59%，比甘油培養(yǎng)液高43.7%，比乳糖培養(yǎng)液高77.29%，并與其他種類差異顯著，為最佳碳源。

進(jìn)一步選擇不同濃度的蔗糖培養(yǎng)菌株ZLX10，結(jié)果（圖1B）顯示隨著蔗糖濃度升高，菌株ZLX10 培養(yǎng)液的吸光度也隨之升高；當(dāng)蔗糖添加量為60 g/L 時(shí)，菌株ZLX10 培養(yǎng)液的吸光度達(dá)到最大、為10.672，并與其他濃度處理之間有顯著差異，因此蔗糖的最佳濃度為60 g/L。

圖1 不同碳源（A）和不同濃度蔗糖（B）培養(yǎng)的菌株ZLX10 生物量Fig.1 Biomass of strain ZLX10 cultured by different carbon sources (A) and sucrose concentrations (B)

2.2.2 不同氮源對(duì)菌株ZLX10 生長(zhǎng)的影響 以牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，選取4 種有機(jī)氮源和兩種無(wú)機(jī)氮源培養(yǎng)24 h，結(jié)果如圖2A 所示。將酵母提取物作為氮源時(shí)，菌株ZLX10 培養(yǎng)液的吸光度最大、達(dá)到9.873，與其他氮源間存在顯著差異；尿素、硫酸銨和硝酸鉀分別作為氮源時(shí)，幾乎沒有吸光度；大豆蛋白胨的吸光度高于蛋白胨的吸光度，因此最佳氮源選擇酵母提取物。以不同濃度的酵母提取物培養(yǎng)菌株ZLX10，結(jié)果如圖2B 所示。隨著酵母提取物濃度上升，培養(yǎng)液的吸光度逐漸升高；當(dāng)酵母提取物添加量升至15 g/L 時(shí)，培養(yǎng)液的吸光度最大、達(dá)到10.067，與除20 g/L 濃度外的吸光值差異顯著；繼續(xù)提高酵母提取物的濃度，培養(yǎng)液的吸光度呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。確定酵母提取物的最佳濃度為15 g/L。

圖2 不同氮源（A）和不同濃度酵母提取物（B）培養(yǎng)的菌株ZLX10 生物量Fig.2 Biomass of strain ZLX10 cultured by different nitrogen sources (A) and yeast extract concentrations (B)

2.2.3 不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌株ZLX10 生長(zhǎng)的影響 以牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別選取NaCl、KH2PO4、FeSO4·7H2O、MgSO4、CaCO3作為無(wú)機(jī)鹽，氮源和碳源的處理相同，液體培養(yǎng)24 h 后測(cè)定OD600，結(jié)果如圖3A 所示。FeSO4·7H2O和MgSO4的吸光值相近，差異不顯著，但顯著高于其他無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)的吸光值。FeSO4·7H2O 在培養(yǎng)基配制過(guò)程中溶解度較低，易生成沉淀，不利于微生物生長(zhǎng)利用。多次試驗(yàn)比較顯示，F(xiàn)eSO4·7H2O 的OD 值低于MgSO4的，為此選擇MgSO4作為最適無(wú)機(jī)鹽。進(jìn)一步優(yōu)化MgSO4的添加量，在預(yù)試驗(yàn)中增加MgSO4添加量，發(fā)現(xiàn)均不利于菌株ZLX10 生長(zhǎng)，而降低添加量卻有利于菌株ZLX10 生長(zhǎng)，故在0.05～1.25 g/L 濃度區(qū)間設(shè)7個(gè)添加量梯度。結(jié)果（圖3B）顯示，隨著MgSO4添加濃度的增加，菌株ZLX10 培養(yǎng)液的生物量整體呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢(shì)；當(dāng)濃度為0.25 g/L 時(shí)，菌株ZLX10 培養(yǎng)液的生物量最高，且明顯高于其他濃度，確定MgSO4的最優(yōu)濃度為0.25 g/L。

圖3 不同無(wú)機(jī)鹽（A）和不同濃度硫酸鎂（B）培養(yǎng)的菌株ZLX10 生物量Fig.3 Biomass of strain ZLX10 cultured by different inorganic salts (A) and MgSO4 concentrations (B)

2.2.4 碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌株ZLX10 生長(zhǎng)的影響 根據(jù)以上培養(yǎng)基的成分和濃度優(yōu)化的試驗(yàn)結(jié)果，選擇蔗糖（50、60、70 g/L）、酵母提取物（10、15、20 g/L）、MgSO4（0.20、0.25、0.30 g/L），開展3 因素3 水平的正交試驗(yàn)［L9(34)］，選出菌株ZLX10 培養(yǎng)基最優(yōu)配比。由表2 可知，各因素對(duì)生物量大小的影響為酵母提取物＞MgSO4＞蔗糖。其中最優(yōu)組合為A1B3C2，即菌株ZLX10 的最優(yōu)培養(yǎng)基配方為：蔗糖50 g/L、酵母提取物20 g/L、MgSO40.25 g/L。

表2 菌株ZLX10 培養(yǎng)基主要因素正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal test results of main factors in culture medium of strain ZLX10

2.3 不同培養(yǎng)條件對(duì)菌株ZLX10 生長(zhǎng)的影響

對(duì)菌株ZLX10 開展種齡、接種量和裝液量的3 因素3 水平正交試驗(yàn)［L9(34)］，試驗(yàn)結(jié)果如表3 所示。由表3 極差分析可知，各因素對(duì)生物量大小的影響為裝液量＞種齡＞接種量，其中最優(yōu)組合為A3B1C1，即菌株ZLX10 的最優(yōu)培養(yǎng)條件為接種量1%（V/V）、裝液量30 mL、種齡24 h。

表3 菌株ZLX10 培養(yǎng)條件主要因素正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Orthogonal test results of main factors under culture conditions of strain ZLX10

2.4 最佳培養(yǎng)條件對(duì)菌株ZLX10 生長(zhǎng)的影響

綜合以上對(duì)菌株ZLX10 最適培養(yǎng)基配比和最適培養(yǎng)條件的研究結(jié)果，確定優(yōu)化后的菌株ZLX10 培養(yǎng)基為：蔗糖 50 g/L、酵母提取20g/L、MgSO40.25 g/L，培養(yǎng)條件為：接種量1%（V/V）、裝液量30 mL、種齡24 h。將菌株ZLX10 在優(yōu)化后的最佳培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24 h 后，生物量是優(yōu)化前的1.98 倍。

3 討論

3.1 莫海威芽孢桿菌的廣泛應(yīng)用

從雪茄煙支中分離出的優(yōu)勢(shì)菌株經(jīng)鑒定為莫海威芽孢桿菌，之前未見報(bào)道，但在其他方面報(bào)道較多。吳寧［33］從工業(yè)大麻籽內(nèi)生菌中篩選出產(chǎn)很強(qiáng)果膠酶活性的莫海威芽孢桿菌；李曉梅［34］從山西老陳醋發(fā)酵過(guò)程中篩選出多株產(chǎn)酯、多酚、乙偶姻、酸均較高的莫海威芽孢桿菌優(yōu)良菌株。還有研究從棉花秸稈中分離到可以降解棉酚的莫海威芽孢桿菌，對(duì)棉籽油具有一定的脫毒作用［35］。劉丹彤等［36］在醋醅模擬培養(yǎng)基中添加莫海威芽孢桿菌川芎嗪生成量顯著提高。莫海威芽孢桿菌可以產(chǎn)生抑菌成分，可以拮抗金黃色葡萄球菌［37］。還有研究指出，從醉馬草（Achnatherum inebrians）［38］、矮生嵩草（Kobresia humilis）［39］等內(nèi)生菌中分離鑒定的莫海威芽孢桿菌，對(duì)馬鈴薯的炭疽病菌、壞疽病菌、枯萎病菌均有較好拮抗作用［40］，可以作為生防菌。湯茜等［41］從土壤中篩選到的1 株具有良好降解氯蟲苯甲酰胺能力的莫海威芽孢桿菌。侯寧等［42-43］從受石油污染的土壤中選育出1 株具有較強(qiáng)破乳能力的莫海威芽孢桿菌，其24 h 破乳率大于83%。有報(bào)道指出，莫海威芽孢桿菌是引起鐵皮石斛組培苗污染的內(nèi)生細(xì)菌［44］。由此可見，不同來(lái)源的莫海威芽孢桿菌具有不同的功能特性，來(lái)源于雪茄煙中的莫海威芽孢桿菌也可以用于發(fā)酵雪茄煙葉。

3.2 莫海威芽孢桿菌的生長(zhǎng)條件

能夠作為微生物碳源的物質(zhì)很多，對(duì)于大多數(shù)微生物來(lái)說(shuō)糖類是最好的碳源。有機(jī)氮源可提供菌株對(duì)各種生長(zhǎng)因子的需求，酵母提取物是公認(rèn)的優(yōu)良有機(jī)氮源［33］。微生物生長(zhǎng)繁殖和代謝產(chǎn)物的合成都需要無(wú)機(jī)鹽，不同無(wú)機(jī)離子對(duì)不同菌株生長(zhǎng)產(chǎn)生不同影響［31］，不同來(lái)源的莫海威芽孢桿菌對(duì)生長(zhǎng)條件要求一定差異存在。莫海威芽孢桿菌ZA1 的最佳培養(yǎng)基配比為氯化銨14.25 g、玉米粉19 g、馬鈴薯237 g、水1 000 mL、pH7.7，最佳增殖培養(yǎng)溫度為28 ℃、轉(zhuǎn)速為180 r/min、發(fā)酵時(shí)間為36 h，優(yōu)化后的活菌數(shù)為4.12×1010CFU/mL［45-46］。也有報(bào)道指出，生防菌莫海威芽孢桿菌ZA1 分泌抑菌物質(zhì)的最佳培養(yǎng)基為馬鈴薯200 g、蛋白胨10 g、蔗糖20 g、水l 000 mL、pH6.9，最佳培養(yǎng)溫度為17.8 ℃，裝液量為20 mL/150 mL 三角瓶，培養(yǎng)方式為暗處理振動(dòng)培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為96 h［47］。莫海威芽孢桿菌J7 產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的最適發(fā)酵培養(yǎng)基為L(zhǎng)andy 培養(yǎng)基，其中蔗糖和酵母浸粉分別為最適碳源和氮源，30 ℃、36 h 培養(yǎng)、培養(yǎng)基初始pH 7.0、接種量6%為最適發(fā)酵條件［48］；其中蔗糖添加量、酵母浸粉添加量和發(fā)酵溫度是影響莫海威芽孢桿菌J7 抑菌物質(zhì)產(chǎn)生的3 個(gè)主要因素；經(jīng)過(guò)優(yōu)化后的蔗糖添加量為16.9 g/L，酵母浸粉添加量為6.6 g/L，發(fā)酵溫度為29.7 ℃，其他成分不變，優(yōu)化后等量培養(yǎng)基內(nèi)的抑菌物質(zhì)產(chǎn)量提高了38.89%。莫海威芽孢桿菌作為破乳菌體生長(zhǎng)的最佳發(fā)酵條件為培養(yǎng)溫度25 ℃、搖床轉(zhuǎn)速160 r/min、pH 9、接菌量10%、培養(yǎng)時(shí)間40 h［49］。由此可見，培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件對(duì)莫海威芽孢桿菌的生長(zhǎng)有明顯影響，因此對(duì)來(lái)源于雪茄煙中莫海威芽孢桿菌進(jìn)行生長(zhǎng)條件優(yōu)化具有必要性。

4 結(jié)論

經(jīng)16S rDNA 測(cè)序和生理生化鑒定，從雪茄煙支中分離的菌株ZLX10 為莫海威芽孢桿菌。碳氮源為微生物生長(zhǎng)代謝過(guò)程中必不可少的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，選擇適合菌株生長(zhǎng)的培養(yǎng)基對(duì)于菌株生物量的提升有重要意義。本研究對(duì)菌株ZLX10 的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，研究了不同碳氮源種類、不同碳氮源濃度和重要無(wú)機(jī)鹽濃度，以及裝液量、接種量和種齡對(duì)菌株ZLX10 液態(tài)培養(yǎng)生物量的影響，結(jié)合單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)得到更佳的菌株培養(yǎng)工藝。菌株ZLX10 培養(yǎng)基配方為：蔗糖 50 g/L、酵母提取物20 g/L、MgSO40.25 g/L；培養(yǎng)條件為：接種量1%（V/V）、裝液量250 mL中裝30 mL、種齡24 h。菌株ZLX10 在優(yōu)化后的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24 h 后，生物量是優(yōu)化前的1.98倍。研究結(jié)果為大規(guī)模培養(yǎng)菌株實(shí)現(xiàn)人工接種發(fā)酵雪茄煙葉提供了應(yīng)用基礎(chǔ)。